一株促進(jìn)沉香屬植物產(chǎn)生沉香的真菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株促進(jìn)沉香屬（Aquilaria）植物產(chǎn)生沉香的真菌及其應(yīng)用。該真菌為擬層孔菌（Fomitopsis?sp.）ASAF01CGMCC?NO.7802。擬層孔菌（Fomitopsis?sp.）ASAF01接種6個(gè)月后即可促進(jìn)白木香結(jié)香且形成的沉香中間不易腐爛。并且該菌株在pH2-11和溫度15-40℃的條件下仍能生長，說明擬層孔菌（Fomitopsis?sp.）ASAF01具有很強(qiáng)的環(huán)境耐受力。
【專利說明】一株促進(jìn)沉香屬植物產(chǎn)生沉香的真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一株促進(jìn)沉香屬植物如白木香產(chǎn)生沉香的真菌及其應(yīng)用，該菌株在PH2-11和溫度15-40°c培養(yǎng)，其菌株、發(fā)酵液、除菌后的濾液、濾液中的活性成分及菌液/濾液濃縮制劑可促進(jìn)沉香屬植物結(jié)香。
【背景技術(shù)】
[0002]沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物含有樹脂的木材，沉香屬植物包含13個(gè)種，最常見的有馬來沉香(Aquilaria malaccensis),越南沉香(Aquilaria crassna)和白木香(Aquilaria sinensis)。白木香是珍貴國產(chǎn)藥材沉香的唯一植物資源，主產(chǎn)于我國的海南、廣東、云南、廣西等地。馬來沉香(A.malaccensis)，越南沉香(A.crassna)主要產(chǎn)于印度尼西亞、馬來西亞、越南、泰國等地。沉香自古以來就已經(jīng)被公認(rèn)為“香中之王”、“藥中黃金”，具行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘之功效。
[0003]沉香的形成非常特殊，健康的白木香不能產(chǎn)生沉香類物質(zhì)，只有受到物理傷害、化學(xué)傷害及真菌侵染等外界的傷害后才誘導(dǎo)結(jié)香。質(zhì)量高的沉香需要幾年甚至幾十年方能形成。由于天然沉香形成的特殊性及結(jié)香周期長，所以結(jié)香技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。
[0004]目前，結(jié)香技術(shù)有砍傷法、斷枝法、半斷干法、打釘法、鑿洞法、燙傷法、火燒法、火烙法、風(fēng)吹法、雷擊創(chuàng)傷發(fā)法、偏心灌注法、高壓注射法、輸液法、瓶插法、真菌接種法、簽插法等。通過以上方法使沉香結(jié)香的促進(jìn)劑有:①PH值1.5-3的甲酸或乙酸或者兩者的混合，進(jìn)一步與真菌注入；②植物激素(茉莉酸甲酯、乙烯利等)和鈉鹽、鐵鹽等輸入白木香木質(zhì)部；③氯化亞鐵5 %，甲酸鈉5 %，乙烯利2 %，加水88 % ;④液態(tài)裂褶菌5-10 %，葡萄糖或砂糖1.5-2%，乙酸或蘋果酸0.5-1%，水85-95% ;⑤亞硫酸氫鈉0.5-3.0%，甲酸銨
0.1-2.0%，酸性溶液0.1-2.0%，葡萄糖酸鈉0.01-0.2%，余量為水；?微生物和鉀鹽溶液按體積比1:2-1:32組成；⑦吲哚丁酸鉀1-20克、4%赤霉素1-20毫升、40%乙烯利1_50毫升、氯化鈉(甲酸鈉)1-50克、亞硫酸氫鈉1-5克各配制成1000毫升溶液?；蜻胚岫∷徕?-20克和甲酸鈉1-50克配制成1000毫升溶液；或吲哚丁酸鉀、乙烯和亞硫酸氫鈉按比例混合，配制成1000毫升溶液。以上方法結(jié)合促進(jìn)劑輸入白木香樹上均能促使沉香的形成。
[0005]很多學(xué)者認(rèn)為真菌對(duì)沉香的形成發(fā)揮著重要的作用，并發(fā)現(xiàn)真菌能促進(jìn)結(jié)香，但真菌結(jié)香技術(shù)一直未見廣泛應(yīng)用，所以尋找一種能提高沉香品質(zhì)的菌株應(yīng)用于生產(chǎn)有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是解決沉香屬(Aquilaria)植物如白木香結(jié)香問題，針對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)，篩選一株具有優(yōu)異的促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)植物如白木香結(jié)香效果的真菌，并在生產(chǎn)上應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一株擬層孔菌(Fomitopsis sp.)菌株能促進(jìn)沉香的形成并且形成的沉香中間不易腐爛，對(duì)沉香的產(chǎn)業(yè)化有著重要的意義，將其命名為擬層孔菌(Fomitopsissp.) ASARU。[0007]本發(fā)明的擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01從白木香的結(jié)香層中分離獲得，已于2013年6月24號(hào)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為=CGMCCN0.7802。
[0008]擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOl在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征為:在PDA的培養(yǎng)基上，菌落白色，勻質(zhì)狀，邊緣整齊；菌絲纖細(xì)，有叉狀分枝，不易產(chǎn)孢。擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOI,其rDNA的ITS長度為656bp,序列為序列表中序列I所示的核苷酸序列。
