專利名稱：厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于植物快繁方法技術(shù)領域，具體為厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖。
背景技術(shù)：
厚葉巖白菜crassifolia (Linn. ) Fritsch)為虎耳草科巖白菜,屬多年生常綠草本，是同屬植物中形體較大種類 ，國內(nèi)野生種僅見分布于新疆阿爾泰山海拔2000 m左右灌木叢下的巖石縫隙中，在蒙古、俄羅斯、朝鮮也有少量分布，開花極早，進人冬季，葉片呈紅綠色或紫紅色，花葉俱美，觀賞價值高。全草含有巖白菜素，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥，巖白菜素存在于我國五科九屬植物中，在意大利、日本、印度等國家植物中也有發(fā)現(xiàn)，但為不同科屬，巖白菜素得率差別很大，其中以厚葉巖白菜得率最高，約4. 5%，并含有獨特的縮合鞣質(zhì)、熊果酚甙等物質(zhì)。自然狀態(tài)下，厚葉巖白菜主要靠地下根狀莖分株繁殖，繁殖率低，生長緩慢。自然結(jié)實率極低，春季播種出苗率最高也僅達22. 5%，實生苗也非常細小，幼苗很難在惡劣的環(huán)境下存活。種子細小，千粒重僅為O. 21g，無后熟休眠特性，成熟撒落時，原生長地的氣溫阻礙了種子的萌發(fā)，所以目前未實現(xiàn)大規(guī)模的人工栽培。巖白菜屬植物主要含有三大類物質(zhì)酚類、黃酮類以及多糖類等，酚類物質(zhì)容易引起離體培養(yǎng)中植物材料的褐變。其根狀莖粗大，長期深埋于土壤中，感染各種外源微生物機會多，而且有報道巖白菜屬植物中存在眾多內(nèi)生真菌。植物材料褐變和內(nèi)生菌引發(fā)的污染，成為巖白菜能否離體培養(yǎng)成功進而實現(xiàn)快速繁育的瓶頸所在。國內(nèi)外植物界在化學成分分析、資源開發(fā)、臨床應用、栽培馴化上都有了較深的研究。隨著厚葉巖白菜藥用價值的拓寬和綠化用途的提升，野生資源被過度的采挖利用，野生巖白菜屬植物資源日趨瀕危。為兼顧植物多樣性保護與資源的合理開發(fā)，我們進行了系統(tǒng)引種栽培馴化試驗，在單株選優(yōu)的基礎上開展了快速繁殖技術(shù)研究，不僅有益于經(jīng)濟發(fā)展，保護野生資源，也是制藥企業(yè)長期持續(xù)發(fā)展的必由之路，從根本上解決巖白菜屬藥用植物資源尖銳的供需矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，在離體條件下快速繁殖厚葉巖白菜，且生產(chǎn)的厚葉巖白菜種苗品質(zhì)高，一致性好。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案包括下述步驟取厚葉巖白菜外植體在無菌環(huán)境下，經(jīng)初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得再生植株，進行栽種，其按下列步驟進行
所述的初代培養(yǎng)選擇并清洗、消毒處理帶頂芽的新鮮根狀莖獲得起始的無菌試管苗，在無菌環(huán)境的顯微鏡下修切為O. 2^0. 5mm大小的芽點，接種到初代培養(yǎng)基上，進行初代培養(yǎng)，獲得初代培養(yǎng)的無菌苗，所述的初代培養(yǎng)基為
MS+6-BA0. 15 O. 25mg · I/1+NAAO· 15 O. 25mg · L-1+VC0. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35g · L-1+瓊脂 4 8g · L 1 ;
所述的增殖培養(yǎng)是將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，誘導不定芽，該增殖培養(yǎng)基
為
MS+BAO. 5 3. 5mg · L ^NAAO. 2 I. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35 g · L :+ 瓊脂4^8 g .171,誘導出叢生芽；
所述的壯苗培養(yǎng)將誘導出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進行壯苗培養(yǎng)，獲得
I.5cm以上的試管苗；
所述的生根培養(yǎng)將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長到I. 5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，獲得生根試管苗，該生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg Γ'+ΙΒΑΟ. 5 2· 5 mg Γ1+ VCO. 5 5· Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 瓊脂 4 8g · L-1 ；
