阿薩爾基亞芽孢桿菌在防治棉花黃萎病上的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種拮抗菌阿薩爾基亞芽孢桿菌(Bacillus?axarquiensis)對(duì)棉花黃萎病的防治作用，采用瓊脂平板擴(kuò)散法，通過(guò)初篩和復(fù)篩，分離得到一株對(duì)棉花黃萎病菌(Verticillium?dahliae)具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗菌株TUBP1。通過(guò)對(duì)形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S?rDNA和gyrB的基因序列分析，確定該菌株為阿薩爾基亞芽孢桿菌(Bacillus?axarquiensis)；采用生長(zhǎng)速率法和牛津杯法分別測(cè)定了發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌抑菌活性，對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為78.62％±3.48％，抑菌圈直徑為21±3.86mm；溫室盆栽試驗(yàn)中，TUBP1生防效果為42.56％，小區(qū)試驗(yàn)中，TUBP1生防效果為40.16％。離體活體試驗(yàn)證明拮抗菌Bacillus?axarquiensis可用于棉花黃萎病防治的藥物。
【專利說(shuō)明】阿薩爾基亞芽孢桿菌在防治棉花黃萎病上的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及阿薩爾基亞芽孢桿菌在防治棉花黃萎病上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 棉花黃萎?。–otton verticillium wilt)是由大 _ 輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb)引起的一種土傳維管束真菌性病害，也是棉花生產(chǎn)上毀滅性病害之一，嚴(yán)重 影響棉花產(chǎn)量和質(zhì)量。棉花黃萎病菌可以通過(guò)種子、土壤和帶菌病株等多種方式和途徑傳 播，并可以形成微菌核在土壤中存活很多年，防治上非常困難。20世紀(jì)90年代以來(lái)，棉花黃 萎病逐年加重，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，導(dǎo)致每年減產(chǎn)10%?30%。
[0003] 利用生物防治棉花黃萎病備受人們關(guān)注。生物防治無(wú)污染、無(wú)殘留、對(duì)人畜安全 無(wú)毒，且不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，生產(chǎn)工藝較簡(jiǎn)單，有些生防菌還能促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，受 到許多研究者的青睞。拮抗微生物種類有霉菌、放線菌、細(xì)菌，其中研究最多的是芽孢桿菌 (Bacillus spp.)，因?yàn)檠挎邨U菌分布廣泛，繁殖速度快、抗逆能力強(qiáng)。新疆棉田以連作為 主，而對(duì)防治新疆棉花黃萎病的生物殺菌劑非常有限，所以獲得新疆棉花黃萎病菌高效拮 抗菌是前提條件。阿薩爾基亞芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis)是芽孢桿菌的一個(gè)種， 具有繁殖快、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有作為優(yōu)勢(shì)生防細(xì)菌的潛力。
[0004] 據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，目前對(duì)阿薩爾基亞芽孢桿菌研究局限于其分類學(xué)方面，而對(duì)其生物 活性方面未見(jiàn)相關(guān)研究，特別是其對(duì)棉花黃萎病防病作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本課題組通過(guò)對(duì) 南疆地區(qū)連作15年棉花根部土壤中拮抗細(xì)菌的分離、篩選、盆栽試驗(yàn)和小區(qū)試驗(yàn)等，篩選 出一株對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗菌株。本研究通過(guò)形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)手段明確其 分類學(xué)地位，并進(jìn)一步通過(guò)盆栽和小區(qū)試驗(yàn)確定其對(duì)棉花黃萎病防治作用，為開(kāi)發(fā)新疆連 作棉田棉花黃萎病優(yōu)良生防菌劑奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供阿薩爾基亞芽孢桿菌在防治棉花黃萎病中 的用途。在本發(fā)明中，通過(guò)離體、盆栽和小區(qū)試驗(yàn)證實(shí)了阿薩爾基亞芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病 具有很好防治作用。
[0006] 離體試驗(yàn)：采用生長(zhǎng)速率法和牛津杯法檢測(cè)阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液離體對(duì)棉 花黃萎病菌抑制作用，生長(zhǎng)速率法和牛津杯法對(duì)棉花黃萎病菌都有抑制作用，采用生長(zhǎng)速 率法測(cè)阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液離體對(duì)棉花黃萎病菌抑制率為78. 62±3. 48%，牛津杯 法測(cè)阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液離體對(duì)棉花黃萎病菌抑菌圈直徑為21 ±3. 86mm。由離體試 驗(yàn)結(jié)果表明阿薩爾基亞芽孢桿菌對(duì)抗棉花黃萎病菌有抑制作用。
