專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌子實(shí)體培殖方法，更加具體的說(shuō)涉及一種蛹蟲(chóng)草液態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)與冬蟲(chóng)夏草同屬蟲(chóng)草屬(Cordyceps),親緣關(guān)系十分接近。蛹蟲(chóng)草始載于《新華本草綱要》，其“味甘、性平”，有“益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰”之功效。蛹蟲(chóng)草富含蟲(chóng)草素、腺苷、多糖、超氧化物歧化酶(S0D)、蟲(chóng)草酸、氨基酸等活性成分，以及硒、鋅、鐵等礦物質(zhì)元素。大量的藥理及臨床試驗(yàn)證明，蛹蟲(chóng)草的功效成分和藥理作用接近或超過(guò)冬蟲(chóng)夏草，可作為冬蟲(chóng)夏草的替代品，具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值?！?br> 蛹蟲(chóng)草又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草等,分類(lèi)學(xué)上屬于子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼菌目(Sphaeriales)、麥角菌科(Claviciptiaceae)、蟲(chóng)草屬(Cordyceps)，與冬蟲(chóng)夏草為同屬。它是由蛹蟲(chóng)草菌的菌絲體通過(guò)各種方式浸染鱗翅目等昆蟲(chóng)，以昆蟲(chóng)體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)，生長(zhǎng)成子座(子實(shí)體)，子座單生或叢生，橙黃色，長(zhǎng)2-5cm。相對(duì)來(lái)說(shuō),蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)環(huán)境遠(yuǎn)沒(méi)有冬蟲(chóng)夏草那樣狹窄,主產(chǎn)于云南、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等省區(qū)，寄生于針葉林地、闊葉林或混交林地表土層中的鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或蛹體上。蛹蟲(chóng)草的天然資源非常有限，規(guī)?；美щy。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，經(jīng)科研人員的攻關(guān)，人工培育蛹蟲(chóng)草已獲成功，目前主要有以下3種培養(yǎng)方法一是以終產(chǎn)物蟲(chóng)草菌絲體為目的，將蛹蟲(chóng)草液體菌種，接種到麥麩、稻糠等固體培養(yǎng)基上，經(jīng)發(fā)酵后獲得蛹蟲(chóng)草菌絲體；二是以蟲(chóng)草子實(shí)體為目的，將蛹蟲(chóng)草菌種接種到大米等固體培養(yǎng)基上，在一定的環(huán)境適宜條件下，培養(yǎng)可得蛹蟲(chóng)草子實(shí)體(又名蟲(chóng)草花)；三是以蟲(chóng)菌復(fù)合體為目的，將蛹蟲(chóng)草菌種接種在活體柞蠶、家蠶幼蟲(chóng)或蛹體內(nèi)，適宜的環(huán)境條件下，培養(yǎng)可獲得蟲(chóng)菌復(fù)合體-蠶蛹蟲(chóng)草。

發(fā)明內(nèi)容
為解決蛹蟲(chóng)草子實(shí)體培養(yǎng)中原料價(jià)格過(guò)高、培養(yǎng)基滅菌難度大等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的生產(chǎn)方法，用液態(tài)的碳源和氮源替代在蛹蟲(chóng)草發(fā)菌和培養(yǎng)階段采用的固態(tài)培養(yǎng)基，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的子座固定在無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)上，具體的發(fā)明內(nèi)容為—種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由固體無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)和液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液組成。所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)為粒度分布維度值介于I. 2-3. 5之間的無(wú)機(jī)多孔材料。所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)為浮石、煤渣、礦渣中的一種。所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)在培養(yǎng)基中的鋪墊厚度為3cm ;所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)為顆粒狀，顆粒直徑為I-IOmm之間。所述發(fā)菌培養(yǎng)液和出草培養(yǎng)液兩部分組成；其中，每30CmX30Cm面積的發(fā)菌培養(yǎng)液的配方為麥芽糖IOOg,酵母膏20g,葡萄糖20g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂2g, VB1IOmg,水lOOOmL，pH6.5 ；每30CmX30Cm面積的出草培養(yǎng)液為蔗糖250g，酵母膏30g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂 O. 8g, VB1IOmg,水 IOOOmL, ρΗ7· 5。一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)方法，包括以下步驟I)將蛹蟲(chóng)草菌株從PDA培養(yǎng)基直接接種到權(quán)利要求4所述的發(fā)菌培養(yǎng)液中，置于發(fā)酵罐發(fā)酵，至發(fā)菌培養(yǎng)液產(chǎn)生菌絲；2)將步驟I)所述產(chǎn)生菌絲的發(fā)菌培養(yǎng)液直接注入到權(quán)利要求3所述的無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)中；3)在潔凈度優(yōu)于10級(jí)的條件下進(jìn)行發(fā)菌階段培養(yǎng)，培養(yǎng)為25±2°C，濕度為80-95%，暗室培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)；
4)完成發(fā)菌階段培養(yǎng)后繼續(xù)出草階段的培養(yǎng)，培養(yǎng)為18±2°C，濕度為75-85%，光照12小時(shí)強(qiáng)度1000-50001uX，暗室12小時(shí)，培養(yǎng)至無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)中物流動(dòng)水時(shí)，加入權(quán)利要求4所述的出草培養(yǎng)液；5)繼續(xù)出草階段的培養(yǎng)得到蛹蟲(chóng)草子實(shí)體。所述發(fā)菌培養(yǎng)時(shí)間為7-10天，所述出草階段的培養(yǎng)時(shí)間為25-30天。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是本發(fā)明的提供的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，其解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)基需要菌盒整體滅菌的問(wèn)題，培養(yǎng)基的活性成分利用度高，培養(yǎng)基殘留物經(jīng)過(guò)爍燒滅菌后可以繼續(xù)使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I培養(yǎng)基碳源的考察發(fā)菌培養(yǎng)液配方碳源I，酵母膏20g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂2g，VB11OmgjjC lOOOmL，pH6 ;試驗(yàn)中更換相應(yīng)碳源；出草培養(yǎng)液配方基礎(chǔ)配方碳源II，酵母膏30g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0. Sg,VBlIOmgjjC lOOOmL，pH7. 