最后，對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土、腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中進行栽種。本發(fā)明選用VC做為抗褐化劑，凡是有切割植物操作的試驗中，無菌水或培養(yǎng)基都要添加VC，保證整個流程中，褐化率比較低，不影響試驗的順利進行。采用莖尖消毒后，繼續(xù)無菌修切為O. 2^0. 5mm大小芽點的方法，可以有效克服外源微生物和內(nèi)生菌引起的植物材料污染，是保證整個快繁培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟之一。本發(fā)明一旦得到無菌苗后，可以利用無菌苗誘導增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生為完整植株，形成了一個良好的生產(chǎn)體系。到目前為止，僅見中國科學院新疆理化技術(shù)研究所在野生厚葉巖白菜愈傷組織發(fā)生途徑方面有所報道，但未見標準化育苗方面報道。本發(fā)明在單株選優(yōu)的基礎上，采用直接器官發(fā)生形式，通過對培養(yǎng)基成分、激素配比以及環(huán)境因子的確定，建立了厚葉巖白菜完整的再生體系，以芽繁芽進行組培快繁生產(chǎn)出來的試管苗無變異發(fā)生，可以保持母本的優(yōu)良性狀，使得這一日趨枯竭的瀕危物種得以保存和繁育。本發(fā)明中，所用到的培養(yǎng)基及激素包括
MS培養(yǎng)基(Murashing and Skoog medium,以下簡稱MS),MS配方中的藥品成分和培養(yǎng)基的具體配制方法為現(xiàn)有公知技術(shù)，在此不再贅述。附加的植物激素為6-節(jié)基氨基嘌呤(benzylaminopurine,簡稱為6-BA)、奈乙酸(naphthylene acetic acid,簡稱為 NAA)、卩引哚丁酸(3_Indolebutyric acid,簡稱為 IBA)、維生素C ( Vitamin C，簡稱VC)。方法包括下述步驟
a、選擇生長健壯，無病蟲害厚葉巖白菜地下生長的帶頂芽的新鮮根狀莖做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面流水沖洗20分鐘，再進行消毒處理。b、將消毒處理后的莖尖在無菌環(huán)境的顯微鏡下繼續(xù)修切為O. 2^0. 5mm大小的芽點，接種到初代培養(yǎng)基上，進行初代培養(yǎng)；
C、將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，該增殖培養(yǎng)基為MS+BAO. 5^3. 5mg -L^+NAAO. 2 I. 5mg · L^+VCO. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35 g · L-1+ 瓊脂 4 8 g · L—1，誘導不定芽；
d、將誘導出的叢生芽分切，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進行壯苗培養(yǎng)；
e、將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長到I.5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，該生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg · I^+IBAO. 5 2· 5 mg · L-1+ VC0. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖15 25g · L—1+瓊脂 4 8g · L-1。f、對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土、腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中進行栽種。步驟a中，取厚葉巖白菜包含頂芽生長點的根狀莖，切取成為長度O. 5^1cm,直徑為O. 3^0. 6cm的圓柱體，并使頂芽生長點位于圓柱體的中央，保留兩片葉柄基部保護生長點，進行消毒處理。步驟a中，先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3 4次，然后用加有2 4滴吐溫80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg · L^1VC)浸泡15 30分鐘，用含O. 5^5. Omg · PVC無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。步驟b中，將步驟a中所得到的無菌外植體在無菌環(huán)境的顯微鏡下繼續(xù)修切為O. 2 O. 5mm大小的芽點，接種到初代培養(yǎng)基MS+6-BA0. 15 O. 25mg L^+NAAO. 15 O. 25mg .171+VC O. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖 25 35g · Γ1+ 瓊脂 4 8 g · L'·步驟c 中，所述的最佳增殖培養(yǎng)基為 MS+BA3mg · L_1+NAA1 mg · I71+ VC2. 5 mg · L-1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6 g · L—1，叢芽增殖率為I :3 5
步驟d中，所述的壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 15 O. 25 mg · I^+IBAO. 15 O. 25mg · Γ1+ VC
