一種提高淡水貝類背角無齒蚌鉤介幼蟲存活率的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高淡水貝類背角無齒蚌鉤介幼蟲存活率的方法，屬于生物監(jiān)測(cè)環(huán)境【技術(shù)領(lǐng)域】。其步驟包括：（1）背角無齒蚌鉤介幼蟲的獲??；（2）背角無齒蚌鉤介幼蟲培養(yǎng)的存活檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的獲取；（3）背角無齒蚌鉤介幼蟲受銅脅迫和添加鈣離子提高其存活率的對(duì)比驗(yàn)證。本發(fā)明以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液濃度組24小時(shí)成活率大于90%、銅+鈣濃度組存活率大于銅濃度組存活率10%以上為有效依據(jù)，不僅提供了一種保證背角無齒蚌鉤介幼蟲正常情況下24小時(shí)存活率大于90%的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液，還找到了減輕背角無齒蚌鉤介幼蟲受銅脅迫，提高其生存率的有效方法，為下一步開展淡水生物指示貝種-背角無齒蚌稚蚌、幼蚌等毒理學(xué)研究和其它淡水貝類的幼體保護(hù)提供了有力支持。
【專利說明】一種提高淡水貝類背角無齒蚌鉤介幼蟲存活率的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲成活率的方法，具體地說就是運(yùn)用一系列調(diào)節(jié)水化學(xué)指標(biāo)的方式，最大限度減小環(huán)境中影響淡水生物指示貝種-背角無齒蛘C4/70￡/0/7ia鉤介幼蟲成活率低的不利因素,提高其成活率,為下一步開展淡水生物指示貝種-背角無齒蛘稚蛘、幼蛘等毒理學(xué)研究提供有力支持，屬于生物監(jiān)測(cè)環(huán)境【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來我國內(nèi)陸漁業(yè)水域重金屬污染現(xiàn)象日趨明顯，防治重金屬污染是我國加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)的重點(diǎn)任務(wù)之一。2011年《中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》指出我國長(zhǎng)江、黃河中下游部分漁業(yè)水域Cu的超標(biāo)較為嚴(yán)重，最高值已超過漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(0.01 mg/L)的8倍，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)生物特別是其幼體階段的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，淡水貝類是水質(zhì)優(yōu)劣的靈敏指示物，尤其是鉤介幼蟲、稚蛘等早期生活史階段對(duì)Cu的毒害極為敏感，其對(duì)銅的耐受性甚至低于國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，在自然水域的鉤介幼蟲受Cu污染致死的危險(xiǎn)充分存在。針對(duì)自然水域貝類種群數(shù)量日趨減少的趨勢(shì)，特別是鉤介幼蟲階段對(duì)環(huán)境污染敏感度較高，死亡率較大的現(xiàn)狀，希望通過調(diào)節(jié)水化學(xué)指標(biāo)的方式，開發(fā)出一種提高淡水貝類鉤介幼蟲存活率的方法，在最大可能保護(hù)鉤介幼蟲生存的同時(shí)，了解淡水貝類早期生活史階段個(gè)體在污染監(jiān)測(cè)和預(yù)警方面應(yīng)用的價(jià)值，為今后的毒理學(xué)研究提供參考。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種提高背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，通過調(diào)節(jié)其生活水環(huán)境中關(guān)鍵理化指標(biāo)的含量，克服鉤介幼蟲對(duì)環(huán)境變化和污染物的低耐受性，保護(hù)鉤介幼蟲的生存，為后續(xù)的稚蛘、幼蛘等的毒理學(xué)研究和其它淡水貝類幼蛘的生存保護(hù)提供借鑒和參考。
[0004]按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，包括以下步驟:
(1)背角無齒蛘鉤介幼蟲的獲取:
選取鉤介幼蟲發(fā)育成熟的背角無齒蛘母蛘2只，分別放入質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水培養(yǎng)溶液中暫養(yǎng)4-6小時(shí)；在此過程中，室內(nèi)溫度保持在20-25°C ；
用吸滿加有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水溶液注射器插入背角無齒蛘母蛘外鰓，緩慢沖洗蛘的外鰓；用加有150mL質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水溶液的玻璃培養(yǎng)皿收集沖洗流出的鉤介幼蟲，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，靜置0.5h后檢查鉤介幼蟲Oh的成活率，保證成活率高于90% ；
(2)背角無齒蛘鉤介幼蟲培養(yǎng)的存活檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的獲取:
將步驟(I)所得的鉤介幼蟲在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25°C，光照條件模擬自然光；采用裝有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水、每個(gè)濃度梯度三個(gè)平行、每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿加有150mL的培養(yǎng)液，其濃度梯度按2倍遞增并用2mm直徑塑料吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲進(jìn)行培養(yǎng)，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，培養(yǎng)24小時(shí)后檢查成活率，成活率大于90 %的濃度組確認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液；
