除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，除草劑抗性蛋白質(zhì)包括：（a）具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或（b）在（a）中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有除草劑抗性活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)特別適合在植物中表達(dá)，對除草劑抗性廣，尤其苯氧基生長素除草劑。
【專利說明】除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種對2，4-D具有抗性的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其它目的植物所需要的有價(jià)值的養(yǎng)分。目前有許多類型的除草劑用于控制雜草，一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開發(fā)了對草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麥和水稻等。因此可以對種植草甘膦抗性作物的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害作物。
[0003]草甘膦已經(jīng)在全球廣泛使用超過20年，由此導(dǎo)致對草甘膦和草甘膦耐性作物技術(shù)的過度依賴， 并在野生雜草物種中對草甘膦天然更具耐受性或已經(jīng)發(fā)展出抗草甘膦活性的植物施加了高選擇壓。已報(bào)道有少數(shù)雜草已發(fā)展出對草甘膦的抗性，包括闊葉雜草和禾本科雜草，如瑞士黑麥草、多花黑麥草、牛筋草、豚草、小飛蓬、野塘蒿和長葉車前。此外，在廣泛使用草甘膦耐性作物之前并不是農(nóng)業(yè)問題的雜草也逐漸盛行，并且難于用草甘膦耐性作物控制，這些雜草主要與(但不僅與)難于控制的闊葉雜草一起出現(xiàn)，如莧屬、藜屬、蒲公英屬和鴨跖草科物種。
[0004]在草甘膦抗性雜草或難于控制的雜草物種的地區(qū)，種植者可以通過罐混或換用能控制遺漏雜草的其它除草劑來彌補(bǔ)草甘膦的弱點(diǎn)。在多數(shù)情況下控制闊葉雜草的一種流行且有效的罐混伴侶為2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。2，4-D已經(jīng)在農(nóng)業(yè)和非作物條件下用于廣譜闊葉雜草控制超過65年，仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對進(jìn)一步使用2，4-D的限制在于它在雙子葉植物(如大豆或棉花)中的選擇性非常低，因此2，4-D—般不用于(且一般不靠近)敏感性雙子葉作物。此外，2，4-D在禾本科作物中的用途在某種程度上受限于可能出現(xiàn)的作物損傷的性質(zhì)。2，4-D和草甘膦的組合已經(jīng)用于在種植免耕大豆和棉花之前提供更強(qiáng)的滅生處理，然而，由于這些雙子葉物種對2，4-D的敏感性，這些滅生處理必須在種植前14-30天進(jìn)行。
[0005]和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2，4-D丙酸一樣，2，4-D是苯氧酸類除草劑。2，4-D用于在許多單子葉作物(如玉米、小麥和水稻)中選擇性控制闊葉雜草而不嚴(yán)重?fù)p傷目的作物。2，4-D是合成的植物生長素衍生物，其作用為使正常的細(xì)胞激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，并阻礙平衡的受控生長。
[0006]2，4-D對某些植物具有不同水平的選擇性(如雙子葉植物比禾本科植物更敏感)。不同植物對2，4-D的不同代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2，4-D，因此靶位點(diǎn)的不同活性更可能解釋植物對2，4-D不同的應(yīng)答。2，4-D的植物代謝一般通過兩
步代謝實(shí)現(xiàn)，一般是羥基化后接著與氨基酸或葡萄糖綴合。
[0007]隨著時(shí)間的發(fā)展，微生物種群已經(jīng)發(fā)展出降解此特定外來物的有效的替代途徑，所述途徑引起2，4-D的完全礦化。對微生物連續(xù)應(yīng)用除草劑可用來選擇能利用除草劑作為碳源用于生長(從而使其在土壤中具有競爭優(yōu)勢)的微生物。因?yàn)檫@個原因，目前將2，4-D配制為具有相對短的土壤半衰期，并且對其后的作物沒有遇到明顯的遺留效應(yīng)。這促進(jìn)了2,4-D的除草劑應(yīng)用。
[0008]已經(jīng)廣泛研究了其降解2，4-D能力的一種生物是真養(yǎng)雷氏菌(Ralstoniaeutropha)。編碼礦化途徑中的第一個酶促步驟的基因?yàn)閠fdA。TfdA通過α酮戍二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2，4-D酸轉(zhuǎn)化成二氯苯酚(DCP)。DCP與2，4-D相比幾乎不具有除草劑活性。TfdA在轉(zhuǎn)基因植物中用于向通常對2，4-D敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)中輸入2，4-D抗性。
[0009]已在環(huán)境中鑒定了大量編碼能降解2，4-D的蛋白質(zhì)的tfdA型基因。許多同系物與tfdA類似(氨基酸同一性>85%)并具有與tfdA相似的酶活性。然而，不是所有具有TauD等結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都具有2，4-D降解功能，并且有大量同系物與tfdA具有顯著 更低的同一性(25-50%)，但卻具有與α酮戊二酸依賴性雙加氧酶Fe+2雙加氧酶相關(guān)的特征殘基。因此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什么并不明確。與tfdA具有低同源性(氨基酸同一性28%)的獨(dú)特實(shí)例是來自Sphingobium herbicidovorans的rdpA。已經(jīng)顯示此酶催化(R) -2，4-D丙酸(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2，4-D (苯氧乙酸)礦化的第一步。
[0010]隨著草甘膦抗性雜草的出現(xiàn)和2，4-D除草劑的擴(kuò)大應(yīng)用，需要對2，4-D敏感的目的植物中輸入2，4-D抗性。目前未發(fā)現(xiàn)24DT17除草劑抗性蛋白在植物中的表達(dá)水平和對除草劑的耐受性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，本發(fā)明旨在提供一種新的24DT17基因，所述24DT17蛋白在植物中對除草劑具有較高的耐受性。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種除草劑抗性蛋白質(zhì)，包括:
