專利名稱：狼尾蕨葉片誘導不定芽高頻率植株再生方法
技術領域：
本發(fā)明狼尾蕨葉片誘導不定芽高頻率植株再生方法，涉及一種適用于蕨類植物體 細胞離體培養(yǎng)植株再生與試管苗微繁殖技術，屬于植物培養(yǎng)方法技術領域。
背景技術：
截止目前，在12000種蕨類植物中，成功進行組織培養(yǎng)的僅占極少一部分，部分屬種雖 已組培成功，但存在周期長，增殖率不高的問題(韓敬，趙莉.蕨類植物繁殖研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33(7): 1 廣1263)。與孢子作外植體相比，利用孢子體上的根狀莖 莖尖、嫩葉等作外植體進行組培有成苗速度快等優(yōu)點。因而，以孢子體為外植體的蕨類植物 組培研究是蕨類組培研究的重點之一(蔣盛軍，宋希強，王勝培，等.蕨類植物組織培養(yǎng)研 究進展[J].園藝學報，2002, 29(增刊):65廣656)。W^WdDavallia bullata)屬于蕨類植物水龍骨目QPolypodiales、骨碎補科 QMvalliaceae)。李文安等以狼尾蕨帶有孢子的葉片為外植體材料，從孢子萌發(fā)、誘導產(chǎn) 生葉原體到長成具有根、莖、葉的小植株長達一年以上(李文安，王玉琴.狼尾蕨的離體培 養(yǎng)[J].植物生理學通訊，1990(3): 44)。李華賜等以鹿角蕨的葉片為外植體，0.1 1.0 mg/L BAP有利于不定芽的誘導和增殖(李華賜，陳志紅.鹿角蕨的組織培養(yǎng)[J].植物生 理學通訊，1988 ): 58)。在腎蕨屬植物根狀莖尖培養(yǎng)中，Loescher認為誘導不定芽發(fā)生 無需外源激素，但KT可以促進不定芽的形成和增殖，而BAP則起抑制作用(Loescher W H and Albrecht C N. Development in vitro of Nephrolepis exaltala cv. Bostoniensis runner tissues[J], Physiol Plant, 1979，47: 250 254 )。Camloh指出 BAP可以促進 二叉鹿角蕨蓮端葉片形成不定芽(Camloh M, Gogala N and Rode J. Plant regeneration from leaf explants of the fern Platycerium bifureaturn in vitro[J]. Scientia Horticulture, 1994， 56: 257 266)。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明要解決的技術問題和提出的技術任務是以狼尾蕨的葉片為外 植體材料，通過選用苯基脲類細胞分裂素CPPU誘導和增殖不定芽，提高不定芽的成苗率， 建立高頻率植株再生技術體系。技術方案
狼尾蕨葉片誘導不定芽高頻率植株再生方法，包括
1)材料
選用狼尾蕨無菌苗的葉片為材料；
2)培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與&維生素組成，添加蔗糖30 g/L，8 g/L的 瓊脂條作為固化劑；
不定芽誘導培養(yǎng)基附加苯基脲類細胞分裂素CPPU 2. 0 mg/L和IBA 0. 1 mg/L ；不定芽增殖培養(yǎng)基附加苯基脲類細胞分裂素CPPU 0. 5 mg/L和IBA 0. 1 mg/L ；
成苗和生根培養(yǎng)基附加生長素IBA 0. 2 mg/L，活性炭0. 1% ； 上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整PH值至5. 8 ； 3)方法
在超凈工作臺上剪取狼尾蕨無菌苗的葉片，接種在步驟2)所述不定芽誘導培養(yǎng)基上， 20 d左右從葉片誘導產(chǎn)生出不定芽；不定芽轉到步驟2)所述不定芽增殖培養(yǎng)基上進行繼 代增殖培養(yǎng)，30 d為一個周期；不定芽轉移到步驟2)所述成苗和生根培養(yǎng)基上，發(fā)育成具 有根、莖、葉的完整小植株；