O.5 5. Omg · L-1+蔗糖25 35g · L-1+瓊脂4 8 g · Λ苗高可以達到2 3厘米，4 7片葉。步驟e中，所述的最佳生根培養(yǎng)基為l/2MS+NAA2mg · L_1+IBA Img · Γ1+ VC2. 5mg · L-1+蔗糖20g · L-1+瓊脂6g · L_\生根率為85 95 %，平均生根數(shù)3. 37條，根長2 3厘米。步驟b至e中，初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為無菌環(huán)境，光周期為l(Tl5h/d，光照強度150(Γ25001χ，培養(yǎng)溫度為室溫。步驟b至e中，初代培養(yǎng)的周期為22 28天，增殖培養(yǎng)的周期為28 32天，壯苗培養(yǎng)的周期為18 22天，生根培養(yǎng)的周期為28 32天。步驟f中，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6 10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖和腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中，起始6 10天內(nèi)保持苗的葉面濕潤并適當遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照，進行栽種。步驟f中，生根試管苗移栽入混合基質(zhì)的營養(yǎng)成分為草炭土 珍珠巖腐殖質(zhì)=2:1:1。在上述方案的基礎上，步驟a中，所述的外植體長度為O. 5 lcm，可以為O. 5,0. 6、
O.7,0. 8,0. 9、lcm，直徑為 O. 3 O. 6cm，可以為 O. 3,0. 4,0. 5,0. 6 的圓柱體。在上述方案的基礎上，步驟a中，所述的清洗消毒處理的方法包括取厚葉巖白菜根狀莖，用水沖洗干凈，去除葉片和肉質(zhì)根，切成圓柱體，并使根狀莖的生長點位于圓柱體的中央，保留兩片葉柄基部保護生長點，先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3 4次，然后用加有2 4滴吐溫80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg -L^1VC)浸泡15 30分鐘，用含O. 5^5. Omg · L^1VC無菌水沖洗至無殘留無異味，得到無菌的外植體。具體的，72%濃度酒精消毒可以為30s、40s、50s、60s，升汞液濃度可以為O. 1%、
O.15%、0· 2%, VC 濃度可以為 O. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg .Γ1，浸泡時間可以為15、18、20、25、28、30分鐘。
在上述方案的基礎上，步驟b中，所述的芽點大小為O. 2^0. 5mm，可以為O. 2、O. 3、O. 4、0· 5mm大小的芽點。在上述方案的基礎上，步驟b中，所述初代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 15^0. 25mg -L^+NAA
0.15 O. 25mg · L ^VCO. 5 5. Omg · L 1 + 鹿糖 25 35g .L1+ 瓊脂 4 8g · L、具體的，在初代培養(yǎng)基中，6-BA的激素濃度可以為O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25mg ·I/1，NAA 的激素濃度可以為 O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg ·Ι^，VC濃度可以為 O. 5,1. O、
1.5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · Γ1，蔗糖的濃度可以為 25、28、30、32、35 g · Λ瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8 g.L-1。在初代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25 °C，培養(yǎng)周期為22 28天，優(yōu)選25 天。在上述方案的基礎上，步驟c中，所述增殖培養(yǎng)基為MS+BAO. 5^3. 5mg -L^+NAAO. tT
1.5mg · L kVCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35g .L1+ 瓊脂 4 8g · L、具體的，BA的激素濃度可以為 O. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5,2. 8,3. 0,3. 2,3. 5 mg · ΛNAA 的激素濃度可以為 O. 2,0. 4,0. 8,1. 0,1. 2,1. 5 mg · L_\ VC 濃度可以為 O. 5,1. 0,1. 5、