[0013](a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或
[0014](b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0015]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種除草劑抗性基因，包括:
[0016](a)編碼所述除草劑抗性蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0017](b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0018](c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0019]所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述除草劑抗性基因。
[0021]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒的
重組載體。
[0022]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的方法，包括:
[0023]獲得包含所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；
[0024]在允許產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；[0025]回收所述除草劑抗性蛋白質(zhì)。
[0026]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
[0027]優(yōu)選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0028]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加除草劑靶范圍的方法，包括:將所述除草劑抗性蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述除草劑抗性蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)的第二種核苷酸一起表達(dá)。
[0029]進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸可以編碼草甘膦抗性蛋白質(zhì)、草銨膦抗性蛋白質(zhì)、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、 乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原卟啉原氧化酶。
[0030]在本發(fā)明中，24DT17除草劑抗性蛋白質(zhì)在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個或多個草甘膦抗性蛋白質(zhì)和/或草銨膦抗性蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過一種的除草劑抗性蛋白質(zhì)在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)24DT17除草劑抗性蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)草甘膦抗性蛋白質(zhì)和/或草銨膦抗性蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0031]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，包括:用所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0032]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制雜草的方法，包括:對種植作物的大田施用有效劑量的除草劑，所述作物包含所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體。
[0033]優(yōu)選地，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0034]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，包括:將所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受除草劑損害量的除草劑抗性蛋白質(zhì)。
[0035]優(yōu)選地，所述除草劑為苯氧基生長素或芳氧基苯氧鏈烷酸酯。所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0036]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，包括:對種植草甘膦耐性植物的大田施用有效劑量的除草劑，所述草甘膦耐性植物包含所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體。
[0037]優(yōu)選地，所述除草劑為苯氧基生長素。所述草甘膦耐性植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0038]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，包括:將所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0039]優(yōu)選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0040]將所述的除草劑抗性基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞， 常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0041]本發(fā)明所述的2，4-D抗性基因及其后的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)闊葉雜草物種的優(yōu)良選擇。2，4-D是廣譜、相對便宜且強(qiáng)力的闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉中同樣能提供更強(qiáng)的作物耐受性，則可為種植者提供優(yōu)良的效用。2，4-D耐性轉(zhuǎn)基因雙子葉植物還可在應(yīng)用時(shí)間和用量上具有更高的靈活性。2，4-D除草劑耐性性狀的另一用途是它可用于預(yù)防2，4-D漂移、揮發(fā)、轉(zhuǎn)化(或其它遠(yuǎn)距離的移動現(xiàn)象)、誤用、破壞等對正常敏感性作物的損害。已經(jīng)廣泛使用不同苯氧基生長素組合的多種混合物來處理不同地區(qū)特定的雜草譜和環(huán)境條件。在植物中使用24DT17基因可以提供對更光譜的苯氧基生長素除草劑的防護(hù)， 從而提高靈活性和可控制的雜草譜，提供對全范圍市售苯氧基生長素的漂移或其它遠(yuǎn)距離苯氧基除草劑損傷的防護(hù)。
