專利名稱：一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是一種以子葉為外植體的黃連木植株高效再生方法。
背景技術(shù)：
黃連木是我國發(fā)展生物柴油產(chǎn)業(yè)首選的木本能源植物，在我國大部分地區(qū)均可生長和種植，適于在邊際土地上生長。其種子含油率可達(dá)42.5%，出油率達(dá)20%-30%。以黃連木油為原料生產(chǎn)的生物柴油油質(zhì)好。因此，黃連木被國家列為“十一五”期間重點(diǎn)開發(fā)的主要生物質(zhì)能源樹種，極具發(fā)展?jié)摿?。種子育苗是目前黃連木的主要育苗方法，然后進(jìn)行移栽。由于黃連木屬深休眠類型，必須進(jìn)行低溫沙藏100天以上和脫蠟處理等才能發(fā)芽。即便如此，其發(fā)芽率也在40%以下，而且種子是榨取生物柴油原料油的部位，利用種子直接發(fā)芽繁殖效率較低，而且對一些優(yōu)良種質(zhì)無法進(jìn)行快速繁殖和推廣，遠(yuǎn)不能滿足對種苗的需求及黃連木產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。 另外，由于沒有一個高效的再生體系，使得黃連木在分子遺傳改良方面處于一片空白。因此，急需開發(fā)一種黃連木高效再生的方法，以滿足當(dāng)前黃連木大量種苗的需求及分子遺傳改良的需要。黃連木子葉再生是指從實(shí)生苗培養(yǎng)基上獲得無菌苗，然后切取子葉，并沿胚軸中軸線縱切，將獲得的兩片子葉分別接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過兩周左右培養(yǎng)，切取幼芽接種在叢生芽增殖培養(yǎng)基上，可以誘導(dǎo)大量叢生芽，將每個誘導(dǎo)的叢生芽分開，分別誘導(dǎo)生根，從而可以獲得大量的黃連木幼苗。目前通過胚軸、葉片等其它外植體進(jìn)行快繁的效率極低，并且產(chǎn)生的后代植株容易產(chǎn)生變異。如采用子葉誘導(dǎo)的方式進(jìn)行再生繁殖，不僅再生效率高、出現(xiàn)變異的幾率極低，最為重要的是為黃連木進(jìn)行分子遺傳改良提供了技術(shù)支持。黃連木種苗的獲得可以通過種子進(jìn)行繁殖，但受季節(jié)的限制，通常黃連木種子的貨架期為一年左右。秋季采摘的種子需要100天以上的低溫沙藏及脫蠟處理來打破休眠才能發(fā)芽，而且種子的發(fā)芽率低，最高可達(dá)40%。同時由于黃連木組織內(nèi)含有大量的多酚類次級代謝物，使得簡單易行的扦插繁殖等方法的實(shí)施非常困難。另外，通過分子生物學(xué)手段對黃連木進(jìn)行遺傳改良也需要建立一種高效、快速的黃連木子葉再生方法。目前有關(guān)黃連木子葉再生的方法還未見報道，黃連木子葉再生的方法技術(shù)將為我國首選木本能源植物黃連木的快速繁殖和分子遺傳改良提供技術(shù)支持，以打破有關(guān)該研究幾乎空白的局面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以子葉為外植體的黃連木植株高效再生方法，利用這種方法每個種子實(shí)生苗可以一次性獲得4-8棵苗，且獲得的再生苗變異率低。
上述目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)
一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于包括以下步驟A、將飽滿的黃連木種子去掉外面硬種皮，經(jīng)過消毒后進(jìn)行漂洗，接種在實(shí)生苗生長培養(yǎng)基上，得黃連木無菌實(shí)生苗；
B、取生長12-18d的黃連木無菌實(shí)生苗，在無菌超凈臺內(nèi)沿胚軸中軸線縱切以切取子葉，將獲得的兩片子葉分別接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16d后，得幼芽；
C、將幼芽切下轉(zhuǎn)移至叢生芽增殖培養(yǎng)基，得誘導(dǎo)的叢生芽，然后將叢生芽切取轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根，從而獲得完整的黃連木植株；
所述的實(shí)生苗生長培養(yǎng)基是指=IADKW基本培養(yǎng)基，不添加任何激素；所述的子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有機(jī)及Fe-EDDHA) +6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述叢生芽增殖培養(yǎng)基是指1/2WPM+DKW (WPM大量，DKW微量、有機(jī)及i^e-EDDHA) +6-BA3. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培養(yǎng)基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于步驟A所述的消毒是指在濃度為60%-80%的乙醇中浸泡0. 5-1. 5分鐘，之后再在濃度為0. 05%-0. 15%的HgCl2浸泡6-10分鐘，期間不停的搖動。一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于步驟C所述的每個幼芽可誘導(dǎo)2-4個叢生芽。本發(fā)明的有益效果為
1、利用本發(fā)明進(jìn)行再生繁殖不僅再生效率高，而且出現(xiàn)變異的幾率極低；
2、利用本發(fā)明進(jìn)行再生繁殖可以不必經(jīng)過長時間的低溫沙藏等打破休眠的處理，利用任何時期有活力的種子直接快速繁殖黃連木幼苗，從而節(jié)約了時間，避免了人力、財力、物力的過分集中使用和浪費(fèi)，節(jié)約了時間，提高了有關(guān)育苗和相關(guān)實(shí)驗(yàn)的靈活性和機(jī)動性，而且繁殖效率大大提高，可以快速為黃連木能源林的建設(shè)提供充足的種苗；
3、本發(fā)明為黃連木的分子改良特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)。目前通過胚軸、 葉片等其它外植體進(jìn)行快繁的效率極低，并且產(chǎn)生的后代植株容易產(chǎn)生變異。