2.0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · L—1，蔗糖的濃度可以為 25,28,30,32,35 g · Λ 瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8 g.L—1。所述的增殖培養(yǎng)基最佳的激素組合及濃度為MS+BA3mg · L—1+NAAlmg · L_1+VC2. 5mg · L—1+ 鹿糖 30g · L—1+ 瓊脂 6g · L—1 ;在增殖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期為28 32天，優(yōu)選30天，由此厚葉巖白菜試管苗的月增殖系數(shù)平均為3. 65。在上述方案的基礎上，步驟d中，所述的壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 15^0. 25mg -L^+IBAO. 15 O. 25mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35g .L1+ 瓊脂 4 8g · L、具體的，在壯苗培養(yǎng)基中，6-BA的激素濃度可以為O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25mg -I/1, IBA 的激素濃度可以為 O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg ·Ι^，VC濃度可以為 O. 5,1. O、
I.5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · Γ1，蔗糖的濃度可以為 25、28、30、32、35 g · Λ瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8 g.L-1。優(yōu)選的壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2mg · I^+IBAO. 2mg · L_1+VC2. 5 mg · Γ1+ 蔗糖30g · Γ1+瓊脂6g · Γ1 ;在壯苗培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期為18 22天，優(yōu)選20天,由此試管苗長至I. 5cm高，比較整齊。在上述方案的基礎上，步驟e中，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1. 5^4. 5mg -L^+IBA
O.5 2. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg · L 1 + 鹿糖 15 25g .L1+ 瓊脂 4 8g · L、具體NAA的激素濃度可以為 I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,3. 8,4. 0,4. 2,4. 5 mg · Λ IBA的激素濃度可以為 O. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5 mg · L_\ VC 濃度可以為 O. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5、
3.0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · L—1，蔗糖的濃度可以為 15、18、20、22、25 g · L—1，瓊脂的濃度可以為 4、5、6、7、8 g · L'所述的生根培養(yǎng)基最佳的激素和礦質(zhì)元素及碳源組合濃度值為l/2MS+NAA2mg · L^+IBAlmg · L_1+VC 2. 5mg · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 瓊脂 6 g · Γ1 ;培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25°C，生根培養(yǎng)的周期為28 32天，優(yōu)選30天。由此生根率最高可達95%，平均生根條數(shù)為3. 37條，誘導生成的根比較粗壯。在上述方案的基礎上，步驟f中，將生根試管苗至于自然環(huán)境中6 10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖和腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中，一般草炭土 珍珠巖腐殖質(zhì)=2:1:1,起始6 10天(一般為一周)內(nèi)采用噴霧保持苗的葉面濕潤，相對濕度為95%左右，并適當遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明采用快繁技術(shù)極大加快了厚葉巖白菜的繁殖速度，年繁殖系數(shù)由自然狀態(tài)下的I :2，提高到I :600000，成本由原來的每株8 10元，降低至每株2 3元。且不受季節(jié)限 制，環(huán)境易控，適合全國各地，解決了厚葉巖白菜繁殖慢、種苗參差不齊等問題。直接器官發(fā)生的方式由于不經(jīng)過愈傷組織階段，可以減少變異植株的產(chǎn)生，為快繁中保持種質(zhì)資源的優(yōu)良特性提供保障，生產(chǎn)得到的厚葉巖白菜種苗品質(zhì)高，一致性好，具有廣闊的市場前景。


圖I為本發(fā)明初代培養(yǎng)外植體；