[0009]上述擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOI在促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)植物產(chǎn)生沉香中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述沉香屬(AquiIaria)植物為馬來沉香(Aquilaria malaccensis),越南沉香(Aquilaria crassna)或白木香(Aquilariasinensis);優(yōu)選為白木香(Aquilaria sinensis)。
[0010]在擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)植物產(chǎn)生沉香中的應(yīng)用中，本發(fā)明利用擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株、發(fā)酵液、除菌的濾液及濾液中的活性成分促進(jìn)結(jié)香，具體的技術(shù)方案為:將擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株、菌株發(fā)酵液、除菌的濾液及濾液中的活性成分接種到白木香根、莖或分枝上。所述接種方式為鉆洞接種或通體結(jié)香技術(shù)接種方式。所述鉆洞接種為在待接種的沉香屬(Aquilaria)植物自根部到地上50cm-lm處部位鉆洞，洞深至3_5cm,將上述接種擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌絲或發(fā)酵菌液注入洞中；所述通體結(jié)香技術(shù)接種:將接種擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01發(fā)酵菌液、或發(fā)酵液去除菌體后的濾液通過輸液裝置注入沉香屬(Aquilaria)植物，利用植物的蒸騰作用疏導(dǎo)至植物莖干、枝條、根等各器官，促使整個(gè)植株內(nèi)部結(jié)香。所述沉香屬(Aquilaria)植物為馬來沉香(Aquilaria malaccensis),越南沉香(Aquilaria cra ssna)或白木香(Aquilaria sinensis);優(yōu)選為白木香(Aquilariasinensis)。所述白木香的樹齡為3年以上,優(yōu)選為樹齡為6年的白木香。
[0011]上述擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株、菌株發(fā)酵液、除菌的濾液、濾液中的活性成分和菌株發(fā)酵液或者濾液濃縮制劑作為促進(jìn)白木香結(jié)香的結(jié)香劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)一種結(jié)香劑,其活性成分為擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株、擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株發(fā)酵液或者擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株發(fā)酵液去除菌體后的菌液。
[0013]上述菌株發(fā)酵液的獲得方法為將擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株接種于溫度為15_40°C的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液。所述液體培養(yǎng)基的pH值可以為pH2-11 ;具體的培養(yǎng)基可以為液體PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)的時(shí)間可以為3-15天，培養(yǎng)的方式可以為搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)的溫度具體可以為35°C。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:結(jié)香菌株擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01接種6個(gè)月后即可形成比較厚的沉香層并且中間不易腐爛。該菌株在PH2-11和溫度15-40°C的條件下仍能生長，說明具有很強(qiáng)的環(huán)境耐受力。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)菌株(Fomitopsis sp.)ASAF01能促進(jìn)白木香結(jié)香且形成的沉香中間不易腐爛，對(duì)沉香的產(chǎn)業(yè)化有著重要的意義?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOl菌株促進(jìn)沉香形成及真菌形態(tài)學(xué)特征觀察；其中A為擬層孔菌(Fomitopsis sp.)促進(jìn)結(jié)香效果圖；B為擬層孔菌(Fomitopsis sp.)的菌落;C為擬層孔菌(Fomitopsis sp.)菌絲形態(tài)。
[0016]圖2為本發(fā)明的擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株的ITS序列PCR產(chǎn)物。
[0017] 圖3為本發(fā)明的擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株促進(jìn)結(jié)香所產(chǎn)沉香的薄層鑒定；BK為健康的白木香，ST為色酮對(duì)照，CK為中國藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，Iff為ASAF01菌株接種6個(gè)月的沉香，EA為優(yōu)等的野生沉香。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0019]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0020]下述實(shí)施例中所用的PDA液體培養(yǎng)基:稱量去皮馬鈴薯200g,切成小塊，加水煮30min,紗布過濾，加葡萄糖20g，最后定容至1L。固體PDA培養(yǎng)基為:稱量去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水煮30min,紗布過濾,加葡萄糖20g,加15_20g瓊脂,最后定容至1L。