[0042]對于苯氧基生長素除草劑通常制成活性酸，但也有一些商品化配制為多種相應(yīng)酯制劑之一，由于一般的植物酯酶在植物中將這些酯轉(zhuǎn)換成活性酸，因此這些也同樣認(rèn)為是在植物中24DT17酶的底物。類似的還可以是相應(yīng)酸的相應(yīng)有機(jī)或無機(jī)鹽。當(dāng)表示手性丙酸、丙酸鹽或丙酸酯除草劑時(shí)，即使不同的CAS號可能對應(yīng)于光學(xué)純的化合物，在命名這些除草劑時(shí)仍認(rèn)為外消旋(R，S)或光學(xué)純化的(R或S)對映體是同一除草劑?？赡艿挠昧糠秶梢允亲魑锘蚍亲魑镉猛局袉为?dú)處理或與其他除草劑組合。
[0043]現(xiàn)已鑒定了 24DT17基因在遺傳改造用于植物表達(dá)后具有允許在植物中使用苯氧基生長素除草劑的特性，所述植物中固有耐性不存在或不足以允許使用這些除草劑。此外，24DT17基因可以在天然耐性不足以允許選擇性時(shí)在植物中提供對苯氧基生長素除草劑的防護(hù)?，F(xiàn)在可以連續(xù)或罐混地與一種、兩種或若干苯氧基生長素除草劑的組合處理僅含24DT17基因的植物。用于控制廣譜雙子葉雜草的每種苯氧基生長素除草劑的用量范圍從25至4000g ae/ha,更通常從100至2000g ae/ha。在同一大田里(連續(xù)或罐混組合地)組合這些不同化學(xué)類別和具有不同作用模式和范圍的除草劑可以提供對大多數(shù)需要除草劑控制的潛在雜草的控制。
[0044]草甘膦被廣泛地使用，因?yàn)樗刂品浅V譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在草甘膦耐性作物和非作物應(yīng)用中重復(fù)使用草甘膦已經(jīng)(而且仍將繼續(xù))選擇使雜草演替為天然更具有耐性的物種或草甘膦抗性生物型。多數(shù)除草劑抗性管理策略建議使用有效用量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現(xiàn)抗性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對同一物種的控制，但具有不同的作用模式。將24DT17基因與草甘膦耐性性狀(和/或其他除草劑耐性性狀)疊加可通過允許對同一作物選擇性使用草甘膦和苯氧基生長素(如2，4-D)而實(shí)現(xiàn)對草甘膦耐性作物中草甘膦抗性雜草物種(被一種或多種苯氧基生長素控制的闊葉雜草物種)的控制。這些除草劑的應(yīng)用可以是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時(shí)使用、在連續(xù)使用(如種植前、出苗前或出苗后)中單個除草劑組合物的單獨(dú)使用(使用的間隔時(shí)間范圍從2小時(shí)到3個月)，或者備選地，可以在任何時(shí)間(從種植作物7個月內(nèi)到收獲作物時(shí)(或?qū)τ趩蝹€除草劑為收獲前間隔，取最短者))使用代表可應(yīng)用每種化合類別的任意數(shù)目除草劑的組合。
[0045]在控制闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時(shí)間、單個除草劑用量和控制頑固或抗性雜草的能力。作物中與草甘膦抗性基因/24DT17基因疊加的草甘膦應(yīng)用范圍可以從250至2500g ae/ha ;苯氧基生長素除草劑(一種或多種)可按照從25_4000g ae/ha。這些應(yīng)用的時(shí)間的最佳組合取決于具體的條件、物種和環(huán)境。
[0046]除草劑制劑(如酯、酸或鹽配方或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添加劑(如佐劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。任意前述除草劑的任意化學(xué)組合均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0047]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或天然更具耐性物種或抗性雜草物種上的益處還可擴(kuò)展到通過人工(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)在作物中產(chǎn)生除草甘膦耐性作物外的除草劑耐性的化學(xué)品。事實(shí)上，可以單獨(dú)或以多重組合疊加編碼以下抗性的性狀以提供有效控制或防止雜草演替對任意前述類別的除草劑的抗性的能力:草甘膦抗性(如抗性植物或細(xì)菌EPSPS、GOX、GAT)、草銨膦抗性(如PAT、Bar)、乙 酰乳酸合酶(ALS)抑制性除 草劑抗性(如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其它化學(xué)品抗性基因如AHAS、Csrl, SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、對HPTO (4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶)酶抑制劑的抗性、對八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的抗性、對光系統(tǒng)II抑制性除草劑的抗性(如psbA)、對光系統(tǒng)I抑制性除草劑的抗性、對原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草劑抗性(如PP0-1)、對苯脲除草劑的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0048]關(guān)于其他除草劑，一些其它優(yōu)選的ALS抑制劑包括三唑嘧啶磺苯胺(氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和嘧啶并三唑類磺胺)、嘧啶硫代苯甲酸和氟唑磺隆。一些優(yōu)選的HPro抑制劑包括甲基磺草酮、異惡唑草酮和磺草酮。一些優(yōu)選的PPO抑制劑包括丙炔氟草胺、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草靈和乙氧氟草醚)。
[0049]此外，可以將24DT17基因單獨(dú)或與其它除草劑耐受作物特征疊加后再與一種或多種其它輸入(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐性等)或輸出(如提高的產(chǎn)量、改進(jìn)的油量、提高的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此，本發(fā)明可用于提供以靈活且經(jīng)濟(jì)地控制任何數(shù)目的農(nóng)學(xué)害蟲的能力和提高作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)解決方案。