圖2為本發(fā)明外植體萌發(fā) 圖3為本發(fā)明誘導增殖 圖4為本發(fā)明壯苗培養(yǎng) 圖5為本發(fā)明生根培養(yǎng) 圖6為本發(fā)明煉苗移栽圖。
具體實施例方式本實施例中的基本培養(yǎng)基中所用藥劑和各類激素均由sigma公司購得?！N厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，厚葉巖白菜外植體經(jīng)初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得再生植株，進行移栽，包括下述步驟
第一巖白菜屬植物主要含有三大類物質(zhì)酚類、黃酮類以及多糖類等，極容易引起離體培養(yǎng)中植物材料的褐變，因此消毒處理中外植體不能修切過小。厚葉巖白菜根狀莖粗大，長期深埋于土壤中，感染各種外源微生物機會多，因此消毒獲得完全無菌的材料非常困難。經(jīng)過反復實驗，本發(fā)明得到以下最佳外植體處理方式于天氣晴朗的中午，選擇生長健壯，無病蟲害厚葉巖白菜帶頂芽的根狀莖做為外植體，切取成為長度O. 5^1cm,直徑為O. 3^0. 6cm的圓柱體，并使頂芽生長點位于圓柱體的中央，保留兩片葉柄基部保護生長點，以減弱消毒處理時消毒液對生長點分生細胞的傷害。先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3 4次，然后用加有2 4滴吐溫80的O. Γθ. 2%的升汞液(含O. 5^5. Omg · IZ1VC)浸泡15 30分鐘,用含O. 5^5. Omg · L^1VC無菌水沖洗至無殘留無異味。第二 有報道巖白菜屬植物中存在眾多內(nèi)生菌，一般情況下，莖尖分生組織細胞內(nèi)內(nèi)生菌分布較少，所以本發(fā)明在步驟a中消毒所得到的無菌外植體需要在無菌環(huán)境的顯微鏡下繼續(xù)修切為O. 2^0. 5_大小的芽點，得到如圖I所示的本發(fā)明初代培養(yǎng)的外植體。再接種到初代培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 15 O. 25 mg · L、NAA0· 15 O. 25mg · Γ1+ VC O. 5 5. Omg · Γ1+蔗糖25 35g · L—1+瓊脂4 8g · L'培養(yǎng)基pH調(diào)為5. 8左右，一個試管接種一個，避免交叉感染，于光周期為12h/d，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的無菌室內(nèi)培養(yǎng)25天左右開始萌發(fā)。圖2為本發(fā)明外植體萌發(fā)圖。無菌操作室在使用前30分鐘，打開紫外燈和超凈工作臺，紫外燈在關(guān)閉10分鐘后，才可進行接種操作；接種用具在121°C條件下高壓滅菌35分鐘，培養(yǎng)基在121°C條件下高壓滅菌18分鐘。第三將初代培養(yǎng)獲得的健壯一致的無菌苗轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基MS+BAO. 5^3. 5mg · Γ1+NAAO· 2 I. 5mg -L^+VCO. 5 5. Omg .L—1+ 蔗糖 25 35g .L—1+ 瓊脂 4 8g · Λ 結(jié)果表明，厚葉巖白菜增殖需要濃度較高的細胞分裂素，當BA為Img · Γ1時，增殖速度非常 緩慢，當BA濃度為3 mg *L_1時,對厚葉巖白菜叢生芽的增殖效果最好,而當濃度達到3. 5mg *L_1時,厚葉巖白菜又非常容易出現(xiàn)玻璃化的畸形現(xiàn)象，添加生長素對厚葉巖白菜的增殖有促進作用。本發(fā)明中所述的增殖培養(yǎng)基最佳的激素組合及濃度為MS+BA3mg · L^+NAAlmg · \l+W2. 5
mg · L—1+鹿糖30g · L—1+瓊脂6g · L—1 ;在增殖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期優(yōu)選30天，厚葉巖白菜試管苗的月增殖系數(shù)平均為3. 65。圖3為本發(fā)明誘導增殖圖，誘導出的叢生芽發(fā)育正常，葉色濃綠，長勢旺盛，可以做為厚葉巖白菜擴繁增殖的培養(yǎng)基。第四在增殖培養(yǎng)基上，厚葉巖白菜試管苗生長高度參差不齊，將叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 15 O. 25mg · L_1+IBA0. 15 O. 25mg · L_1+VC0. 5 5. Omg · Γ1+ 蔗糖25 35g · I/1+瓊脂4 8g · L'本發(fā)明優(yōu)選的壯苗培養(yǎng)基為MS+6_BA0. 2mg · Γ'+ΙΒΑΟ. 2m
蔗糖3(^171+瓊脂6 g-Γ1 ;在壯苗培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期優(yōu)選20天，試管苗長至I. 5cm高，比較整齊可以用來誘導生根，圖4為本發(fā)明壯苗培養(yǎng)圖。第五元素減半的1/2MS比MS更有利于生根，本發(fā)明中生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1
