專利名稱：蛭弧菌游泳體菌液在海參育苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種細菌的應用，特別涉及蛭弧菌游泳體菌液在 海參育苗中的應用。
背景技術：
海參自古被列為“海中八珍”之一，有“海中人參”的美譽。據研究，海參特別是北 方刺海參具有高蛋白、低脂肪、低糖的特點，有很高的食用價值和醫(yī)用價值。近年來，隨著城 鄉(xiāng)居民生活水平的不斷提高以及醫(yī)療保健意識的增強，海參的消費需求不斷上升，價格不 斷上漲，由此帶動了海參養(yǎng)殖的興起，海參養(yǎng)殖已成為繼對蝦養(yǎng)殖之后又一新的海水養(yǎng)殖執(zhí)占。苗種是大規(guī)模養(yǎng)殖的先決條件，工廠化育苗技術的產生、發(fā)展和成熟極大地促進 了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但是，隨著工廠化育苗技術的普及和無序發(fā)展，很多問題也日益顯 現追求利潤最大化導致近親繁殖、親體小型化、病害猖獗和無序大量使用抗生素等，造成 海參體內藥物殘留，品質下降；室內強化培育，人為地減少了自然選擇，保護了病弱者，降低 了苗種的生存力；按目前的生產工藝，多數育苗場用水量大，水不經處理直接入海，嚴重污 染環(huán)境。微生態(tài)制劑是從自然環(huán)境中篩選出來的微生物菌體，經培養(yǎng)繁殖后制成的含有大 量有益菌的活菌制劑。它具有成本低、無毒副作用、不污染環(huán)境的特點。蛭弧菌是寄生于其他細菌，并能導致宿主細菌裂解的一類細菌。比一般細菌小，能 通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用，是一種新型的微生態(tài)制劑。蛭弧菌一方面能夠裂解 水體中的(潛在)致病菌，減少用水量，另一方面能改善養(yǎng)殖生物腸道環(huán)境，提高免疫力，促 進幼苗發(fā)育和生長，提高苗種成活率。蛭弧菌游泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵入宿主細 菌的過程非?？?，一般幾秒鐘內即可完成。蛭弧菌游泳體菌液具有起效快、活力強的優(yōu)點。到目前為止，國內外尚無在海參育苗過程中使用蛭弧菌游泳體菌液的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服已有方法的不足，提供蛭弧菌游泳體在海參育苗中的應用 方法，是一種節(jié)能、減排，綠色、無公害的新型育苗方法，能有效控制病害發(fā)生，提高苗種質 量和育苗成功率。本發(fā)明的目的可以通過以下方案實現蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用。所述蛭弧菌蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. Strain)BDMOl于2008年4月沘 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M 208066。對BDMOl進行負染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDMOl呈單細胞，弧形， 大小為1. 7 X 1. 0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為3. 5 μ m ；將其以雙層平板法于培養(yǎng)三天可
3形成直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。所述蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用是將飼料在蛭弧菌游泳體菌液中浸 泡 15-45min。所述蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌游泳體菌液， 使水體中蛭弧菌游泳體濃度為IO1 l(fpfu/mL。本發(fā)明相對于現有技術，具有如下的優(yōu)點及效果1、蛭弧菌游泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵入宿主 細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。相對于蛭弧菌蛭質體而言，雖然存在著制備繁 瑣、不易保存的弱點，但用蛭弧菌游泳體裂解致病菌具有起效快、活力強的優(yōu)點。2、本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體在海參的應用中安全性好。蛭弧菌游泳體通過裂解而消除致病菌的方法是生物方法，綠色、安全、無污染。