[0050]本發(fā)明24DT17基因能降解2，4_D，是重要的除草劑耐受作物和選擇標(biāo)記物特征可能性的基礎(chǔ)。
[0051]本發(fā)明可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，可以控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合。24DT17基因可作為優(yōu)秀的除草劑耐受作物性狀與例如其它除草劑耐受作物性狀(如草甘膦抗性、草銨膦抗性、ALS抑制劑(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制劑抗性、PPO抑制劑抗性等)和昆蟲抗性性狀(CrylAb、CrylF、Vip3、其它蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)或非芽孢桿菌屬來源的昆蟲抗性蛋白等)疊加。此外，24DT17基因可作為選擇標(biāo)記物輔助選擇用另一個基因或基因群遺傳改造的植物的原代轉(zhuǎn)化體。
[0052]苯氧基鏈烷酸酯基團(tuán)可用于將穩(wěn)定的酸官能團(tuán)引入除草劑。酸性基團(tuán)可通過“酸捕獲”輸入韌皮部活性(除草劑作用所需的屬性)，從而可以為了活性目的而整合進(jìn)新除草劑。存在很多可能為24DT17底物的市售和實(shí)驗(yàn)性除草劑。因此，使用本發(fā)明基因還可以得到對其它除草劑的耐性。
[0053]本發(fā)明的除草劑耐性作物性狀可用在與其它除草劑耐性作物性狀(包括但不限于草甘膦耐性)的新組合中。由于對除草劑(如草甘膦)的新獲得的抗性或固有的耐性，這些性狀組合產(chǎn)生控制雜草物種的新方法。因此，除了除草劑耐性作物性狀，本發(fā)明的范圍包括使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉(zhuǎn)基因作物中的所述酶產(chǎn)生對所述除草劑的耐性。
[0054]本發(fā)明可應(yīng)用于多種植物中，如擬南芥、煙草、大豆、棉花、稻、玉米和蕓薹。本發(fā)明還可用于多種其它單子葉(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如苜蓿、三葉草、喬木物種等)。類似的，2，4-D (或其它24DT17底物)可更積極地用于耐性適中的禾本科作物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能以更有效的用量和更廣的施用時(shí)間來使用這些除草劑而無作物損傷風(fēng)險(xiǎn)的可能性。
[0055]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0056]本發(fā)明中所述“抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對給定植物進(jìn)行一般除草 劑有效處理的情況下生長和繁殖。 正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認(rèn)為“抗性”。本發(fā)明中術(shù)語“耐性”比術(shù)語“抗性”更廣泛，并包括“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。
[0057]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0058]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0059]本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明除草劑抗性基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明除草劑抗性基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0060]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0 X SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0XSSC、50°C到高度嚴(yán)格條件的約0.2XSSC、50°C。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發(fā)生特異性雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0061]因此，具有除草劑耐受性活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與 本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0062]本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)?！肮δ芑钚浴?或“活性”)在本發(fā)明中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨(dú)或與其它蛋白質(zhì)組合)具有降解或減弱除草劑活性的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平足以給予植物對除草劑(若無特別說明則為一般用量)完全或部分的抗性或耐性。可以以通常殺死靶植物的用量、正常的大田用量和濃度使用除草劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物被保護(hù)免受除草劑處理引起的生長抑制或損傷。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞優(yōu)選具有2，4-D除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞能在有效量的2，4-D除草劑存在下生長。
[0063]本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的除草劑抗性活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有除草劑抗性活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述“等價(jià)蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的除草劑耐受性的生物活性的蛋白。
[0064]本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端的缺失，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為除草劑抗性蛋白質(zhì)。在一些情況下(特別是植物中的表達(dá))，使用編碼截短蛋白質(zhì)的截短基因可能是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0065]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響除草劑抗性活性的序列，亦包括保留除草劑抗性活性的片段。
