專利名稱：一種霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種霍山石斛類原球莖快速增殖的 簡(jiǎn)易培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
石斛是一種常用的名貴中草藥，具有滋陰清熱、生津止渴、潤(rùn)肺止咳、久服厚腸胃、 輕身延年等功效。而霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S.J.Cheng)則被 認(rèn)為是石斛中的上品，這在《本草綱目》、《名醫(yī)別錄》、《本草綱目拾遺》、《證類本草》等古書(shū) 籍中就有記載?，F(xiàn)代藥理研究證明，霍山石斛具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫功能以及顯著 的抗白內(nèi)障活性。霍山石斛，又名霍斛、米斛，產(chǎn)于安徽霍山及大別山區(qū)，對(duì)生長(zhǎng)條件要求十分苛刻， 繁殖能力低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，加之生態(tài)環(huán)境破壞和人工過(guò)度采掘，目前野生霍山石斛資源已瀕 臨滅絕。為了保護(hù)這一珍貴中藥品種，許多學(xué)者對(duì)霍山石斛進(jìn)行了無(wú)性快繁技術(shù)的研究，采 用組織培養(yǎng)的方法已獲得成功，這對(duì)于緩解野生資源緊張的局面、滿足藥材市場(chǎng)需求都有 很重要的意義?；羯绞愒蚯o是霍山石斛的體細(xì)胞胚，可由植株的不同部位誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有 和植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能，可用來(lái)代替原藥材生產(chǎn)相關(guān)的活性物質(zhì)。由于，霍 山石斛類原球莖的組織培養(yǎng)離不開(kāi)培養(yǎng)基，因此，研究高效、廉價(jià)的霍山石斛類原球莖快速 增殖的培養(yǎng)基至關(guān)重要。在現(xiàn)有技術(shù)中，霍山石斛類原球莖的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基或改良的 MS培養(yǎng)基。霍山石斛類原球莖在MS培養(yǎng)中雖然生長(zhǎng)較好，但存在的問(wèn)題是MS培養(yǎng)基價(jià)格 較高，不適合規(guī)模化生產(chǎn)引用。因此，尋找一種價(jià)格低廉、快速增殖的霍山石斛類原球莖培 養(yǎng)基是發(fā)展霍山石斛產(chǎn)業(yè)急需解決的課題。

發(fā)明內(nèi)容
為了保證霍山石斛類原球莖在其中生長(zhǎng)良好，增殖的霍山石斛類原球莖可代替原 藥材生產(chǎn)相關(guān)的活性物質(zhì)；實(shí)現(xiàn)霍山石斛的規(guī)?；a(chǎn)，緩解野生資源緊張的局面、滿足藥 材市場(chǎng)的需求；本發(fā)明采用組織培養(yǎng)的方法保護(hù)霍山石斛，提供一種霍山石斛類原球莖快 速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明的目的是基于以下構(gòu)思實(shí)現(xiàn)的。首先，霍山石斛的培養(yǎng)條件要求苛刻，因 此，培養(yǎng)基應(yīng)含有較高的營(yíng)養(yǎng)成分；其次，要適合大規(guī)模生產(chǎn)需要，因此，培養(yǎng)基成本要低。 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在改良的1/2MS培養(yǎng)基中添加土豆汁是比較適合的原料。根據(jù)中 國(guó)食物成分表，土豆?fàn)I養(yǎng)十分豐富，IOOg 土豆中含淀粉9 20g，蛋白質(zhì)1. 5 2. 3g，脂肪 0. 1 1. Ig,粗纖維0. 6 0. 8g,熱量66 113J，鈣11 60mg，磷15 68mg，鐵0. 4 4. 8mg，硫胺素0. 03 0. 07mg，核黃素0. 03 0. llmg，尼克酸0. 4 1. Img以及胡蘿卜素 和抗壞血酸。此外，土豆種植面廣、產(chǎn)量大。本發(fā)明以土豆的加工利用和霍山石斛類原球莖的增殖為目標(biāo)，研制出了一種簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。為了確定簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的組成，本發(fā)明采用了正交試驗(yàn)法確定最佳配方組成?？紤] 蔗糖價(jià)格較高，選擇食品級(jí)白砂糖代替蔗糖，表1中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基指MS、1/2MS中除蔗糖、瓊 脂以外的成分，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)安排見(jiàn)表2。按照表2的安排配制培養(yǎng)基，每瓶分裝45mL，每瓶接種5g霍山石斛類原球莖后， 放置25°C培養(yǎng)間培養(yǎng)35天，收集霍山石斛類原球莖并進(jìn)行霍山石斛類原球莖生長(zhǎng)量和多 糖含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表3。從表3可知，A2B3C1是實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合，理論最優(yōu)組 合是A2B3C3。表3結(jié)果顯示，白砂糖和土豆含量對(duì)霍山石斛類原球莖的生長(zhǎng)有顯著影響，而 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的影響不顯著。最后以MS培養(yǎng)基為對(duì)照，將實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合A2B3C1、理論最優(yōu)組合 A2B3C3及組合A2B3C2做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果分別為18. 06,24. 07,20. 82,24. 75g/瓶。表IL9(33)正交試驗(yàn)的因素水平
