專利名稱：一種玉米油份含量相關(guān)的snp位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬于玉米育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高油玉米的籽粒油份含量超過(guò)6%，高油玉米不僅是人類(lèi)健康食品與優(yōu)質(zhì)動(dòng)物飼料，而且還是重要的工業(yè)原料。玉米油富含較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，對(duì)人體健康具有重要作用，因此又稱為健康油。油份在玉米籽粒中以三酰甘油的形式存在，包括軟脂酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)、月桂酸(C12:l)、豆蘧酸(C14:l)、棕櫚油酸(C16:l)、花生酸(C20:l)、三崳酸(C22:l)、芥子酸(C22:2)、甘四烷酸(C24:l)。
其中最具商品價(jià)值的脂肪酸組分為軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。玉米油的品質(zhì)主要由飽和(C16:0、C18:0)與不飽和脂肪酸(C18:1、C18:2、C18:3)的比例決定。玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附連三個(gè)脂肪酸的形式存在。其基本過(guò)程乙酰輔酶A經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰單酰輔酶A.這是脂肪酸合成的第一關(guān)鍵步驟，也是調(diào)控整個(gè)脂肪酸合成的限速步驟。然后脂肪酸合成酶(FAS)以丙二酰單酰輔酶A為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加2個(gè)碳鏈的頻率合成?；兼?。而不斷增加的?；兼溣峙c?；d體蛋白(ACP)結(jié)合，ACP負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸合成途徑中的中間產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)數(shù)次聚合反應(yīng)后，脂肪酸的合成在?；?ACP硫酯酶或?；D(zhuǎn)移酶的作用下終止。終止聚合反應(yīng)后，不同碳鏈長(zhǎng)度的?；鵄CP，在?；o酶A合成酶的作用下生成酰基輔酶A，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中。最后利用儲(chǔ)存在胞質(zhì)中的?；o酶A，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過(guò)3種不同的?；D(zhuǎn)移酶(甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶GPAT、溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶LPAAT、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT)。在甘油上附連脂肪酸以合成三酰甘油，并儲(chǔ)存在不連續(xù)分布的亞細(xì)胞器油體中。另外，脂肪酸合成后經(jīng)過(guò)不同的修飾方式合成長(zhǎng)鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸。植物的脂肪酸的合成發(fā)生在質(zhì)體中，有乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)和脂肪酸合成酶(FAS)催化合成。植物FAS是一個(gè)由多個(gè)獨(dú)立蛋白構(gòu)成的酶體系。其中酮酰-ACP合成酶III (KASIII)催化C4酰基的形成，C4 C16的聚合由酮酰-ACP合成酶I (KASI)催化，C16 C18最后2個(gè)碳的聚合由酮酰-ACP合成酶II (KASII)催化。植物TAG的合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，由甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶GPAT、溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶LPAAT、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT催化合成。植物脂肪酸的修飾主要指脂肪酸的鏈延長(zhǎng)延伸和脫飽和。脂肪酸每2個(gè)碳的延伸由4步催化完成，其中脂肪酸延伸酶(FAE)是脂肪酸眼神的第一關(guān)鍵限速酶。植物中飽和脂肪酸的主要成分是棕櫚酸(C16:0)。棕櫚酰ACP在脂肪酸代謝途徑中是一關(guān)鍵物，其碳鏈既能被KASII進(jìn)一步延長(zhǎng)，也可以在乙酰ACP硫酯酶(TE)作用下脫ACP形成棕櫚酸并轉(zhuǎn)化為貯存態(tài)油。植物不飽和脂肪酸的主要成分是油酸和亞油酸。油酸是硬脂酸脫飽和酶以硬脂酸為底物催化形成，發(fā)生在植物質(zhì)體中，是植物不飽和脂肪酸合成的第一步。植物從油酸——亞油酸——亞麻酸的脫飽和在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩個(gè)細(xì)胞器中完成。在質(zhì)體中分別由Ψ-6油酸脫飽和酶(FAD6)和Ψ-3油酸脫飽和酶(FAD7/FAD8)催化完成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分別由Λ-12油酸脫飽和酶(FAD2)和Λ-15油酸脫飽和酶(FAD3)催化完成。目前隨著基因組測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)的高速發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析成為挖掘和剖析玉米油份相關(guān)基因及其遺傳基礎(chǔ)是最有效的方法之一。玉米遺傳學(xué)家在全基因水平上挖掘玉米油分相關(guān)基因，開(kāi)發(fā)功能分子標(biāo)記，加快高油玉米的定向遺傳改良。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的AM508群體由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見(jiàn)的玉米市售材料，可通過(guò)常規(guī)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)得到)。候選基因重測(cè)序材料 155份我國(guó)骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫(kù)，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬(wàn)堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508群體為材料,利用Illumina MaizeSNP50BeadChip對(duì)56，110個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫(kù)，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬(wàn)堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高質(zhì)量的SNP，分別對(duì)這兩個(gè)群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個(gè)群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N =1. 78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào)中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過(guò)濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號(hào)中。利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其位于玉米基因組chr3. S_166664152的SNP位點(diǎn)，突變?yōu)镃/G。其中C為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 08，該位點(diǎn)與玉米油分含量顯著相關(guān)，解釋7. 43%的表型變異。