[0066]本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0067]保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的， 并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0068]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244:1081_1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的除草劑抗性活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899_904 ；fflodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters309:59_64)。
[0069]因此，與序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0070]本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述24DT17基因的調(diào)節(jié)序列。
[0071]所述啟動子為植物中可表達(dá)的啟動子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動子。植物中可表達(dá)的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米u(yù)bi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長條件下有顯 著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。[0072]所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0073]所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
[0074]所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒 (CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。
[0075]對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。
[0076]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0077]本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)、整合酶識別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。
[0078]本發(fā)明可賦予植物新除草劑抗性性狀，并且未觀察到對表型包括產(chǎn)量的不良影響。本發(fā)明中植物能耐受住如至少一種受試除草劑2X、3X、4X或5X —般應(yīng)用水平。這些耐性水平的提高在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如可對本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行可預(yù)見到的優(yōu)化和進(jìn)一步發(fā)展，以增加給定基因的表達(dá)。
[0079]本發(fā)明中，所述除草劑抗性蛋白質(zhì)為24DT17氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:2所示。所述除草劑抗性基因?yàn)?4DT17核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述除草劑抗性基因?yàn)橛糜谥参?，除了包含?4DT17核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予昆蟲抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。
[0080]本發(fā)明中24DT17除草劑抗性蛋白質(zhì)對大多數(shù)苯氧基生長素除草劑具有耐性。本發(fā)明中的植物，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含24DT17核苷酸序列， 通過表達(dá)有效量的該蛋白而保護(hù)其免受除草劑的威脅。有效量是指未損傷的或輕微損傷的劑量。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。
[0081]植物材料中除草劑抗性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼除草劑抗性蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的除草劑抗性蛋白質(zhì)的量。
[0082]本發(fā)明提供了一種除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0083]1、對除草劑抗性強(qiáng)。本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)24DT17對除草劑的抗性強(qiáng)，尤其是針對苯氧基生長素除草劑，特別是2，4-D。
[0084]2、對除草劑抗性廣。本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)24DT17蛋白可以對多種苯氧基植物生長素除草劑表現(xiàn)出較高的抗性，因此在植物上應(yīng)用前景廣闊。
[0085]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]圖1為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有24DT17核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0087]圖2為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有24DT17核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100417構(gòu)建流程圖；
[0088]圖3為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有對照序列的重組表達(dá)載體DBN100417N構(gòu)建流程圖；
[0089]圖4為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1植株除草劑抗性效果圖；