[0021]實(shí)施例1、擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株的分離、篩選和鑒定
[0022]本發(fā)明利用組織分離法進(jìn)行菌株分離。具體方法如下所述:在海南省萬寧市南藥園采取天然的沉香樣品，在水龍頭下沖洗30min,然后用70%的酒精消毒3_5min，用無菌水沖洗3次,然后用10% (質(zhì)量百分濃度)的次氯酸鈉浸泡5min，再用無菌水沖洗3次,然后切成的小段放在含有鏈霉素的培養(yǎng)基中,最后一次無菌水作對(duì)照。3d后每天檢查并挑取菌株并純化，直至2周。
[0023]將分離到的菌株在PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3-15d，接種真菌菌絲、或者利用通體結(jié)香技術(shù)輸入發(fā)酵液、除菌濾液，含濾液中的活性成分的提取液對(duì)白木香進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有一株菌株接種6個(gè)月后木質(zhì)部沉香層輪廓清晰可見(圖1中A)，將該菌株命名為擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFO1將這株能結(jié)香的菌株擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01在培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察，菌落為圓形、白色、勻質(zhì)狀，邊緣整齊(圖1中B)。利用電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)菌絲較纖細(xì)，叉狀分支(圖1中C)。由于該菌株不產(chǎn)孢，采用分子方法鑒定，提取 ASAF01 菌株 DNA，以 ITSl (5 ' -TCCGATGGTGAACCTGCGG-3 ')和ITS4 (5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，克隆測(cè)序獲得656bp的ITS序列，堿基序列如序列表中序列I所示。將獲得的序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯不其序列與Fomitopsis meliae (AccessionN0.HQ248221)同源性達(dá) 97%，與 Fomitopsis cf.meliae (AB540581 ；GQ982889 ；FJ372675 ；FJ372673.1)同源性達(dá)96%。通過形態(tài)特征和分子特征將其鑒定為擬層孔菌(Fomitopsissp.) ASARU。
[0024]擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01已于2013年6月24號(hào)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為=CGMCC N0.7802。
[0025]實(shí)施例2、擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株生長條件檢測(cè)。
[0026]將擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01的菌絲接種于含有固體PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心，在分別設(shè)置為10°C、15°C、20°C、25°C、28°C、30 V、35°C >40 V的恒溫箱中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASAFOl在15°C至40°C條件均能生長，但35°C最適合生長。用0.lmol/L HCL和0.lmol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，制成PH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的液體PDA培養(yǎng)基，將菌絲接種置于不同pH值的液體PDA培養(yǎng)基中，在35°C 200轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株在PH2至PHll均能生長，最適pH值為7。
[0027]實(shí)施例3、擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOl促進(jìn)沉香產(chǎn)生效果驗(yàn)證
[0028]將擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株培養(yǎng)3_15d，得到菌株菌絲、發(fā)酵液，除菌濾液，根據(jù)樹的大小按不同的劑量接種、鉆洞或者利用通體結(jié)香技術(shù)將含菌體的發(fā)酵液，發(fā)酵液除去菌體的濾液接種白木香促進(jìn)結(jié)香，具體接種方法如下:
[0029]1、接種材料的獲得:擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌絲，即為接種菌絲I。菌絲接種至PDA液體培養(yǎng)基中，在35°C 200轉(zhuǎn)/分搖培3-15天，得到培養(yǎng)液，即為菌液2。同時(shí)按照上述方法培養(yǎng)擬層孔菌(Fomitopsissp.)ASAFOI菌株獲得培養(yǎng)液后，過濾去除菌體，得到除菌濾液，即為濾液3。菌液或?yàn)V液噴霧濃縮得到的濃縮物，即為濃縮制劑4，菌株、菌液或?yàn)V液提取的主要成分，即為主成分5。