具體實(shí)施例方式AM508群體由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成，已在參考文獻(xiàn) Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasm collection and itspotential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公開(kāi)過(guò)。候選基因重測(cè)序材料155份我國(guó)骨干自交系材料，已在參考文獻(xiàn)Yang，X. H. et al. Genetic analysis and characterization of a new maize associationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公開(kāi)過(guò)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫(kù)，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬(wàn)堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。表型變異AM508群體包含508個(gè)自交系(其中包括35個(gè)高油品系)油含量相關(guān)的變異豐富，軟脂肪酸含量差異2. 3倍，硬脂肪酸含量差異達(dá)8倍。軟脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亞麻油酸(18:2,51. 2% )和亞麻酸(18:3,1.4%)這五種脂肪酸占98. 4%的油含量。4個(gè)環(huán)境聯(lián)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)十個(gè)油份相關(guān)性狀的遺傳力均在90%以上。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508 群體為材料,利用 Illumina MaizeSNP50BeadChip 對(duì) 56，110 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫(kù)，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)·為73. 8±0. 7百萬(wàn)堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量的SNP，分別對(duì)這兩個(gè)群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個(gè)群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N = 1.78X10-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào)中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過(guò)濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號(hào)中，有若干個(gè)位點(diǎn)位于或者臨近于(50Kb)被前人證實(shí)報(bào)道過(guò)的已知基因內(nèi)，它們?cè)诒狙芯恐性俅蔚玫搅蓑?yàn)證。與已知的油脂代謝相關(guān)基因較遠(yuǎn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)很可能是與油脂代謝相關(guān)基因緊密連鎖，則距離最近的油脂代謝基因很可能就是本研究的候選基因。利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其位于玉米基因組chr3. S_166664152的SNP位點(diǎn)，突變?yōu)镃/G。其中C為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 08，該位點(diǎn)與玉米油分含量顯著相關(guān)，解釋7. 43%的表型變異，該位點(diǎn)與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖。
ΤΤ ~i~等位基因/最小
因^ 色位置b SNP性狀c等位基因頻率^%f P基因注釋J
體e
GRMZ,
油份Triglyceride lipases,
M2G17 3 166664152 chr3.S I66664152 . ^ C/G/0.08 7.43 4.61E-07F
6542_~_^_a表中給出的基因的名稱是所定位的顯著位點(diǎn)內(nèi)的極可能相關(guān)的功能候選基因或者與最顯著關(guān)聯(lián)SNP (主效SNP)最近的已注釋基因。b主效SNP的位置根據(jù)玉米5a. 60版本的參考序列確定(www. maizesequence.org)c在檢測(cè)到的顯著的油脂相關(guān)性狀中最顯著相關(guān)的性狀。e主等位基因(第一個(gè))，次等位基因以及次等位基因頻率f線性混合模型的計(jì)算過(guò)程使用tassel軟件完成
j 所有的候選基因基 于 Interproscan(http://www. eb1. ac. uk/interpro)所注釋的基因。
權(quán)利要求
1.一種玉米油份含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)，其特征在于，所述的SNP位點(diǎn)與玉米油份含量相關(guān)，與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖，位于玉米參考基因組(誦.maizesequence. org, 5a. 60 版)chr3. S_166664152 上，該位點(diǎn)突變?yōu)?C/G。
2.如權(quán)利要求所述的SNP位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟 a)由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系,構(gòu)建200bp大小插入片段文庫(kù)，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序； c)利用3個(gè)群體進(jìn)行連鎖分析高油玉米自交系By804與普通玉米自交系B73衍生的重組自交系，利用包含1536個(gè)SNP標(biāo)記的GoldenGate芯片對(duì)家系及其親本進(jìn)行基因型鑒定，利用Mapmaker3. 0軟件構(gòu)建連鎖圖，采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位； d)結(jié)合F2、F2:3兩個(gè)世代群體油份含量的測(cè)定結(jié)果，利用軟件QTLcartographer V2. 5，采用復(fù)合區(qū)間作圖法篩選與油份含量緊密連鎖的QTL位點(diǎn)；篩選到在F2和F2:3兩個(gè)世代均能穩(wěn)定表達(dá)的油份含量主效QTL。
3.如權(quán)利要求1或2所述的玉米油份含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)在玉米育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬于植物分子育種領(lǐng)域。玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr3.S_166664152的SNP與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖，并且與玉米油份含量顯著相關(guān)。本發(fā)明的位點(diǎn)可用于高油玉米分子標(biāo)記輔助育種，克服了常規(guī)育種周期長(zhǎng)、后期篩選工作量大、對(duì)品種或品系進(jìn)行鑒定的效率低等缺陷和不足。
文檔編號(hào)A01H1/04GK102994496SQ20121044467
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者嚴(yán)建兵, 楊小紅, 李建生, 李慧 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)