不定芽的誘導和增殖、成苗和生根培養(yǎng)均在光照條件下進行，光照強度為1500 lx，光 照時間為12 h/d ；培養(yǎng)室溫度為士2°C。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點和積極效果
本發(fā)明選用苯基脲類細胞分裂素CPPU從狼尾蕨葉片誘導產(chǎn)生正常狀態(tài)的葉芽狀不定 芽比例達95%左右，葉芽的成苗率達100% ;BAP誘導和增殖非正常狀態(tài)的葉狀體不定芽，成 苗率僅為6% ；KT誘導產(chǎn)生較高比例正常狀態(tài)的葉芽狀不定芽，但增殖的不定芽呈現(xiàn)玻璃 化和軟腐現(xiàn)象，成苗率為40%。國內外學者在腎蕨科和鹿角蕨科蕨類植物上選用BAP和KT從葉片誘導和增殖不 定芽，植株再生技術尚停留在研究階段。本發(fā)明首次建立起骨碎補科的狼尾蕨葉片誘導不 定芽高頻率植株再生技術，達到實用化程度，為開展蕨類植物微繁殖、體細胞突變體篩選和 轉基因工作可提供借鑒。


圖1 CPPU誘導的不定芽。圖2 BAP誘導和增殖的不定芽。圖3 CPPU誘導和增殖的不定芽。圖4完整小植株。
具體實施方式
1.材料和方法
1. 1試驗材料
以蕨類植物水龍骨目(Mypodiales)骨碎補科OferaBiaceae)的狼尾蕨OferaBia bullata )無菌苗(狼尾蕨種苗購自南京萬博花卉市場，無菌苗由本實驗室培育)的葉片為外 植體。培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T, Skoog F. A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol plant, 1962，15:473 497 )和化維生素(Gamborg 0 L, Miller R A, Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J]. Exp. Cell Res., 1968. 50:151 158)組成，為植物組織培養(yǎng)中一種常用的培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，瓊脂條(乘 風牌，福建泉州市泉港化工廠)8 g/L；
不定芽誘導培養(yǎng)基分別附加2. 0 mg/L的6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)，激動素(簡稱KT，南京生興生物技術有限公司)和苯基脲類細胞分裂素(簡 稱CPPU，南京生興生物技術有限公司)；
不定芽增殖培養(yǎng)基分別附加0. 5 mg/L的6-芐基氨基嘌呤(簡稱BAP，上海雪滿生物 科技有限公司)，激動素(簡稱KT，南京生興生物技術有限公司)和苯基脲類細胞分裂素(簡 稱CPPU，南京生興生物技術有限公司)；
成苗和生根培養(yǎng)基附加0. 2 mg/L生長素吲哚丁酸(簡稱IBA，上海源聚生物科技有限 公司)，0. 1%活性炭(南京助研生物技術有限公司)；
培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整PH值至5. 8。方法
以1)狼尾蕨無菌苗的葉片為材料，在2)不定芽誘導培養(yǎng)基上20 d左右誘導產(chǎn)生不定 芽；帶有不定芽的葉片轉移到2)不定芽增殖培養(yǎng)基上，30 d為一個周期，不定芽繼代增殖； 不定芽轉移到2)成苗和生根培養(yǎng)基上，25 d左右形成具有根、莖、葉的完整再生植株；離體 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26士20C，光照強度為1500 lx，光照時間為16 h/d。結果
2. 1細胞分裂素對葉片誘導不定芽的影響
狼尾蕨無菌苗的葉片接種在附加KT 2. 0 mg/L、IBA 0. 1 mg/L和CPPU 2. 0 mg/L、IBA 0.1 mg/L的誘導培養(yǎng)基上，20 d左右誘導產(chǎn)生不定芽，30 d左右形成密集的葉狀體芽并 伴隨肉眼可見的葉芽狀不定芽(圖1);而在添加BAP 2.0 mg/L, IBA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上， 僅誘導產(chǎn)生密集的葉狀體芽，未見葉芽狀不定芽。