以上述步驟(2)確定的成活率比值大于90%的濃度組溶液為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液，用步驟(O的方法獲取所需的鉤介幼蟲并置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液中待用；
(3)背角無齒蛘鉤介幼蟲受銅脅迫和添加鈣離子提高其存活率的對(duì)比:
以質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置1-3組150mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液中添有0.02-0.08 mg/L銅濃度梯度溶液，再另外配置1_5組150mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液中同時(shí)添有0.02-0.08 mg/L銅濃度梯度，和15-170 mg/L鈣離子濃度梯度的對(duì)比溶液，以及設(shè)置一個(gè)僅配有150 mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液的正常組；所述濃度梯度按2倍遞增；每個(gè)濃度梯度均有三個(gè)平行、每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿加有用吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲，以步驟(2)的光照條件進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)；
培養(yǎng)24小時(shí)后用步驟(I)的方法檢查成活率，先檢查正常組，再檢查銅濃度組和銅+鈣濃度組，以驗(yàn)證加鈣后對(duì)減弱銅脅迫，提高存活率的有效性，以此確定最佳的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液中添加的銅離子和鈣離子的量。
[0005]步驟(I)中鉤介幼蟲發(fā)育成熟的背角無齒蛘母蛘指的是外鰓成黃褐色的健康的3-4齡、殼長(zhǎng)90_110mm的背角無齒蛘母蛘。
[0006]步驟(I)所述去離子水培養(yǎng)溶液中含有0-0.01%人工海水鹽，具體如下:去離子水中離子濃度背景值為 Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L,在其中加入0-0.1 g人工海水鹽。
[0007]步驟(I)和(2)中檢測(cè)鉤介幼蟲成活率的方法:用2mm直徑塑料吸管吸取90-110只鉤介幼蟲放入盛有20mL加有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水的培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下記錄鉤介幼蟲的總數(shù)和閉殼的數(shù)量，然后加一滴NaCl飽和溶液，并在I min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量；加入NaCl飽和溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體。
[0008]步驟(2)和步驟(3)中的光照條件模擬自然光，即16小時(shí)600 Lux白熾燈、8小時(shí)暗室培養(yǎng)。
[0009]步驟(2)中所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液為質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液。
[0010]步驟(3)所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液為質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液中添加 15-170 mg/L I丐離子、0.02-0.08 mg/L 銅離子。
[0011]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首先提出了標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用水的概念，添加一定濃度的人工海水鹽于去離子水中，同時(shí)保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，不僅能保證鉤介幼蟲24小時(shí)90%以上的存活率，更能有效保證毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行；針對(duì)部分漁業(yè)水域Cu嚴(yán)重超標(biāo)的現(xiàn)狀，用增加水中鈣離子濃度的簡(jiǎn)單方式保護(hù)鉤介幼蟲的生存，可操作性強(qiáng)，不僅為進(jìn)一步開展淡水生物指示貝種-背角無齒蛘稚蛘、幼蛘等的保護(hù)和毒理學(xué)研究提供有力支持，亦為其它淡水貝類幼體的生存保護(hù)提供借鑒。

【具體實(shí)施方式】
[0012]以下實(shí)施例中的人工海水鹽商品名SEALIFE，由日本Marinetech有限公司生產(chǎn)；所述光照培養(yǎng)箱為PGX-350A型光照培養(yǎng)箱，由中國無錫的沃信儀器有限公司提供。
[0013]下面本發(fā)明將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例1
根據(jù)本發(fā)明提供的“一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法”，優(yōu)選鉤介幼蟲24小時(shí)存活率90%以上的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液，步驟如下:
1、背角無齒蛘鉤介幼蟲的實(shí)驗(yàn)室獲取
選取鉤介幼蟲發(fā)育成熟即外觸成黃褐色的健康的3-4齡、殼長(zhǎng)90-1 1mm的背角無齒蛘母蛘2只，帶回實(shí)驗(yàn)室分別放入O和0.01 %鹽度即I L去離子水(各主要離子濃度背景值為 Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有 0 和 0.Ig人工海水鹽(商品名:SEALIFE，日本Marinetech有限公司生產(chǎn))的容器中暫養(yǎng)4-6小時(shí)，室內(nèi)溫度保持在20-25° C。用吸滿加有O和0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水注射器插入蛘外鰓，緩慢沖洗蛘的外鰓。用加有150 mL O和0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的玻璃培養(yǎng)皿收集沖洗流出的鉤介幼蟲，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，靜置0.5 h后檢查鉤介幼蟲O h的成活率。