水平因素 表2正交試驗(yàn)安排、結(jié)果及分析
實(shí) 表3正交試驗(yàn)方差分析表方差來(lái)源
平方和SS自由度df均方差MS F值 顯著性
基礎(chǔ)培養(yǎng)基 經(jīng)以上試驗(yàn)結(jié)果得出，一種霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的組成為硝酸鉀(KNO3)950mg/L、硝酸銨(NH4NO3)825mg/L、硫酸鎂(MgSO4· 7H20) 185mg/L、 氯化鈣(CaCl2 · 2H20)220mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 85mg/L、硫酸錳(MnSO4 · H2O) 8. 45mg/ L、硫酸鋅(ZnSO4 · 7Η20)4· 3mg/L、硼酸(H3BO3) 3. lmg/L、碘化鉀(KI)0.415mg/ L、鉬酸鈉(Na2MoO4. 2Η20)0· 125mg/L、硫酸銅(CuSO4 · 5H20) 0. 0125mg/L、氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) 0. 0125mg/L、乙二 胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 18. 625mg/L、硫酸亞鐵 (FeSO4 · 7H20) 13. 925mg/L、肌醇 50mg/L、甘氨酸 lmg/L、鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 25mg/L、煙酸 (VB5) 0. 25mg/L、鹽酸硫胺素(VB1)O. 05mg/L、食品級(jí)白砂糖 10 30g/L、土豆 60 100g/L、 瓊脂5 6g/L ；其中硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀為大量元素；硫酸錳、硫酸鋅、硼 酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷為微量元素；乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵為鐵鹽；肌 醇、甘氨酸、鹽酸吡哆醇、煙酸、鹽酸硫胺素為有機(jī)元素；pH 值為 6.0 6. 2。本發(fā)明簡(jiǎn)易培養(yǎng)基按以下操作步驟制備(1)配制母液①大量元素母液的配制分別稱量上述大量元素10倍的量，分別用少量的蒸餾水 徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液I ；②微量元素母液的配制分別稱量上述微量元素1000倍的量，分別用少量的蒸餾 水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液II ；③鐵鹽母液配制分別稱量上述鐵鹽100倍的量，分別用少量的蒸餾水徹底溶解， 然后再將乙二胺四乙酸二鈉溶液加入到硫酸亞鐵溶液中，邊加邊攪拌，最后定容到1L，得母 液 III ；④有機(jī)元素母液配制分別稱量上述有機(jī)元素100倍的量，分別用少量的蒸餾水 徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液IV ；(2)制備土豆?jié){液取去皮土豆，切成約2CmX2CmX2Cm的小塊，加適量水，煮熟后搗碎成土豆?jié){液； 控制60 IOOg 土豆制得460-500mL的土豆?jié){液；(3)制備簡(jiǎn)易培養(yǎng)基量取土豆?jié){液，煮沸后，加入瓊脂，繼續(xù)煮沸2分鐘，然后加入適量母液I、母液II、 母液III、母液IV和食品級(jí)白砂糖，定容至所需體積后，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH 至6. 0 6. 2，分裝后滅菌即制得霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)①霍山石斛類原球莖在本發(fā)明簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)35天其平均生長(zhǎng)量為0. 672g/d，達(dá)到實(shí)驗(yàn)室中所用的經(jīng)典MS培養(yǎng)基 的1. 37倍；②該培養(yǎng)基的主要原料白砂糖和土豆價(jià)廉易得，其他成分用量小，制作方法簡(jiǎn) 易，成本低廉，成本僅為MS培養(yǎng)基的60%左右；③該廣泛培養(yǎng)基可用于霍山石斛類原球莖 研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中的各個(gè)領(lǐng)域，尤其適合霍山石斛類原球莖的工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1 霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成硝酸鉀(KNO3)950mg/L、硝酸銨(NH4NO3)825mg/L、硫酸鎂(MgSO4· 7H20) 185mg/L、 氯化鈣(CaCl2 · 2H20)220mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 85mg/L、硫酸錳(MnSO4 · H2O) 8. 