5 ;試驗(yàn)中添加相應(yīng)小分子碳源。將試驗(yàn)菌種接入PDA培養(yǎng)基中，置于20°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)斜面?zhèn)溆靡陨鲜霭l(fā)菌培養(yǎng)液配方為基礎(chǔ)，分別加入等含碳量的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖及可溶性淀粉，制作液體培養(yǎng)基，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。將液體培養(yǎng)基裝入300mL三角瓶中，每瓶裝入120mL，在0. 15MPa濕熱高壓蒸汽下滅菌30min，冷卻后接人蛹蟲(chóng)草菌種，20°C下轉(zhuǎn)速120rpm搖床震蕩培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照，每批次20個(gè)重復(fù)，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。終止發(fā)酵后，用冷凍離心機(jī)8000rpm，離心lOmin，55°C下烘干至恒重，10個(gè)重復(fù)，計(jì)算IOOmL中菌絲干重。其中菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定采用試管斜面測(cè)定法。即在上述液體培養(yǎng)基中添加18g瓊脂，制作試管斜面。接人蛹蟲(chóng)草菌種后，測(cè)定菌種萌發(fā)后菌絲體在試管斜面上的生長(zhǎng)速度。栽培培養(yǎng)基制作以發(fā)菌培養(yǎng)液配方為基礎(chǔ)，分別添加等含碳量的葡萄糖或蔗糖，觀察發(fā)菌及出草情況。培養(yǎng)基裝入300mL罐頭瓶后，在0. 15MPa濕熱高壓蒸汽下滅菌lh，冷卻后接人液體菌種中長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)液體菌種，每批次30個(gè)重復(fù)。接種固體無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)和發(fā)菌培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，應(yīng)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，培養(yǎng)室的潔凈度要求優(yōu)于10萬(wàn)級(jí)。接種完畢，將培養(yǎng)瓶移人25°C左右恒溫培養(yǎng)室中進(jìn)行發(fā)菌管理，濕度為80-95%，避光培養(yǎng)，其間注意通風(fēng)，約4天后菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)瓶。菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)瓶后，給予散射光照射，進(jìn)行轉(zhuǎn)色管理，一定晝夜溫差刺激蟲(chóng)草原基分化形成。在蟲(chóng)草子座表面形成子囊殼時(shí)及時(shí)采收。不同碳源對(duì)液體菌種菌絲生長(zhǎng)狀況直接決定著菌種的優(yōu)劣，對(duì)菌種接種后的發(fā)菌及出草情況有著重要影響。表I不同碳源對(duì)發(fā)酵罐液體菌種菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的影響
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基由固體無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)和液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)為粒度分布維度值介于I. 2-3. 5之間的無(wú)機(jī)多孔材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)為浮石、煤洛、礦洛中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)在培養(yǎng)基中的鋪墊厚度為3cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)菌培養(yǎng)液和出草培養(yǎng)液兩部分組成；其中，每30cmX30cm面積的發(fā)菌培養(yǎng)液的配方為麥芽糖100g，酵母膏20 g,葡萄糖20 g,磷酸二氫鉀2 g,硫酸鎂2 g, VB1 10 mg,水IOOOmL, pH6. 5 ; 每30cmX 30cm面積的出草培養(yǎng)液為蔗糖250 g，酵母膏30 g，磷酸二氫鉀I g，硫酸鎂 O. 8g, VB1 10 mg，水 1000 mL, ρΗ7· 5。
6.一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟 1)將蛹蟲(chóng)草菌株從PDA培養(yǎng)基直接接種到權(quán)利要求4所述的發(fā)菌培養(yǎng)液中，置于發(fā)酵罐發(fā)酵，至發(fā)菌培養(yǎng)液產(chǎn)生菌絲； 2)將步驟I)所述產(chǎn)生菌絲的發(fā)菌培養(yǎng)液直接注入到權(quán)利要求3所述的無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)中； 3)在潔凈度優(yōu)于10級(jí)的條件下進(jìn)行發(fā)菌階段培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2°C，濕度為80-95%，暗室培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)； 4)完成發(fā)菌階段培養(yǎng)后繼續(xù)出草階段的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為18±2°C，濕度為75-85%，光照12小時(shí)強(qiáng)度1000-50001uX，暗室12小時(shí)，培養(yǎng)至無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)中物流動(dòng)水時(shí)，加入權(quán)利要求4所述的出草培養(yǎng)液； 5)繼續(xù)出草階段的培養(yǎng)得到蛹蟲(chóng)草子實(shí)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)方法,其特征在于所述發(fā)菌培養(yǎng)時(shí)間為7-10天，所述出草階段的培養(yǎng)時(shí)間為25-30天。
全文摘要
本發(fā)明的提供的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基由固體無(wú)機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)和液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液組成,其解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)基需要菌盒整體滅菌的問(wèn)題，培養(yǎng)基的活性成分利用度高，培養(yǎng)基殘留物經(jīng)過(guò)爍燒滅菌后可以繼續(xù)使用。
文檔編號(hào)C05G3/00GK102942422SQ20121053668
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者陳均, 龍新, 劉飛 申請(qǐng)人:重慶慈恩生物科技有限公司