專利名稱：太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物無性繁殖方法，尤其是一種太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方 法。
背景技術(shù)：
太^于菊(Opisthopappus taihangensis (Ling) Shih)是太ti菊屬(Opisthopappus Shih)植物，分布范圍狹窄，生存環(huán)境獨特，大多生長在人們難以到達、非常險峻的懸崖石 縫中，為我國太行山區(qū)特有珍稀物種，僅見于豫、晉、冀三省交界的太行山區(qū)，為國家珍稀 瀕危保護植物(參看丁保章，王遂義，河南植物志(第三卷)，鄭州，河南科技出版社， J998. 632)。目前對太行菊組織培養(yǎng)的研究僅有兩篇報道，采用了莖段、莖頂芽作為外植體 (姚連芳，河南科技學(xué)院園藝系；朱根發(fā)，白鶴芋屬植物的組織培養(yǎng)和快速繁殖，中國農(nóng)學(xué) 通報，2003，(3) 75 76)。但對太行菊無菌苗體系建立的操作方法及技術(shù)都未給出可實施 的指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，對太行菊 無菌苗體系的建立給予詳細的指導(dǎo)，尤其是給出其誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基、生根 培養(yǎng)基的最佳配方，具有極強的可實施性與可重復(fù)性，能夠一次繁殖大量太行菊幼苗。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖 方法，其包含以下步驟A、外植體獲取從太行菊無菌苗上采取外植體；B、誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)上步所得外植體材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，設(shè)定 光照強度為2000LX，光照時長為12h/d，培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織；所述誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的成分 為MS培養(yǎng)基+0. 5mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的瓊脂+3%重量分數(shù)的 蔗糖；C、增殖繼代培養(yǎng)選取結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地脆硬、細胞呈不規(guī)則球形或近等徑型、生長 較慢、顏色為淡綠色的愈傷組織接種到增殖繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，此后每20天繼代一 次，繼代4 5次后芽體變得茁壯，并逐漸長出綠色小葉，形成完整的太行菊小植株體；所述 增殖繼代培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的 瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；D、生根培養(yǎng)將生長高度在2cm以上的無菌苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，接種時注意 保持芽體原有的形態(tài)學(xué)上下端，使生根端進入培養(yǎng)基，保持植株直立且穩(wěn)定，在恒溫光照 培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d 60d，培養(yǎng)溫度為25士2°C，光照時間為12h/d 14h/d，光照強度為 1800LX 2000LX ；所述生根培養(yǎng)基的成分為1/2MS培養(yǎng)基+0. 4mg/L的ΝΑΑ+0. 65%重量分 數(shù)的瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；
E、馴化與移栽上步所得生根幼苗經(jīng)室溫馴化，然后移栽至基質(zhì)，即得大量太行菊 幼苗。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟A所述外植體獲取的具體步驟為A-1、種子預(yù)處理選取籽粒飽滿的太行菊種子，在超凈工作臺上，于37°C無菌水 浴中浸種2h 4h，處理結(jié)束后用無菌吸水紙將材料表面的水分吸干；A-2、接種培養(yǎng)上步所得種子接種到接種培養(yǎng)基上，30d 40d長出2 4片真葉； 所述接種培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的 瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；A-3、外植體的選擇及消毒接種35d 45d后最大葉片可長至2cm 3cm，摘取靠 近頂芽顏色淡綠的幼葉，消毒處理，然后將材料放到無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺上用消過 毒的剪刀剪成小片，即得。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟E所述馴化與移栽的具體步驟為E-1、馴化上步所得生根幼苗開蓋于室溫下煉苗七天，每天噴水，保持葉片表面的 濕潤，七天后用自來水沖洗干凈試管苗根部的培養(yǎng)基并將植株取出，將根浸沒于水中放置 三天，使根粗壯；此時苗高5cm 8cm ；E-2、移栽對上步所得生根苗進行移栽，栽苗的基質(zhì)組分為田園土 營養(yǎng)土 蛭 石=1 1 1，用水澆透基質(zhì)，使得基質(zhì)的含水量以手捏指縫中水不滴下為度，移栽時以埋 住根系為準，保持溫度在15°C 30°C、濕度在60% 65%，移栽成活率可達95% 100%。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟A-3中摘取幼葉后的消毒處理步驟為在 超凈工作臺上，用無菌水將幼葉沖洗2 3遍，75%酒精消毒30s，10% H2O2消毒lOmin，無 菌水沖洗4 5遍，即可。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟A-3中摘取幼葉后的消毒處理步驟還可 以為在超凈工作臺上，用無菌水將幼葉沖洗2 3遍，75%酒精消毒30s，0. 1% NaClO中 浸泡20min，用無菌水沖洗4 5遍，即可。