[0090]圖5為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有24DT17核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100760構(gòu)建流程圖；
[0091]圖6為本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有對照序列的重組表達(dá)載體DBN100760N構(gòu)建流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0092]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明除草劑抗性蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的技術(shù)方案。
[0093]第一實(shí)施例、24DT17基因序列的獲得和合成[0094]1、獲得24DT17基因序列
[0095]24DT17除草劑抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列(285個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；依據(jù)植物偏好性密碼子獲得編碼相應(yīng)于所述24DT17除草劑抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列(285個氨基酸)的核苷酸序列(858個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示。
[0096]2、合成上述24DT17核苷酸序列
[0097]所述24DT17核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述24DT17核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的5’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)，所述24DT17核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的3’端還連接有KasI酶切位點(diǎn)。
[0098]第二實(shí)施例、 擬南芥重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0099]1、構(gòu)建含有24DT17核苷酸序列的擬南芥重組克隆載體DBNOl-T
[0100]將合成的24DT17核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子-Mmn為24DT17核苷酸序列(seq id no: O ；mcs為多克隆位點(diǎn))。
[0101]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBNO1-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50禮葡萄糖，？!18.0)懸??；加入20(^1新配制的溶液11 (0.2M NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4V、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0102]提取的質(zhì)粒經(jīng)SpeI和KasI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述24DT17核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即24DT17核苷酸序列正確插入。
[0103]2、構(gòu)建含有24DT17核苷酸序列的擬南芥重組表達(dá)載體DBN100417
[0104]用限制性內(nèi)切酶SpeI和KasI分別酶切重組克隆載體DBNO1-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的24DT17核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的SpeI和KasI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100417，其構(gòu)建流程如圖2所示(Spec:壯觀霉素基因；RB:右邊界；AtUbilO:擬南芥Ubiquitin (泛素)10基因啟動子(SEQ IDno:3) -Mmn -Mmn核苷酸序列(seq id no: O ；nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(seqID N0:4);prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5);PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID N0:6) ;tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:7) ;LB:左邊界)。
[0105]將重組表達(dá)載體DBN100417用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100417)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L壯觀霉素(Spectinomycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，NaC110g/L，壯觀霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SpeI和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100417在SpeI和KasI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即24DT17核苷酸序列。
[0106]3、構(gòu)建含有對照序列的擬南芥重組表達(dá)載體DBN100417N
[0107]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中I所述的構(gòu)建含有24DT17核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用對照序列(SEQ ID N0:8)構(gòu)建含有對照序列的重組克隆載體DBNOlR-T0對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的天然序列為序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即對照序列正確插入。