45mg/ L、硫酸鋅(ZnSO4 · 7Η20)4· 3mg/L、硼酸(H3BO3) 3. lmg/L、碘化鉀(KI)0.415mg/ L、鉬酸鈉(Na2MoO4. 2Η20)0· 125mg/L、硫酸銅(CuSO4 · 5H20) 0. 0125mg/L、氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) 0. 0125mg/L、乙二 胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 18. 625mg/L、硫酸亞鐵 (FeSO4 · 7H20) 13. 925mg/L、肌醇 50mg/L、甘氨酸 lmg/L、鹽酸吡哆醇(VB6) 0. 25mg/L、煙酸 (VB5)O. 25mg/L、鹽酸硫胺素(VB1)O. 05mg/L、食品級(jí)白砂糖 10g/L、土豆 60g/L、瓊脂 6g/L。其中硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀為大量元素；硫酸錳、硫酸鋅、硼 酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷為微量元素；乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵為鐵鹽；肌 醇、甘氨酸、鹽酸吡哆醇、煙酸、鹽酸硫胺素為有機(jī)元素；發(fā)明中使用的瓊脂為粉狀瓊脂；簡(jiǎn)易培養(yǎng)基pH值為6. 2?；羯绞愒蚯o快速增殖簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的制備方法如下步驟1 配制母液①制大量元素母液(母液I)按上述大量元素含量的10倍分別稱量，分別用少量 的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，貯存于試劑瓶中；②配制微量元素母液(母液II)按上述微量元素含量的1000倍分別稱量，分別 用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，貯存于試劑瓶中；③配制鐵鹽母液(母液III)按上述鐵鹽含量的100倍分別稱量，分別用少量的 蒸餾水徹底溶解，然后再將Na2-EDTA ·2Η20溶液加入到FeSO4 ·7Η20溶液中(邊加邊攪拌)， 最后定容到1L，貯存于棕色試劑瓶中；④配制有機(jī)元素母液(母液IV)按上述有機(jī)元素含量的100倍分別稱量，分別用 少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，貯存于試劑瓶中；步驟2:制備土豆?jié){液取去皮土豆60g，切成約2cmX 2cmX 2cm的小塊，加入300mL水，煮熟，再加入 IOOmL冷水后轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)搗碎成土豆?jié){液，得土豆?jié){液460mL ；步驟3:制備簡(jiǎn)易培養(yǎng)基取460mL 土豆?jié){液，煮沸后加入6g瓊脂，繼續(xù)煮沸2分鐘(邊煮邊攪拌)，然后加 入IOOmL母液I、ImL母液IIUOmL母液IIIUOmL母液IV和IOg食品級(jí)白砂糖，攪拌使其 溶解后，用水定容至IOOOmL,最后用0. lmol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH至6. 2，分裝后滅菌即制得簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。實(shí)施例2霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成食品級(jí)白砂糖20g/ L、土豆80g/L、瓊脂5. 5g/L、其它成分同實(shí)施例1 ；簡(jiǎn)易培養(yǎng)基pH值為6. 2?；羯绞愒蚯o快速增殖簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的制備方法如下步驟1:配制母液同實(shí)施例1。步驟2:制備土豆?jié){液取去皮土豆80g，切成約l_2cm厚薄片，放入豆?jié){機(jī)中，再加入400mL水，邊加熱邊 搗碎，得土豆?jié){液475mL ；步驟3:制備簡(jiǎn)易培養(yǎng)基取475mL 土豆?jié){液，煮沸后加入5. 5g瓊脂，繼續(xù)煮沸2分鐘，邊煮邊攪拌，然后加 入IOOmL母液I、lmL母液IIUOmL母液IIIUOmL母液IV和20g食品級(jí)白砂糖，攪拌使其 溶解后，用水定容至IOOOmL,最后用0. lmol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH至6. 2，分裝后 滅菌即制得簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。實(shí)施例3 霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成食品級(jí)白砂糖30g/ L、土豆100g/L、瓊脂5. 0g/L、其它成分同實(shí)施例1 ；簡(jiǎn)易培養(yǎng)基pH值為6.0?；羯绞愒蚯o快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的制備方法如下步驟1:配制母液同實(shí)施例1。步驟2:制備土豆?jié){液取去皮土豆100g，切成約2cmX2cmX2cm的小塊，加入300mL水，煮熟，再加入 IOOmL冷水后轉(zhuǎn)入組織搗碎機(jī)搗碎成土豆?jié){液，得土豆?jié){液490mL ；步驟3:制備簡(jiǎn)易培養(yǎng)基取490mL 土豆?jié){液，煮沸后加入5g瓊脂，繼續(xù)煮沸2分鐘，邊煮邊攪拌，然后加入 IOOmL母液I、lmL母液IIUOmL母液IIIUOmL母液IV和30g食品級(jí)白砂糖，攪拌使其溶解 后，用水定容至IOOOmL,最后用0. lmol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH至6. 0，分裝后滅菌