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于本發(fā)明對太行菊組織培養(yǎng)的外植體材 料取得、誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等的操作及具體實施方法給予 了具體指導(dǎo)，建立了完備的太行菊組織培養(yǎng)體系，具有極強的可實施性與可重復(fù)性，能夠快 速、大量的繁殖太行菊，成本低廉，成活率高，對保護太行菊物種資源以及對于人類進行系 統(tǒng)科學(xué)研究和綜合開發(fā)利用太行菊植物基因資源，具有重要的實際意義和經(jīng)濟價值。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是自來水沖洗過的太行菊種子。圖2是每天12小時光照培養(yǎng)15天的太行菊愈傷組織。圖3是繼代增殖4次的太行菊。圖4是生根培養(yǎng)15天的太行菊苗。圖5是開蓋于室溫下煉苗7天的太行菊。圖6是移栽于園田土基質(zhì)中一個月的太行菊。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發(fā)明。制備本發(fā)明所使用的各種原料及各項設(shè)備均為常 規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中對培養(yǎng)基成分的描述采用“MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的 6-BA+0. 65%重量分數(shù)的瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖”的方式，其具體意義為MS培養(yǎng)基作為 主體，其中NAA的含量為0. 2mg/l、6-BA的含量為2. Omg/1、瓊脂的重量分數(shù)為0. 65%、蔗糖 的重量分數(shù)為3%。另外，1/2MS的意義為MS培養(yǎng)基中大量元素含量減半，微量元素含量不變。實施例1太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其包含以下步驟A、外植體獲取A-1、種子預(yù)處理選取籽粒飽滿的太行菊種子，在超凈工作臺上，于37°C無菌水 浴中浸種2h 4h，處理結(jié)束后用無菌吸水紙將材料表面的水分吸干；A-2、接種培養(yǎng)上步所得種子接種到接種培養(yǎng)基上，每個接種瓶中接種10顆， 30d 40d長出2 4片真葉；所述接種培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/ 1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；A-3、外植體的選擇及消毒接種35d 45d后最大葉片可長至2cm 3cm，摘取 靠近頂芽顏色淡綠的幼葉，在超凈工作臺上，用無菌水將幼葉沖洗2 3遍，75%酒精消毒 30s, 10% H2O2消毒lOmin，無菌水沖洗4 5遍，然后將材料放到無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工 作臺上用消過毒的剪刀剪成小片，即得；B、誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)上步所得外植體材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每個接種瓶中接種3個 外植體，設(shè)定光照強度為2000LX，光照時長為12h/d，培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織；所述誘導(dǎo)愈傷 培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0. 5mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+O. 65%重量分數(shù)的瓊脂+3% 重量分數(shù)的蔗糖；C、增殖繼代培養(yǎng)選取結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地脆硬、細胞呈不規(guī)則球形或近等徑型、生長較慢、顏色為淡綠 色的愈傷組織接種到增殖繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，此后每20天繼代一次，繼代4 5次后 芽體變得茁壯，并逐漸長出綠色小葉，形成完整的太行菊小植株體；所述增殖繼代培養(yǎng)基的 成分為MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的瓊脂+3%重量分 數(shù)的蔗糖；D、生根培養(yǎng)將生長高度在2cm以上的無菌苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，每個接種瓶中接種3 7 個芽，接種時注意保持芽體原有的形態(tài)學(xué)上下端，使生根端進入培養(yǎng)基，保持植株直立且穩(wěn) 定，在恒溫光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)45d，培養(yǎng)溫度為25士2°C，光照時間為12h/d 14h/d，光照強 度為1800LX 2000LX ；所述生根培養(yǎng)基的成分為1/2MS培養(yǎng)基+0. 4mg/L的ΝΑΑ+0. 65% 重量分數(shù)的瓊脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；E、馴化與移栽E-1、馴化上步所得生根幼苗開蓋于室溫下煉苗七天，每天噴水，保持葉片表面的濕潤，七天后用自來水沖洗干凈試管苗根部的培養(yǎng)基并將植株取出，將根浸沒于水中放置 三天，使根粗壯；此時苗高5cm 8cm ；E-2、移栽對上步所得生根苗進行移栽，栽苗的基質(zhì)組分為田園土 營養(yǎng)土 蛭 石=1 1 1，用水澆透基質(zhì)，使得基質(zhì)的含水量以手捏指縫中水不滴下為度，移栽時以埋 住根系為準，保持溫度在15°C 30°C、濕度在60% 65%，移栽成活率可達95% 100%。參看附圖，圖1是自來水沖洗過的太行菊種子；圖2是每天12小時光照培養(yǎng)15天 的太行菊愈傷組織；圖3是繼代增殖4次的太行菊；圖4是生根培養(yǎng)15天的太行菊苗；圖5 是開蓋于室溫下煉苗7天的太行菊；圖6是移栽于園田土基質(zhì)中一個月的太行菊。上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一 限制條件。
權(quán)利要求