圖1為實(shí)生苗生長培養(yǎng)基上的黃連木無菌實(shí)生苗示意圖； 圖2為接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基的子葉示意圖； 圖3為誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的幼芽示意圖； 圖4為叢生芽增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的叢生芽示意圖； 圖5為轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基的切取叢生芽示意圖； 圖6為生根培養(yǎng)基上長出根系的叢生芽示意圖； 圖7為移栽后長出的完整的再生植株示意圖。
具體實(shí)施例方式參見圖1-圖7，一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，包括以下步驟
A、將飽滿的黃連木種子去掉外面硬種皮，經(jīng)過消毒后進(jìn)行漂洗，接種在實(shí)生苗生長培養(yǎng)基上，得黃連木無菌實(shí)生苗；B、取生長15d的黃連木無菌實(shí)生苗，在無菌超凈臺內(nèi)沿胚軸中軸線縱切以切取子葉， 將獲得的兩片子葉分別接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14d后，得幼芽；
C、將幼芽切下轉(zhuǎn)移至叢生芽增殖培養(yǎng)基，得誘導(dǎo)的叢生芽，然后將叢生芽切取轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，長出3條健壯的根系健壯的根系，然后進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練，最終長成一棵完整的再生植株；
所述的實(shí)生苗生長培養(yǎng)基是指=IADKW基本培養(yǎng)基，不添加任何激素；所述的子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有機(jī)及Fe-EDDHA) +6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述叢生芽增殖培養(yǎng)基是指1/2WPM+DKW(WPM大量，DKW微量、有機(jī)及i^e-EDDHA) +6-BA3. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培養(yǎng)基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0所述的一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，步驟A所述的消毒是指在 70%的乙醇中浸泡1分鐘，之后再用0. 1%的HgCl2浸泡8分鐘，期間不停的搖動。所述的一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，步驟C所述小芽平均每個誘導(dǎo)3個叢生芽。
權(quán)利要求
1.一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于包括以下步驟A、將飽滿的黃連木種子去掉外面硬種皮，經(jīng)過消毒后進(jìn)行漂洗，接種在實(shí)生苗生長培養(yǎng)基上，得黃連木無菌實(shí)生苗；B、取生長12-18d的黃連木無菌實(shí)生苗，在無菌超凈臺內(nèi)沿胚軸中軸線縱切以切取子葉，將獲得的兩片子葉分別接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16d后，得幼芽；C、將幼芽切下轉(zhuǎn)移至叢生芽增殖培養(yǎng)基，得誘導(dǎo)的叢生芽，然后將叢生芽切取轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根，從而獲得完整的黃連木植株；所述的實(shí)生苗生長培養(yǎng)基是指1/2DKW基本培養(yǎng)基，不添加任何激素；所述的子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指l/2WPM+DKW+6-BA2. Omg/L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+葡萄糖 20g/L+瓊脂粉8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述叢生芽增殖培養(yǎng)基是指l/^WPM+DKW+e-BAS. Omg/ L+ IBAO. 5mg/L+GA0. 5 mg/L +PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L，pH=5. 8-6. 0 ；所述的生根培養(yǎng)基是指1/2WPM+IBA1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP2g/L+ 葡萄糖 20g/L+ 瓊脂粉 8g/L， pH=5. 8-6. O0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于 步驟A所述的消毒是指在濃度為60%-80%的乙醇中浸泡0. 5-1. 5分鐘，之后再在濃度為 0. 05%-0· 15%的HgCl2浸泡6-10分鐘，期間不停的搖動。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，其特征在于 步驟C所述的每個幼芽可誘導(dǎo)2-4個叢生芽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以子葉為外植體的黃連木植株再生方法，將飽滿的黃連木種子去掉外面硬種皮，經(jīng)過消毒后進(jìn)行漂洗，接種在實(shí)生苗生長培養(yǎng)基上，得黃連木無菌實(shí)生苗，再取生長12-18d的黃連木無菌實(shí)生苗，在無菌超凈臺內(nèi)沿胚軸中軸線縱切以切取子葉，將獲得的兩片子葉分別接種在子葉誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-16d后，得幼芽，將幼芽切下轉(zhuǎn)移至叢生芽增殖培養(yǎng)基，得誘導(dǎo)的叢生芽，然后將叢生芽切取轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根，從而獲得完整的黃連木植株。利用本發(fā)明進(jìn)行再生繁殖，不僅再生效率高、出現(xiàn)變異的幾率極低，而且為黃連木進(jìn)行分子遺傳改良提供了技術(shù)支持。
文檔編號A01H4/00GK102301959SQ20111023515
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者吳麗芳, 李明浩 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院