[0014]檢測(cè)成活率的方法:用2 mm直徑塑料吸管吸取90-110只鉤介幼蟲放入盛有20 ml加有O和0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下記錄鉤介幼蟲的總數(shù)和閉殼的數(shù)量，然后加一滴NaCl飽和溶液，并在I min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量。加入NaCl溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體；O h時(shí)O和0.01 %鹽度組的成活率分別為96% 和 97%。
[0015]2、背角無齒蛘鉤介幼蟲實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的存活檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的獲取
通過步驟(I)于玻璃培養(yǎng)皿收集的成活率大于90%的鉤介幼蟲方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)在PGX-350A型光照培養(yǎng)箱(沃信儀器有限公司，中國無錫)中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為:250C，24小時(shí)光照條件模擬自然光，即16小時(shí)600 Lux白熾燈、8小時(shí)暗室培養(yǎng)，共設(shè)計(jì)裝有O和0.01%兩個(gè)對(duì)比濃度梯度人工海水鹽的去離子水、每個(gè)濃度梯度三個(gè)平行、每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿加有150 mL實(shí)驗(yàn)溶液并用2mm直徑塑料吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲進(jìn)行培養(yǎng)，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，培養(yǎng)24小時(shí)后用步驟(I)的方法檢查成活率。
[0016]培養(yǎng)24小時(shí)后O鹽度組三個(gè)平行的成活率分別為:84.4%，80.9%，72.3%，平均成活率為79.2 % ；0.01 %鹽度組三個(gè)平行的成活率分別為:97.1%，96%，93%，平均成活率為95%。
[0017]說明添加一定濃度的人工海水鹽于去離子水中，同時(shí)保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，能夠明顯提高背角無齒蛘鉤介幼蟲的成活率。
[0018]實(shí)施例2
根據(jù)本發(fā)明提供的“一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法”，利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液進(jìn)行鉤介幼蟲受銅脅迫和添加固定濃度鈣離子提高其存活率的對(duì)比驗(yàn)證，步驟如下:
1、背角無齒蛘鉤介幼蟲的實(shí)驗(yàn)室獲取
選取鉤介幼蟲發(fā)育成熟即外觸成黃褐色的健康的3-4齡、殼長(zhǎng)90-1 1mm的背角無齒蛘母蛘I只，帶回實(shí)驗(yàn)室放入0.0l %鹽度即I L去離子水(各主要離子濃度背景值為Cu:0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有 0.I g 人工海水鹽(商品名:SEALIFE，日本Marinetech有限公司生產(chǎn))的容器中暫養(yǎng)4-6小時(shí)，室內(nèi)溫度保持在20-25° C。用吸滿加有0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水注射器插入蛘外鰓，緩慢沖洗蛘的外鰓。用加有150 mL 0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的玻璃培養(yǎng)皿收集沖洗流出的鉤介幼蟲，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，靜置0.5 h后檢查鉤介幼蟲O h的成活率。
[0019]檢測(cè)成活率的方法:用2 mm直徑塑料吸管吸取90-110只鉤介幼蟲放入盛有20ml加有0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下記錄鉤介幼蟲的總數(shù)和閉殼的數(shù)量，然后加一滴NaCl飽和溶液，并在I min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量。加入NaCl溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體。O h時(shí)的成活率為96%。
[0020]2、背角無齒蛘鉤介幼蟲受銅脅迫和添加固定濃度鈣離子提高其存活率的對(duì)比驗(yàn)證
按照銅濃度梯度為0.02，0.04和0.08mg/L,銅+鈣濃度梯度為0.02+170，0.04+170和
0.08 +170 mg/L于玻璃培養(yǎng)皿中配置150 ml溶液，溶液組成為銅(銅+鈣)+標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液(去離子水+ 0.01 %人工海水鹽)，再配置一個(gè)僅裝有150 ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的正常組，每個(gè)濃度梯度均有三個(gè)平行，每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中吸入用2 mm直徑塑料吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲，放入PGX-350A型光照培養(yǎng)箱(沃信儀器有限公司，中國無錫)中模擬24小時(shí)自然光照條件，即16小時(shí)600 Lux白熾燈、8小時(shí)暗室進(jìn)行24小時(shí)對(duì)比培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)為25。。。