太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于包含以下步驟A、外植體獲取從太行菊無菌苗上采取外植體；B、誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)上步所得外植體材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，設(shè)定光照強度為2000LX，光照時長為12h/d，培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織；所述誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0.5mg/l的NAA+2.0mg/l的6 BA+0.65％重量分數(shù)的瓊脂+3％重量分數(shù)的蔗糖；C、增殖繼代培養(yǎng)選取結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地脆硬、細胞呈不規(guī)則球形或近等徑型、生長較慢、顏色為淡綠色的愈傷組織接種到增殖繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，此后每20天繼代一次，繼代4～5次后芽體變得茁壯，并逐漸長出綠色小葉，形成完整的太行菊小植株體；所述增殖繼代培養(yǎng)基的成分為MS培養(yǎng)基+0.2mg/l的NAA+2.0mg/l的6 BA+0.65％重量分數(shù)的瓊脂+3％重量分數(shù)的蔗糖；D、生根培養(yǎng)將生長高度在2cm以上的無菌苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，接種時注意保持芽體原有的形態(tài)學(xué)上下端，使生根端進入培養(yǎng)基，保持植株直立且穩(wěn)定，在恒溫光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d～60d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時間為12h/d～14h/d，光照強度為1800LX～2000LX；所述生根培養(yǎng)基的成分為1/2MS培養(yǎng)基+0.4mg/L的NAA+0.65％重量分數(shù)的瓊脂+3％重量分數(shù)的蔗糖；E、馴化與移栽上步所得生根幼苗經(jīng)室溫馴化，然后移栽至基質(zhì)，即得大量太行菊幼苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于步驟A所述 外植體獲取的具體步驟為A-1、種子預(yù)處理選取籽粒飽滿的太行菊種子，在超凈工作臺上，于37°C無菌水浴中 浸種2h 4h，處理結(jié)束后用無菌吸水紙將材料表面的水分吸干；A-2、接種培養(yǎng)上步所得種子接種到接種培養(yǎng)基上，30d 40d長出2 4片真葉；所 述接種培養(yǎng)基的成分為=MS培養(yǎng)基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分數(shù)的瓊 脂+3%重量分數(shù)的蔗糖；A-3、外植體的選擇及消毒接種35d 45d后最大葉片可長至2cm 3cm，摘取靠近頂 芽顏色淡綠的幼葉，消毒處理，然后將材料放到無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺上用消過毒的 剪刀剪成小片，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于步驟E所述 馴化與移栽的具體步驟為E-1、馴化上步所得生根幼苗開蓋于室溫下煉苗七天，每天噴水，保持葉片表面的濕 潤，七天后用自來水沖洗干凈試管苗根部的培養(yǎng)基并將植株取出，將根浸沒于水中放置三 天，使根粗壯；此時苗高5cm 8cm ；E-2、移栽對上步所得生根苗進行移栽，栽苗的基質(zhì)組分為田園土 營養(yǎng)土 蛭石= 1:1: 1，用水澆透基質(zhì)，使得基質(zhì)的含水量以手捏指縫中水不滴下為度，移栽時以埋住根 系為準，保持溫度在15°C 30°C、濕度在60% 65%，移栽成活率可達95% 100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于步驟A-3中 摘取幼葉后的消毒處理步驟為在超凈工作臺上，用無菌水將幼葉沖洗2 3遍，75%酒精 消毒30s, 10% H2O2消毒lOmin，無菌水沖洗4 5遍，即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其特征在于步驟A-3中摘取幼葉后的消毒處理步驟為在超凈工作臺上，用無菌水將幼葉沖洗2 3遍，75%酒精 消毒30s, 0. 1% NaClO中浸泡20min，用無菌水沖洗4 5遍，即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種太行菊的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其包含以下步驟A、外植體獲取從太行菊無菌苗上采取外植體；B、誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)上步所得外植體材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，至產(chǎn)生愈傷組織；C、增殖繼代培養(yǎng)選取結(jié)構(gòu)致密、質(zhì)地脆硬、細胞呈不規(guī)則球形或近等徑型、生長較慢、顏色為淡綠色的愈傷組織接種到增殖繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；D、生根培養(yǎng)將生長高度在2cm以上的無菌苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；E、馴化與移栽上步所得生根幼苗經(jīng)室溫馴化，然后移栽至基質(zhì)，即得大量太行菊幼苗。本發(fā)明對太行菊無菌苗體系的建立給予詳細的指導(dǎo)，尤其是給出其誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的最佳配方，具有極強的可實施性與可重復(fù)性，能夠一次繁殖大量太行菊幼苗。
文檔編號A01H4/00GK101965799SQ20101054132
公開日2011年2月9日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者孫莉莉, 曾獻秋, 苗一帆, 黃進勇 申請人:黃進勇;苗一帆;孫莉莉;曾獻秋