5 4. 5mg · L_1+IBA0. 5 2. 5mg · L-1+VC O. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 瓊脂 4 8g · L'當NAA濃度為I mg · Γ1時，生根率比較低；當上調(diào)至4. 5 mg · Γ1時，生根率雖然可以達到100%，但是在試管苗的基部容易出現(xiàn)愈傷化組織，不利于后期的移栽；蔗糖含量為20 g-L-1時，也能夠提高生根率及平均生根數(shù)。厚葉巖白菜生根培養(yǎng)時最佳的激素和礦質(zhì)元素及碳源組合濃度值為1/2MS+NAA 2mg · L_1+IBA Img · I^+VC 2· 5 mg · Γ1+ 蔗糖 20 g · Γ1+ 瓊脂6 g · L-1 ;培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選250C，生根培養(yǎng)的周期優(yōu)選30天。由此生根率最高可達95%，平均生根條數(shù)為3. 37條，誘導生成的根比較粗壯，圖5為本發(fā)明生根培養(yǎng)圖。第六步將厚葉巖白菜生根試管苗置于自然環(huán)境中6 10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖和腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中，本發(fā)明中草炭土 珍珠巖腐殖質(zhì)=2:1:1,起始6 10天(一般為一周)內(nèi)采用噴霧保持苗的葉面濕潤，相對濕度為95%左右，并適當遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照。厚葉巖白菜成活率可以達到90%。圖6為本發(fā)明煉苗移栽圖。采用本發(fā)明所提供的方法，對加快厚葉巖白菜的繁殖速度，是一種很有效的途徑，一旦得到無菌苗后，可以利用無菌苗誘導出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生為完整植株，形成了一個良好的生產(chǎn)體系。年繁殖系數(shù)由自然狀態(tài)下的1:2，提高到1:600000，成本由原來的每株8 10元，降低至每株2 3元。且不受季節(jié)限制，環(huán)境易控，適合全國各地，解決了厚葉巖白菜繁殖慢、種苗參差不齊等問題。直接器官發(fā)生的方式由于不經(jīng)過愈傷組織階段，可以減少變異植株的產(chǎn)生，為快繁中保持種質(zhì)資源的優(yōu)良特性提供保障，生產(chǎn)得到的厚葉巖白菜種苗品質(zhì)高，一致性好，具有廣闊的市場前景。·
權(quán)利要求
1.一種厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，取厚葉巖白菜外植體在無菌環(huán)境下，經(jīng)初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得再生植株，進行栽種，其特征在于按下列步驟進行 所述的初代培養(yǎng)選擇并清洗、消毒處理帶頂芽的新鮮根狀莖獲得起始的無菌外植體，在無菌環(huán)境的顯微鏡下修切為O. 2^0. 5_大小的芽點，接種到初代培養(yǎng)基上，進行初代培養(yǎng)，獲得初代培養(yǎng)的無菌苗，所述的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 15 O. 25mg · I/1+NAAO· 15 O. 25mg · L-1+VC0. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35g · L-1+瓊脂 4 8g · L 1 ; 所述的增殖培養(yǎng)是將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，誘導不定芽，該增殖培養(yǎng)基為MS+BA0. 5 3. 5mg · L ^NAAO. 2 I. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35 g · L :+ 瓊脂4^8 g .171,誘導出叢生芽； 所述的壯苗培養(yǎng)將誘導出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進行壯苗培養(yǎng)，獲得高度為I. 5cm以上的試管苗； 所述的生根培養(yǎng)將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長到I. 5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，獲得生根試管苗，該生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg Γ'+ΙΒΑΟ. 5 2· 5 mg Γ1+ VCO. 5 5· Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 瓊脂 4 8g · L-1 ； 最后，對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土、腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中進行栽種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，獲得無菌外植體的方法是取厚葉巖白菜包含頂芽生長點的根狀莖，切取成為長度O. 5 lcm，直徑為O. 3^0. 