[0021]24小時(shí)后用步驟(I)的方法檢查成活率，正常組三個(gè)平行的成活率分別為:96%，96%，95%，平均成活率為96% ；0.02 mg/L銅組三個(gè)平行的成活率分別為:57%，62%，55%，平均成活率為58%，而0.02 mg/L銅+170 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:83%，76%，76%，平均成活率為78%，成活率提高了 20% ；0.04 mg/L銅組三個(gè)平行的成活率分別為:32%，40%，29%，平均成活率為34%，而0.04 mg/L銅+170 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:54%，76%，56%，平均成活率為62%，成活率提高了 28% ； 0.08 mg/L銅組三個(gè)平行的成活率分別為:24%，33%，31%，平均成活率為29%，而0.08 mg/L銅+170 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:54%，39%，54%，平均成活率為49%，成活率提高了 20%。
[0022]說明即使Cu超標(biāo)濃度達(dá)到2011年《中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》報(bào)道的內(nèi)陸重要漁業(yè)水域的最高值，添加一定濃度鈣離子仍然可使背角無齒蛘鉤介幼蟲的存活率平均提
|ρΓ| 20%。
[0023]實(shí)施例3
根據(jù)本發(fā)明提供的“一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法”，利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液進(jìn)行鉤介幼蟲受銅脅迫和添加不同濃度鈣離子提高其存活率的對(duì)比驗(yàn)證，步驟如下:
1、背角無齒蛘鉤介幼蟲的實(shí)驗(yàn)室獲取
選取鉤介幼蟲發(fā)育成熟即外觸成黃褐色的健康的3-4齡、殼長(zhǎng)90-1 1mm的背角無齒蛘母蛘I只，帶回實(shí)驗(yàn)室放入0.01 %鹽度即I L去離子水(各主要離子濃度背景值為Cu:0.0OO mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有 0.1 g 人工海水鹽(商品名:SEALIFE，日本Marinetech有限公司生產(chǎn))的容器中暫養(yǎng)4-6小時(shí)，室內(nèi)溫度保持在20-25° C。用吸滿加有0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水注射器插入蛘外鰓，緩慢沖洗蛘的外鰓。用加有150 mL 0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的玻璃培養(yǎng)皿收集沖洗流出的鉤介幼蟲，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，靜置0.5 h后檢查鉤介幼蟲O h的成活率。
[0024]檢測(cè)成活率的方法:用2 mm直徑塑料吸管吸取90-110只鉤介幼蟲放入盛有20ml加有0.01 %濃度人工海水鹽的去離子水的培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下記錄鉤介幼蟲的總數(shù)和閉殼的數(shù)量，然后加一滴NaCl飽和溶液，并在I min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量。加入NaCl溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體。O h時(shí)的成活率為99%。
[0025]2、背角無齒蛘鉤介幼蟲受銅脅迫和添加固定濃度鈣離子提高其存活率的對(duì)比驗(yàn)證
按照銅濃度為 0.03 mg/L,銅 + 鈣濃度梯度為 0.03+15，0.03+30，0.03+60，0.03 +120mg/L和0.03 +240 mg/L于玻璃培養(yǎng)皿中配置150 ml溶液，溶液組成為銅(銅+鈣)+標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液(去離子水+ 0.01 %人工海水鹽)，再配置一個(gè)僅裝有150 ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的正常組，每個(gè)濃度梯度均有三個(gè)平行，每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中吸入用2 mm直徑塑料吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲，放入PGX-350A型光照培養(yǎng)箱(沃信儀器有限公司，中國無錫)中模擬24小時(shí)自然光照條件，即16小時(shí)600 Lux白熾燈、8小時(shí)暗室進(jìn)行24小時(shí)對(duì)比培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)為25°C。24小時(shí)后用步驟(I)的方法檢查成活率。
[0026]正常組三個(gè)平行的成活率分別為:93%，96%，92%，平均成活率為94% ；0.03 mg/L銅組三個(gè)平行的成活率分別為:72%，69%，58%，平均成活率為66% ;與此相對(duì)照，0.03 mg/L銅+15 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:89%，80%，85%，平均成活率為85%，成活率提高了19% ；0.03 mg/L銅+30 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:80%，75%，78%，平均成活率為78%，成活率提高了 12%; 0.03 mg/L銅+60 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:87%，85%，89%，平均成活率為87%，成活率提高了 21% ；0.03 mg/L銅+120 mg/L鈣組三個(gè)平行的成活率分別為:82%，80%, 92%，平均成活率為85%，成活率提高了 19%。結(jié)合實(shí)例二，說明在Cu超標(biāo)的水體中，添加15-170 mg/L濃度的鈣可以減輕鉤介幼蟲受銅脅迫的強(qiáng)度，明顯提高存活率。
[0027]綜合上述，本發(fā)明不僅提供了一種保證背角無齒蛘鉤介幼蟲正常情況下24小時(shí)存活率大于90%的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液，還找到了減輕背角無齒蛘鉤介幼蟲受銅脅迫，提高其生存率的有效方法，為下一步開展淡水生物指示貝種-背角無齒蛘稚蛘、幼蛘等毒理學(xué)研究和其它淡水貝類的幼體保護(hù)提供了有力支持。
【權(quán)利要求】