蛭 弧菌可侵染、裂解宿主細菌的特性使之適合作為抑制或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生 物凈化因子，且其在裂解完宿主細菌后，會因饑餓而自動消亡，從而克服了抗生素濫用帶來 的副作用。已有研究表明蛭弧菌對海參無毒性作用，對人類無致病性。3、所述新技術可有效提高種苗免疫力蛭弧菌游泳體菌液可調節(jié)參苗自身的菌系，維護腸道系統(tǒng)環(huán)境，促進免疫系統(tǒng)的 發(fā)育，增強苗種的體質，方案于實際實施中所測定的各項免疫指標均高于使用傳統(tǒng)的方法。4、本發(fā)明方案可有效減少換水、倒池的次數，經實驗證實在幼體培育期無需換水， 在稚參的培育期最長可達20天不換水、倒池，減少了污水的排放，降低了能耗及對環(huán)境的 影響，節(jié)約人力物力，是一種綠色、環(huán)保、低碳的節(jié)水型新育苗技術。


圖1為實施例育苗試驗后免疫因素一酸性磷酸酶(Acidphosphatase，ACP)結果圖2為實施例育苗試驗后免疫因素一堿性磷酸酶(Alkalin印hosphatase，AKP) 結果
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1蛭弧菌游泳體菌液的制備接種0. 5mL 106cfu/mL嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物 所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)于IOOmL營養(yǎng)肉湯(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g， 蒸餾水lOOOmL，pH 7.4)液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)20h，培養(yǎng)液經6000rpm離心15min后， 沉淀用5mL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物 0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7. 5)懸浮，之后加入至IOOmL DNB 中，接入ImL lXl(fpfu/mL蛭弧菌BDM01J8°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液經7000rpm離心20min后， 將蛭弧菌游泳體的上清液經16000rpm離心20min后，沉淀用ImL DNB液體培養(yǎng)基懸浮，得 到 ImL蛭弧菌游泳體菌液，經0D600nm測定(LYSIS OF VIBRIOS BYBDELL0VIBRI0-AND-LIKE ORGANISMS (BALOs) IS0LATEDFR0M MARINE ENVIRONMENT[J]. Journal of FoodSafety，2008， 28 (2) :220-235.)，蛭弧菌BDMOl游泳體菌液的濃度為108pfu/mL。
實施例2蛭弧菌游泳體在海參育苗中的應用實驗實施地點山東某海參養(yǎng)殖場，育苗海參種類仿刺參又名灰參1.親參采捕在自然海區(qū)采捕；采捕時間海水底層水溫達到15 16°C時，親參產卵前5天集 中采捕；選擇300g以上、3齡以上、無損傷的個體。2.親參蓄養(yǎng)蓄養(yǎng)密度15只/m3，蓄養(yǎng)的水溫16 18°C，蓄養(yǎng)時間為7天，在蓄養(yǎng)池中進行。蓄 養(yǎng)池中的水經過精細過濾。在水中加入蛭弧菌游泳體菌液，使培育池中的蛭弧菌游泳體濃 度達到IO1 l(fpfu/mL。短期蓄養(yǎng)過程不投餌，不換水，每天早晚利用虹吸作用清理池中 的糞便等污物。3.產卵孵化與幼體培育受精采用混合受精方式。為保證受精質量，防止精液過多，及時將過多的雄參(已 見排精的個體)挑出并移入另外的水池中。親參產卵受精后及時將親參移出，并用過濾海 水洗卵，直到池水變清為止，再向各池中加入蛭弧菌游泳體菌液，使其終濃度分別為IO1 107pfu/mL,受精卵直接在蓄養(yǎng)池中孵化。受精卵的孵化密度為5個/mL，孵化水溫為20°C。孵化期間每隔0. 5h用攪水耙 將池水上、下翻動一次，翻水時應不留死角且不能向一個方向旋轉，以避免將胚體旋向池中