即制得簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
一種霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基，其特征在于由下列重量份的物質(zhì)組成硝酸鉀950mg/L、硝酸銨825mg/L、硫酸鎂185mg/L、氯化鈣220mg/L、磷酸二氫鉀85mg/L、硫酸錳8.45mg/L、硫酸鋅4.3mg/L、硼酸3.1mg/L、碘化鉀0.415mg/L、鉬酸鈉0.125mg/L、硫酸銅0.0125mg/L、氯化鈷0.0125mg/L、乙二胺四乙酸二鈉18.625mg/L、硫酸亞鐵13.925mg/L、肌醇50mg/L、甘氨酸1mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸硫胺素0.05mg/L、白砂糖10～30g/L、土豆60～100g/L、瓊脂5～6g/L；其中硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀為大量元素；硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷為微量元素；乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵為鐵鹽；肌醇、甘氨酸、鹽酸吡哆醇、煙酸、鹽酸硫胺素為有機(jī)元素；簡(jiǎn)易培養(yǎng)基pH值為6.0～6.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基的制備方法，其 特征在于包括以下操作步驟(1)配制母液①大量元素母液的配制分別稱量上述大量元素10倍的量，分別用少量的蒸餾水徹底 溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液I ；②微量元素母液的配制分別稱量上述微量元素1000倍的量，分別用少量的蒸餾水徹 底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液II ；③鐵鹽母液配制分別稱量上述鐵鹽100倍的量，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后 再將乙二胺四乙酸二鈉溶液加入到硫酸亞鐵溶液中，邊加邊攪拌，最后定容到1L，得母液 III ；④有機(jī)元素母液配制分別稱量上述有機(jī)元素100倍的量，分別用少量的蒸餾水徹底 溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L，得母液IV ；(2)制備土豆?jié){液取去皮土豆，切成約2CmX2CmX2Cm的小塊，加適量水，煮熟后搗碎成土豆?jié){液；控制 60 IOOg 土豆制得460-500mL的土豆?jié){液；(3)制備簡(jiǎn)易培養(yǎng)基量取土豆?jié){液，煮沸后，加入瓊脂，繼續(xù)煮沸2分鐘，然后加入適量母液I、母液II、母 液III、母液IV和食品級(jí)白砂糖，定容至所需體積后，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至 6. 0 6. 2，分裝后滅菌即制得霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種霍山石斛類原球莖快速增殖的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基及其制備方法。該培養(yǎng)基的配方為改良的1/2MS培養(yǎng)基+食品級(jí)白砂糖+土豆?；羯绞愒蚯o在該簡(jiǎn)易培養(yǎng)基種生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)35天其平均生長(zhǎng)量為0.672g/d，達(dá)到實(shí)驗(yàn)室中所用的經(jīng)典MS培養(yǎng)基的1.37倍。該培養(yǎng)基的主要原料白砂糖和土豆價(jià)廉易得，其他成分用量小，制作方法簡(jiǎn)易，成本低廉，可以廣泛用于霍山石斛類原球莖研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中的各個(gè)領(lǐng)域，尤其適合霍山石斛類原球莖的工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步促進(jìn)了土豆的開(kāi)發(fā)利用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101911913SQ201010266070
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者楊雪飛, 查學(xué)強(qiáng), 潘利華, 羅建平 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)