1.一種提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是步驟為: (1)背角無齒蛘鉤介幼蟲的獲取: 選取鉤介幼蟲發(fā)育成熟的背角無齒蛘母蛘2只，分別放入質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水培養(yǎng)溶液中暫養(yǎng)4-6小時(shí)；在此過程中，室內(nèi)溫度保持在20-25°C ； 用吸滿加有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水溶液注射器插入背角無齒蛘母蛘外鰓，緩慢沖洗蛘的外鰓；用加有150mL質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水溶液的玻璃培養(yǎng)皿收集沖洗流出的鉤介幼蟲，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，靜置0.5h后檢查鉤介幼蟲Oh的成活率，保證成活率高于90% ； (2)背角無齒蛘鉤介幼蟲培養(yǎng)的存活檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液的獲取: 將步驟(I)所得的鉤介幼蟲在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25°C，光照條件模擬自然光；采用裝有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水、每個(gè)濃度梯度三個(gè)平行、每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿加有150mL的培養(yǎng)液，其濃度梯度按2倍遞增并用2mm直徑塑料吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲進(jìn)行培養(yǎng)，保留鉤介幼蟲周圍的粘性分泌物，培養(yǎng)24小時(shí)后檢查成活率，成活率大于90 %的濃度組確認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液； 以上述步驟(2)確定的成活率比值大于90%的濃度組溶液為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液，用步驟(O的方法獲取所需的鉤介幼蟲并置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液中待用； (3)背角無齒蛘鉤介幼蟲受銅脅迫和添加鈣離子提高其存活率的對(duì)比: 以質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置1-3組150mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液中添有0.02-0.08 mg/L銅濃度梯度溶液，再另外配置1_5組150mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液中同時(shí)添有0.02-0.08 mg/L銅濃度梯度，和15-170 mg/L鈣離子濃度梯度的對(duì)比溶液，以及設(shè)置一個(gè)僅配有150 mL標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溶液的正常組；所述濃度梯度按2倍遞增；每個(gè)濃度梯度均有三個(gè)平行、每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿加有用吸管吸出的900-1100個(gè)鉤介幼蟲，以步驟(2)的光照條件進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)； 培養(yǎng)24小時(shí)后用步驟(I)的方法檢查成活率，先檢查正常組，再檢查銅濃度組和銅+鈣濃度組，以驗(yàn)證加鈣后對(duì)減弱銅脅迫，提高存活率的有效性，以此確定最佳的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液中添加的銅離子和鈣離子的量。
2.如權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(I)中鉤介幼蟲發(fā)育成熟的背角無齒蛘母蛘指的是外鰓成黃褐色的健康的3-4齡、殼長(zhǎng)90-1 1mm的背角無齒蛘母蛘。
3.如權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(I)所述去離子水培養(yǎng)溶液中含有0-0.01%人工海水鹽，具體如下:去離子水中加有0-0.1 g人工海水鹽。
4.如權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(I)和(2)中檢測(cè)鉤介幼蟲成活率的方法:用2mm直徑塑料吸管吸取90-110只鉤介幼蟲放入盛有20mL加有質(zhì)量濃度為0-0.01%人工海水鹽的去離子水的培養(yǎng)皿中，于解剖鏡下記錄鉤介幼蟲的總數(shù)和閉殼的數(shù)量，然后加一滴NaCl飽和溶液，并在I min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量；加入NaCl飽和溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體。
5.如權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(2)和步驟(3)中的光照條件模擬自然光，即16小時(shí)600 Lux白熾燈、8小時(shí)暗室培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(2)中所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液為質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液。
7.權(quán)利要求1所述提高淡水貝類背角無齒蛘鉤介幼蟲存活率的方法，其特征是:步驟(3)所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溶液為質(zhì)量濃度為0.01%的人工海水鹽的去離子水溶液中添加15-170mg/L I丐離子、0.02-0.08 mg/L 銅離子。
【文檔編號(hào)】A01K61/00GK104365519SQ201410711433
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】劉洪波, 楊健, 陳修報(bào), 蘇彥平 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心