心聚集。4.幼體培育當胚胎發(fā)育到小耳幼體時，進行選育。將上浮的幼體移入培育池內繼續(xù)培養(yǎng)。培育 池中的海水為經砂濾的海水，再向各池中加入蛭弧菌游泳體菌液，使其終濃度分別為IO1 107pfu/mL,幼體布池密度約為0. 5個/mL。孵化36小時后投餌。餌料主要為采(收)集的天然生長的牟氏角毛藻。藻類的 日投餌量在初耳幼體期為1. 5萬細胞/mL，中耳幼體期為2萬 3萬細胞/mL，大耳幼體期 為4萬 5萬細胞/mL。每日分3次投喂，每次投餌量的標準以投餌1小時后大多數幼體滿 胃即可，下次投餌要接近半胃為準。所有投喂的餌料均先用濃度為IO1 IO7PfVmL的蛭弧 菌游泳體菌液泡30min。幼體培育期間全部使用二級砂濾水。本階段不換水、倒池，但要及時利用虹吸作用 或吸底器清除池底污物5.稚參的采集和培育當幼體25%發(fā)育至蹲形幼蟲時，即可投放波紋板做附著基，附著基投放前用 20mg/L的高錳酸鉀溶液浸泡2天，然后用水洗掉藥物。洗刷干凈后放入餌料池中以便讓海 水中自然生長的底棲硅藻附著。經過20天，在附著基上面附著一層底棲硅藻，即可投放使 用。使用前用水沖去污物，放入濃度為IO1 107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液中浸泡30min。 每平方米投放60片波紋板，呈60°斜放，以便投餌時承接餌料。體長2mm以前的稚參，以附著基上的底棲硅藻為主。隨著稚參的增長，及時補充新 的自然附著的底棲硅藻及鼠尾藻磨碎液。當稚參體長達2mm時，以鼠尾藻磨碎液為餌料，每 日投喂4次，每次20 30萬個細胞單位。投放的所有餌料均需要放入濃度分別為IO1 IO7PfVmL的蛭弧菌游泳體菌液中泡 30min。育苗期間的溫度、隨時觀察，及時清除池底部的沉淀物及水表面的雜物。每次換水 時注入二級砂濾水，換水完畢后需施加終濃度分別為IO1 l(fpfu/mL的蛭弧菌游泳體菌 液。根據稚參生長狀況，可提前移出已達出苗規(guī)格2cm的稚參，分期出池，以利個體小的迅 速生長。實驗分組實驗分A. B. C. D四大組，其中A組(對照組)按現有的工業(yè)生產方法實施。B組(蛭弧菌游泳體制劑浸泡飼料組)Bi. 1 Bi. 4 按上述1_5步進行，全程用IO1PfuAiL蛭弧菌游泳體制劑浸泡所有 餌料，稚參培育期分別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B2. 1 B2. 4 按上述1_5步進行，全程用l(fpfu/mL蛭弧菌游泳體制劑浸泡所有 餌料，稚參培育期分別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B3. 1 B3. 4 按上述1_5步進行，全程用105pfu/mL蛭弧菌游泳體制劑浸泡所有 餌料，稚參培育期分別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B4. 1 B4. 4 全按上述1_5步進行，程用l(fpfu/mL蛭弧菌游泳體制劑浸泡所有 餌料，稚參培育期分別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。C組(蛭弧菌游泳體處理水體組)按上述1-5步進行，潑灑蛭弧菌游泳體于水體， 使水體中的蛭弧菌濃度達到設定要求，但不使用蛭弧菌游泳體浸泡飼料，濃度和換水間隔 設置同B組。D組(蛭弧菌游泳體制劑處理水體和餌料組)潑灑蛭弧菌游泳體于水體和浸泡所 有餌料，濃度和換水間隔設置同B組。免疫指標測定1.酸性磷酸酶(ACP)與堿性磷酸酶(AKP)活力的測定制備粗酶提取液。育苗實驗結束，每組隨機取海參幼苗6只，用冰凍雙蒸水G°C， PH 7.0)沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后，準確稱取組織質量，按質量體積比1 9加入 0. 86%的冷生理鹽水，在液氮中研磨成勻漿狀，分裝于1. 5mL的離心管中，4°C，12000r/min 離心lOmin，取上清液，加入9倍體積冷生理鹽水，制成粗酶提取液。4°C保存，并于24h內分 析完畢。堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用Kruzel (1982)磷酸苯二鈉法， 以每克組織蛋白在37°C與磷酸苯二鈉分別作用15min和30min，產生Img酚為一個酶活力單位。1.感染實驗試驗結束后，感染試驗于預先消毒的盛有50L砂濾海水(鹽度四 30%。)的透明 水族箱中進行，以工業(yè)生產的A組作為對照組，其他(B-D)組為實驗組。對照和實驗各組， 每組隨機取海參苗40頭，平均分成兩個平行系列。按實施例1中的方法制備嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)菌液，之后將 菌液加入對照和實驗組的水體中，使水體中的嗜水氣單胞菌終濃度達到107cfu/mL。試驗水 溫保持在18 20°C，充氣培養(yǎng)。人工感染后，記錄海參的體表變化、運動、攝食及死亡情況連續(xù)觀察7d，最終計算成活率，采用相對存活率(Relative PercentageSurvival, RPS)計 算式RPS (% ) = (1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X 100%水質檢測水質檢測項目包括色臭味，酸堿度，氨態(tài)氮，亞硝酸鹽氮，硫化物。