表 ι對葉片
細胞分裂索種類接種葉片數(shù)不定芽的葉片數(shù)不定芽誘導率芽狀態(tài)KT19218294.79葉芽CPPU19318696.37葉芽BAP19417791 24葉伏體表1結果顯示在附加2. 0 mg/L KT、CPPU或BAP的不定芽誘導培養(yǎng)基上，不定芽 的誘導頻率均在90%以上，但誘導產(chǎn)生的不定芽的狀態(tài)有明顯差異，KT和CPPU有利于誘導 產(chǎn)生正常狀態(tài)的葉芽狀不定芽。細胞分裂素對不定芽增殖的影響
在附加CPPU 0.5 mg/L、IBA 0.1 mg/L的不定芽增殖培養(yǎng)基上，前期來自添加KT或 CPPU培養(yǎng)基上的葉狀體芽均轉而形成正常狀態(tài)的葉芽狀不定芽(圖2)，而前期來自BAP培 養(yǎng)基上的葉狀體芽基本保持非正常狀態(tài)的葉狀體不定芽，僅個別的葉狀體芽形成葉芽狀不 定芽。前期來自添加KT培養(yǎng)基上的不定芽轉到附加KT 0. 5 mg/L、IBA 0. 1 mg/L的不定 芽增殖培養(yǎng)基上，多數(shù)芽轉而形成正常狀態(tài)的葉芽狀不定芽，但仍有部分芽保持葉狀體狀。 前期來自BAP培養(yǎng)基上的不定芽轉到附加BAP 0.5 mg/L、IBA 0.1 mg/L的不定芽增殖培養(yǎng) 基上，芽均保持密集的葉狀體狀(圖3)。0. 5 mg/L KT、CPPU或BAP對不定芽的增殖效率基本相當，每代增殖系數(shù)約為5。
權利要求
1.狼尾蕨葉片誘導不定芽高頻率植株再生方法，其特征在于1)材料選用狼尾蕨無菌苗的葉片為材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS大量元素、MS微量元素與&維生素組成，添加蔗糖30 g/L，8 g/L的 瓊脂條作為固化劑；不定芽誘導培養(yǎng)基附加苯基脲類細胞分裂素CPPU 2. 0 mg/L和IBA 0. 1 mg/L ； 不定芽增殖培養(yǎng)基附加苯基脲類細胞分裂素CPPU 0. 5 mg/L和IBA 0. 1 mg/L ； 成苗和生根培養(yǎng)基附加生長素IBA 0. 2 mg/L，活性炭質量比0. 1% ； 上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整PH值至5. 8 ；3)方法在超凈工作臺上剪取狼尾蕨無菌苗的葉片，接種在步驟2)所述不定芽誘導 培養(yǎng)基上，20 d從葉片誘導產(chǎn)生出不定芽；不定芽轉到步驟2)所述不定芽增殖培養(yǎng)基 上進行繼代增殖培養(yǎng)，30 d為一個周期；不定芽轉移到步驟2)所述成苗和生根培養(yǎng)基上， 發(fā)育成具有根、莖、葉的完整小植株；不定芽的誘導和增殖、成苗和生根培養(yǎng)均在光照條件下進行，光照強度為 1500 lx，光照時間為12 h/d ；培養(yǎng)室溫度為士2°C。
全文摘要
狼尾蕨葉片誘導不定芽高頻率植株再生方法，屬于植物培養(yǎng)方法技術領域?，F(xiàn)有的蕨類植物不定芽誘導植株再生技術尚停留在實驗室研究階段，且限于鹿角蕨科和腎蕨科。本發(fā)明以骨碎補科狼尾蕨無菌苗的葉片為外植體材料，在附加苯基脲類細胞分裂素CPPU2.0mg/L和吲哚丁酸IBA0.1mg/L的培養(yǎng)基上誘導不定芽發(fā)生，不定芽誘導頻率達95%。在添加CPPU0.5mg/L和IBA0.1mg/L的培養(yǎng)基上進行不定芽增殖，不定芽每代增殖系數(shù)為5。不定芽在附加IBA0.2mg/L的培養(yǎng)基上成苗率達100%，并發(fā)育成具有根、莖、葉的完整小植株。本方法適用于狼尾蕨試管苗繁殖，為開展體細胞突變體篩選和基因轉化研究工作提供條件。
文檔編號A01H4/00GK102138522SQ20101061235
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權日2010年12月30日
發(fā)明者佘建明, 葉曉青, 湯日圣, 童紅玉, 鄧衍明 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院