[0108]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中2所述的構(gòu)建含有24DT17核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100417的方法，利用天然序列構(gòu)建含有天然序列的重組表達(dá)載體DBN100417N，其構(gòu)建流程如圖3所示(載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)；Spec:壯觀霉素基因；RB:右邊界；AtUbilO:擬南芥Ubiquitin (泛素)10基因啟動子(SEQ ID NO:3) ；mN:對照序列(SEQ ID NO:8) ;Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:4) ;prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID N0:5);PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO:6)；tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:7);LB:左邊界)。對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100417N中插入的對照序列為序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即對照序列正確插入。
[0109]4、擬南芥重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0110]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100417和DBN100417N (對照序列)用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，其轉(zhuǎn)化條件為:100μL農(nóng)桿菌GV3101、3μL質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的壯觀霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和BglII酶切DBN100417后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，用限制性內(nèi)切酶StyI和BglI酶切DBN100417N (對照序列)后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100417和DBN100417N (天然序列)結(jié)構(gòu)完全正確。
[0111]第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入24DT17核苷酸序列的擬南芥植株的獲得
[0112]將野生型擬南芥種子懸浮于0.1%瓊脂糖溶液中。將懸浮的種子在4°C下保存2天以完成對休眠的需要以保證種子同步萌發(fā)。用蛭石混合馬糞土并用水地下灌溉至濕潤，使土壤混合物排水24小時(shí)。將預(yù)處理后的種子種在土壤混合物上并用保濕罩覆蓋7天。使種子萌發(fā)并在恒溫(220C )恒濕(40-50%)光強(qiáng)度為120-150 μ mol/m2秒的長日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下在溫室中培養(yǎng)植物。開始用霍格蘭營養(yǎng)液灌溉植物，接著用去離子水灌溉，保持土壤潮濕但不濕透。
[0113]使用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。用選取的農(nóng)桿菌菌落接種一份或多份15_30ml含壯觀霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培養(yǎng)液的預(yù)培養(yǎng)物。以220rpm將培養(yǎng)物在28°C恒速搖動孵育過夜。每個預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩份500ml含壯觀霉素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培養(yǎng)液的培養(yǎng)物并將培養(yǎng)物在28°C持續(xù)搖動孵育過夜。室溫以約8700Xg離心10分鐘沉淀細(xì)胞,棄去 得到的上清液。將細(xì)胞沉淀輕柔重懸于500ml滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng)基含有1/2 XMS鹽/B5維生素、10% (w/v)蔗糖、0.044 μ M芐氨基嘌呤(10 μ I/升(lmg/ml DMSO中的原液))和300 μ I/升Silvet L-77。將約I月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒最新的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，接著用水洗滌并豎直放置。在22°C以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。
[0114]將新收獲的(24DT17核苷酸序列和天然序列)T1種子在室溫干燥7天。將種子種在26.5 X 51cm萌發(fā)盤中，每盤接受ZOOmgT1種子(約10000個種子),所述種子事先已懸浮于40ml0.1%瓊脂糖溶液并在4°C下保存2天以完成對休眠的需要以保證種子同步萌發(fā)。
[0115]用蛭石混合馬糞土并用水地下灌溉至濕潤，利用重力排水。用移液管將預(yù)處理后的種子(每個40ml)均勻地種在土壤混合物上，并用保濕罩覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草銨膦(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因)進(jìn)行最初轉(zhuǎn)化體選擇前I天移去罩。
[0116]在7個種植天數(shù)后(DAP)并于IlDAP再次使用DeVilbiss壓縮空氣噴嘴以IOml/盤(703L/ha)的噴灑體積用Liberty除草劑(200g ai/L的草銨膦)的0.2%溶液噴灑T1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，以提供每次應(yīng)用280g ai/ha有效量的草銨膦。在最后噴灑后4-7天鑒定存活株(生長活躍的植物)，并分別移植到用馬糞土和蛭石制備的7cmX7cm的方盆中(每盤3-5棵)。用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天，并如前置于22°C培養(yǎng)室中或直接移入溫室。接著移去罩并在測試24DT17基因提供苯氧基生長素除草劑抗性的能力之前至少I天將植物栽種到溫室(22±5°C，50±30%RH，14小時(shí)光照:10小時(shí)黑暗，最小500 μ E/Iii2S1天然+補(bǔ)充光)。
[0117]第四實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的除草劑抗性效果檢測