其中PH用數字 式PH計測定(分辨率0. OlpH)，氨態(tài)氮用次溴酸納氧化法法測定(GB12763.4-91)；亞硝酸 鹽氮用重氮-偶氮光度法測定(GB12763.4-91)；硫化物用對氨基二甲基苯胺光度法(亞甲 藍法)(GB16489-96)。四、實驗結果成活率、RPS結果如表1所示，ACP、AKP結果見圖1，圖2。從表1和圖1、2可以看 出，實驗組B/C/D組，無論是育苗成功率還是各項免疫指標，其結果均好于對照A組。由此 表明本方案用蛭弧菌游泳體進行海參育苗的新型育苗方式要優(yōu)于現有的生產技術，可提 高稚參的成活率和免疫力。比較實驗組B/C/D，可知B組成活率最高可達52.8%，感染實驗的RPS最高可達 47%,但包括ACP、AKP在內均要略低于C組。D組成活率最高可達68. 9%，RPS可達57%， 均高于B/C兩組，ACP，AKP的數據同樣如此，表明用蛭弧菌同時處理餌料和水體可更有效地 提高稚參的成活率和免疫力。從各組組內的對比可知，各項指標的數據隨著蛭弧菌游泳體濃度的升高而升高， 但換水周期對其的影響不顯著。因此，在實際生產中，換水周期可設為20天一次。如此，既 可降低能耗和勞動力，又可減少排污，保護環(huán)境。水質檢測結果各組均符合《漁業(yè)水質標準》(GB 11607-1989)和《無公害食品海水 養(yǎng)殖用水水質》(NY5052-2001)標準。但Al組的氨態(tài)氮，亞硝態(tài)氮，硫化物測定值均高于 試驗組B、C、D的。其中，A組氨態(tài)氮的檢測結果為0. 312mg/L, B/C/D組均彡0. 211mg/L ； 亞硝態(tài)氮A組檢測結果為0. 015mg/L, B/C/D組均彡0. 012mg/L ；硫化物A組檢測結果為 0. 108mg/L, B/C/D 組均;^ 0. 091mg/L。由此可見，無論在水中還是在飼料中添加終濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌游泳 體菌液，5 20天換水一次，均能夠提高海參的免疫力和成活率，促進生長。在水中和飼料 中同時添加蛭弧菌游泳體菌液，效果更佳。表1稚參各項指標測定結果
權利要求
1.蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用。
2.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用，其特征在于所述蛭 弧菌蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. Strain)BDMOl于2008年4月沘日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 208066。
3.根據權利要求1所述蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用，其特征在于所述蛭 弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用是將飼料在蛭弧菌游泳體菌液中浸泡15-45min。
4.根據權利要求1所述蛭弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用，其特征在于所述蛭 弧菌游泳體菌液在海參養(yǎng)殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌游泳體菌液，使水體中蛭弧菌 游泳體濃度為IO1 l(fpfu/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了蛭弧菌游泳體在海參育苗中的應用，通過在水體和/或飼料中添加蛭弧菌游泳體菌液實現，具體包括育苗設施與水質條件，親參采捕，親參蓄養(yǎng)，產卵孵化與幼體培育，采苗和稚參培育，關鍵技術是在水體中添加終濃度為10～107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液，和/或同時飼料要用濃度為10～107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡30min，應用本發(fā)明平均育苗成活率達到50％以上，且可有效改善水質，實驗表明最長可長達20天不換水，節(jié)約成本，人力，大大提高了經濟效益，且育苗成活率高、苗種質量好、節(jié)水節(jié)能、綠色低碳。
文檔編號A23K1/16GK102057883SQ20101026859
公開日2011年5月18日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者孫麗瀅, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學