6cm的圓柱體，并使頂芽生長點位于圓柱體的中央，保留兩片葉柄基部保護生長點，用洗潔精擦洗表面流水沖洗20分鐘，再進行消毒處理，并將消毒處理后的莖尖在無菌環(huán)境的顯微鏡下繼續(xù)修切為O. 2^0. 5mm大小的芽點。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，對外植體清洗、消毒處理方法是先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3 4次，然后用加有2 4滴吐溫80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg · L、C)浸泡15 30分鐘，用含O. 5^5. O mg · PVC無菌水沖洗至無殘留，得到無菌外植體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，所述的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA3mg · L_1+NAAlmg · L_1+VC2. 5mg · L-1 + 鹿糖 30g · L-1+ 瓊脂 6 g · L-1,叢生芽增殖率為1:3 5。
5.根根據(jù)權(quán)利要求I所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，所述的壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 15 O. 25mg L^+IBAO. 15 O. 25mg L^+VCO. 5 5. Omg .171+ 蔗糖 25 35 g .171+瓊脂4 8 g · L—1，試管苗的苗高達到2 3厘米，4 7片葉。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，最佳生根培養(yǎng)基為l/2MS+NAA2mg · L ^IBAlmg .L1+ VC2. 5 mg · L :+ 鹿糖 20 g · L :+ 瓊脂 6 g · L S 生根率為85、5%，平均生根數(shù)3. 37條，根長2 3厘米。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的的方法，其特征在于所述的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為無菌環(huán)境，光周期為l(Tl5h/d，光照強度150(Γ25001χ，培養(yǎng)溫度為室溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，所述初代培養(yǎng)的周期為22 28天，增殖培養(yǎng)的周期為28 32天，壯苗培養(yǎng)的周期為18 22天，生根培養(yǎng)的周期為28 32天。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6 10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖和腐殖質(zhì)的混合基質(zhì)中，起始6 10天內(nèi)保持苗的葉面濕潤并遮陽，其 后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照，進行栽種。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，其特征在于，生根試管苗移栽入混合基質(zhì)的營養(yǎng)成分為草炭土 珍珠巖腐殖質(zhì)=2:1:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及厚葉巖白菜離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，選擇帶頂芽的新鮮根狀莖做為無菌外植體，接種到初代培養(yǎng)基中，進行初代培養(yǎng)；將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基為MS+BA0.5~3.5mg·L-1+NAA0.2~1.5mg·L-1+VC0.5~5.0mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+瓊脂4~8g·L-1，誘導不定芽；將誘導出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進行壯苗培養(yǎng)；試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA1.5~4.5mg·L-1+IBA0.5~2.5mg·L-1+VC0.5~5.0mg·L-1+蔗糖15~25g·L-1+瓊脂4~8g·L-1；生根試管苗清洗移至基質(zhì)中栽種。本發(fā)明年繁殖系數(shù)提高到1600000，成本降至每株2~3元，且不受季節(jié)限制，環(huán)境易控，減少變異植株的產(chǎn)生，種苗品質(zhì)高，一致性好。
文檔編號A01H4/00GK102948367SQ20121006961
公開日2013年3月6日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者呂秀立, 王健, 沈烈英, 崔心紅, 張春英, 孫偉墨 申請人:上海市園林科學研究所