[0118]用24DT17基因進(jìn)行首次擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背景中選擇T1轉(zhuǎn)化體。篩選了約20000個T1種子中并鑒定了 153株T1代陽性轉(zhuǎn)化子(PAT基因)，約0.76%的轉(zhuǎn)化效率。將轉(zhuǎn)入24DT17核苷酸序列的擬南芥T1植株、轉(zhuǎn)入對照序列的擬南芥T1植株和野生型擬南芥植株(播種后18天)分別對2，4-D 二甲銨鹽和二甲四氯進(jìn)行除草劑抗性效果檢測。
[0119]分別將轉(zhuǎn)入24DT17核苷酸序列的擬南芥T1植株、轉(zhuǎn)入對照序列的擬南芥T1植株和野生型擬南芥植株分別用2，4-D 二甲銨鹽(560g ae/ha，l倍大田濃度)、二甲四氯(560gae/ha, I倍大田濃度)和空白溶劑(水)噴灑。噴施7天和14天后統(tǒng)計(jì)植株抗性情況-J天后生長狀況和空白溶劑(水)一致的劃為高抗植株，7天后有蓮座葉卷曲的劃為中抗植株，14天后仍不能抽苔的劃為低抗植株，14天后死亡的劃為不抗植株。由于每株擬南芥T1植株是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計(jì)在給定劑量內(nèi)個體T1應(yīng)答的顯著差異。結(jié)果如表1和圖4所示。
[0120]表1、轉(zhuǎn)基因擬南芥T1植株除草劑抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0121]
【權(quán)利要求】
1.一種除草劑抗性蛋白質(zhì)，其特征在于，包括: (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種除草劑抗性基因，其特征在于，包括: Ca)編碼權(quán)利要求1所述除草劑抗性蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
(c)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.—種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因。
4.一種包含權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的重組載體。
5.一種產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括: 獲得包含權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 在允許產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 回收所述除草劑抗性蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述產(chǎn)生除草劑抗性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
8.一種用于增加除草劑靶范圍的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述除草劑抗性蛋白質(zhì)或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求1所述除草劑抗性蛋白質(zhì)或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)的第二種核苷酸一起表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述用于增加除草劑靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼草甘膦抗性蛋白質(zhì)、草銨膦抗性蛋白質(zhì)、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)或原卟啉原氧化酶。
10.一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括:用權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞，并在允許表達(dá)所述除草劑抗性基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長，而殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的除草劑濃度下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述除草劑為苯氧基生長素。
11.一種控制雜草的方法，其特征在于，包括:對種植作物的大田施用有效劑量的除草劑，所述作物包含權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述控制雜草的方法，其特征在于，所述除草劑為苯氧基生長素。
13.一種用于保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受除草劑損害量的除草劑抗性蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述用于保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，所述除草劑為苯氧基生長素。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述用于保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
16.一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特征在于，包括:對種植草甘膦耐性植物的大田施用有效劑量的除草劑，所述草甘膦耐性植物包含權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特征在于，所述除草劑為苯氧基生長素。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特征在于，所述草甘膦耐性植物為單子葉植物或雙子葉植物。
19.一種賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求2所述除草劑抗性基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，其特征在于，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
【文檔編號】A01G13/00GK103740663SQ201310722003
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】吳業(yè)春, 謝香庭, 李勝兵, 丁德榮, 鮑曉明 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心