[0007] 盆栽試驗(yàn)：由溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果可知，阿薩爾基亞芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病有一定 生防作用。接種后30?120d對(duì)照組棉花黃萎病病情指數(shù)為10. 87?39. 88,而阿薩爾基 亞芽孢桿菌處理組病情指數(shù)為3. 85?21. 28。表明阿薩爾基亞芽孢桿菌能降低棉花黃萎 病的發(fā)生。接種后30?120d，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌相對(duì)防效為 36. 54%?42. 56%。
[0008] 小區(qū)試驗(yàn)：阿薩爾基亞芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病有一定生防作用。接種后60?140d 對(duì)照組棉花黃萎病病情指數(shù)為13. 87?49. 08,病情指數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，接種后140d病情指數(shù) 達(dá)到最大值為49. 08,而阿薩爾基亞芽孢桿菌處理組病情指數(shù)分別為3. 85?21. 28,阿薩爾 基亞芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病有一定生防效果，其相對(duì)生防值為38. 04%?40. 16%。接種后 130d，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌相對(duì)防效最大為43. 07%。接種后140d， 相對(duì)防效為40. 16%。
[0009] 總之，本發(fā)明阿薩爾基亞芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病菌有拮抗作用，可用于棉花黃萎 病防治。可用阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液浸泡棉花種子或灌于棉花根部。從另一個(gè)角度 看，本發(fā)明還公開(kāi)了一種防治棉花黃萎病的生物農(nóng)藥，其中含有阿薩爾基亞芽孢桿菌或發(fā) 酵液。所以，本發(fā)明還公開(kāi)了阿薩爾基亞芽孢桿菌在制備防治棉花黃萎病的生物農(nóng)藥上的 用途。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明拮抗菌TUBP1的菌體形態(tài)（A :光學(xué)顯微鏡；B :掃描電鏡）。
[0011] 圖2為本發(fā)明基于16S rDNA(A)和gyrB⑶基因序列BLAST結(jié)果構(gòu)建TUBP1系統(tǒng) 發(fā)育樹(shù)。
[0012] 圖3為本發(fā)明Bacillus axarquiensis發(fā)酵液體外抗棉花黃萎病菌活性（A :正面； B :背面；1 :生長(zhǎng)速率法；2 :牛津杯法）。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 :拮抗菌初篩和復(fù)篩
[0014] 棉花黃萎病菌菌液制備：大麗輪枝菌V. dahliae ATCC36211接種含PDA培養(yǎng)基 平板上，25 °C培養(yǎng)15d，平板加入無(wú)菌水，刮取孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為 6X 106孢子· mL'備用。
[0015] 拮抗細(xì)菌的分離和篩選：按常規(guī)分離土壤細(xì)菌方法進(jìn)行。將分離純化的單菌落 接種于NA培養(yǎng)基上，180r · min37°C培養(yǎng)48h，用6mm打孔器制成菌餅。PDA培養(yǎng)基上涂布 200 μ L6X ΚΛιιΓ1棉花黃萎病菌孢子懸浮液，再將分離純化菌株菌餅反接于平板內(nèi)。25°C培 養(yǎng)4d，篩選產(chǎn)生抑菌圈的拮抗細(xì)菌。
[0016] 本實(shí)驗(yàn)從土樣中共分離得到219株菌株，其中健康土壤中127株（占54. 7% )，發(fā) 病土壤中92株（占42. 6% )(表1)，經(jīng)初篩獲得23株產(chǎn)生抑菌圈直徑較大、抑菌能力較強(qiáng) 的菌株。對(duì)初篩菌株進(jìn)行了復(fù)篩，其中抗活性強(qiáng)的有16株菌株：抑菌圈直徑大于10mm的菌 株12株（表2)，其中TUBP1菌株的抑菌圈直徑為21 ±3. 86mm。
[0017] 表1不同部位分離拮抗菌株數(shù)
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 阿薩爾基亞芽孢桿菌在防治棉花黃萎病上的用途。
2. 阿薩爾基亞芽孢桿菌在制備防治棉花黃萎病的生物農(nóng)藥上的用途。
3. -種防治棉花黃萎病的生物農(nóng)藥，其中含有阿薩爾基亞芽孢桿菌。
4. 權(quán)利要求3所述生物農(nóng)藥在防治棉花黃萎病上的用途。
5. -種防治棉花黃萎病的方法，其特征在于，用阿薩爾基亞芽孢桿菌或含有阿薩爾基 亞芽孢桿菌的生物農(nóng)藥浸泡棉花種子或灌于棉花根部。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK104082344SQ201410319014
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】曾紅, 楊生強(qiáng), 高艷紅 申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)