[0030]2、接種:以白木香(Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg)為接種對(duì)象進(jìn)行接種，接種方法如下:1)鉆洞接種:在6年樹齡白木香的自根部到地上50cm處部位鉆洞，洞深至
3-5cm，將上述接種菌絲I或菌液2分別注入洞中；或者2)通體結(jié)香技術(shù)接種:在6年樹齡的白木香上分別將菌液2、濾液3、濃縮制劑4或主成分5分別通過輸液裝置利用植物的蒸騰作用疏導(dǎo)至植物莖干、枝條、根等各器官，促使整個(gè)植株內(nèi)部結(jié)香。結(jié)果表明，上述接種方式均可以使白木香結(jié)香。其中，以濾液3結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)跟接種菌絲1、菌液2利用鉆洞法接種相比，具有結(jié)香速度快、結(jié)香面大及結(jié)香距離長的特點(diǎn)。濾液3結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)也比相同體積的菌液2、濃縮制劑4或主成分5結(jié)合通體結(jié)香技術(shù)所獲得的沉香效果好。但是上述方法均可使白木香在六個(gè)月內(nèi)結(jié)香。
[0031]上述接種操作6個(gè)月，將結(jié)香的白木香砍下，剖香，然后進(jìn)行薄層鑒定。具體方法為:取上述方法獲得的ASAF01菌株接種6個(gè)月獲得的沉香樣品粉末Ig置于具塞三角瓶中，加甲醇25ml,超聲處理60min,過濾,濾液定容至25ml,作為供試品溶液。野生沉香藥材(中國藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，購自中國藥品檢定研究院，批號(hào):121222201102)的樣品和優(yōu)等的野生沉香(2012年購于海南沉香博覽會(huì))及健康白木香(莖部磨成粉末)，制備方法同上分別作為對(duì)照藥材溶液，取6，7- 二甲氧基-2 (2-苯乙基)色酮加甲醇配制成每毫升含
0.05mg6, 7- 二甲氧基-2 (2-苯乙基)色酮的色酮對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和色酮對(duì)照品溶液各5 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(V:v=10: I)為展開劑，展開兩次，取出晾干，置紫外光燈(254nm和365nm)下檢視，拍照。圖3中的BK為健康的白木香，ST為色酮對(duì)照(6，7-二甲氧基-2 (2-苯乙基)色酮加甲醇)，CK為中國藥典規(guī)定的對(duì)照藥材，IW為ASAF01菌株接種(濾液3用通體結(jié)香技術(shù)輸液的沉香)6個(gè)月的沉香，EA為優(yōu)等的野生沉香。從圖3中可知，ASAF01菌株接種6個(gè)月后可促進(jìn)沉香的形成，且通過觀察可知，用ASAF01菌株菌絲、菌液和去除菌體的過濾液用鉆洞或者通體結(jié)香技術(shù)形成的沉香中間不腐爛。
【權(quán)利要求】
1.擬層孔菌(Fomitopsissp.)ASAF01,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.7802。
2.擬層孔菌(Fomitopsissp.)ASAF01CGMCC N0.7802 在促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)植物產(chǎn)生沉香中的應(yīng)用。
3.擬層孔菌(Fomitopsissp.) ASAFOl菌株菌絲、菌株發(fā)酵液、發(fā)酵液除菌獲得的濾液、濾液中的活性成分或菌株發(fā)酵液/濾液濃縮制劑作為促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)、擬沉香屬(Gyrinops)或其他誘導(dǎo)型植物結(jié)香的結(jié)香劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述菌株發(fā)酵液的獲得方法為將擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAF01菌株接種于溫度為15-40°C的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液。
5.一種結(jié)香劑，其活性成分為擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOl菌絲、擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOI菌株發(fā)酵液、擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAFOI菌株發(fā)酵液去除菌體后的濾液或菌株發(fā)酵液/濾液濃縮制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)香劑，其特征在于，所述擬層孔菌(Fomitopsissp.)ASAF01菌株發(fā)酵液的獲得方法為將擬層孔菌(Fomitopsis sp.)ASAFOI菌株接種于溫度為15-40°C的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液。
7.一種促進(jìn)沉香屬(Aquilaria)植物產(chǎn)沉香的方法，是將權(quán)利要求5或6所述的結(jié)香劑接種于沉香屬(Aquilaria)植物根、莖和/或分枝上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述接種的方法為鉆洞接種或者通體結(jié)香技術(shù)接種。`
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK103651151SQ201310593250
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】魏建和, 陳旭玉, 楊云, 劉洋洋, 張爭, 甘炳春, 蘇智 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所