專利名稱：一種與憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥有關(guān)的小鼠動物模式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)于甘胺酸N-甲基轉(zhuǎn)移酵素(GNMT)基因剔除動物模式及其用途。
背景技術(shù)：
甘胺酸N-甲基轉(zhuǎn)移酵素(GNMT)，也被稱為4S多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔?PAH)結(jié)合 蛋白，具有多種功能。除了作為一個主要葉酸結(jié)合蛋白(Yeo EJ,etal.Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91 :210-214)之外，還經(jīng)由催化甘胺酸合成肌胺酸，來調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫胺酸 (SAM)與 S-腺苷高半胱胺酸(SAH)的比例(Kerr SJ. J Biol Chem 1972 ；247 =4248-4252)。 根據(jù)先前的研究報告，于肝癌細(xì)胞中GNMT基因表現(xiàn)量會減少(Liu HH, et al. J Biomed Sci2003 ；10 :87-97)。從遺傳流行病學(xué)研究結(jié)果指出，GNMT對于肝癌來說是一種腫瘤易感 受性基因(Tseng TL, et al. Cancer Res 2003 ；63 :647_654)。除此之外，根據(jù)報告顯示GNMT 可結(jié)合苯并芘以及防止DNA鍵結(jié)物的形成。在小鼠體內(nèi)，GNMT的表現(xiàn)會受到生長激素影響，在雌性小鼠肝臟細(xì)胞中GNMT的 表現(xiàn)量比雄性小鼠的表現(xiàn)量高八倍。已有三位兒童患者(兩個男孩，一個女孩)的報告指 出，先天性GNMT缺陷是導(dǎo)因于GNMT的基因發(fā)生錯義突變(Augoustides-Savvopoulou P， et al. J Inherit Metab Dis2003 ;26 :745_759)。這三位小孩都患有高甲硫胺酸血癥，肝臟 腫大以及一些臨床上類似慢性肝炎的癥狀(Augoustides-Savvopoulou P，et al. JInherit Metab Dis 2003 ;26 :745_759)，其中這名女孩患者也呈現(xiàn)發(fā)育遲緩以及智力缺陷(IQ = 87)。先前技術(shù)曾揭露一種GNMT基因剔除小鼠，其顯示出肝功能異常且患有肝醣儲積 癥(US Application No. 11/832，304)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于研究憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的動物模式，其中該 動物模式為其基因組已藉由在GNMT基因座進(jìn)行再重組而被打斷的哺乳動物。本發(fā)明亦提供一種用于生產(chǎn)可表現(xiàn)出憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的病理狀 態(tài)的動物的方法，其包含藉由在GNMT基因座進(jìn)行再重組而打斷該動物的GNMT基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選用于治療憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的候選藥 物的方法，其包含(a)將潛在候選藥物投藥給予如申請專利范圍第1項所述的動物模式， (b)測量該動物對于該候選藥物的反應(yīng)，(c)將該動物的反應(yīng)與具有GNMT基因野生型的動 物對該藥物的反應(yīng)相互比較，以及(d)基于所觀察到該動物和該野生型GNMT基因動物之間 的不同反應(yīng)而篩選出該候選藥物。


圖1顯示建構(gòu)出該目標(biāo)靶定載體的策略。
圖2顯示出針對GNMT基因座的標(biāo)靶修改。(A)目標(biāo)靶定載體被設(shè)計用來以新霉 素抗性基因取代GNMT外顯子1-4和部分外顯子5組成。新霉素正向選擇標(biāo)記兩側(cè)加上 兩個同源區(qū)，接著在目標(biāo)靶定載體3'端接上胸腺甘激酶負(fù)向選擇標(biāo)記。(B)胚胎干細(xì)胞 株的南方墨點法分析。BamHI(B)-BamHIDNA片段大小從7.9kb (野生型等位基因)減少至 5.3kb。(C)利用聚合酶鏈鎖反應(yīng)分析GNMT基因剔除鼠的基因型。正常GNMT等位基因產(chǎn)生 772bp片段，而被破壞而插入新霉素的等位基因產(chǎn)生409bp片段。+/+，野生型；+/_，GNMT雜 合型；-/-GNMT基因剔除鼠(D)顯示出利用西方墨點法分析證實GNMT蛋白質(zhì)，每一條包含 10 P g肝溶解產(chǎn)物。GNMT分子量為32kDa，GAPDH 內(nèi)部對照組。圖3顯示出GNMT-/-雄性小鼠在前脈沖抑制反應(yīng)中呈現(xiàn)出顯著的前脈沖抑制缺 乏。數(shù)據(jù)是以平均值士S.E.M.呈現(xiàn)；*p< 0.01.圖4顯示出利用TST和FST，GNMT-/_呈現(xiàn)出顯著于TST(A)和FST(B)中增加靜止 不動的時間。數(shù)據(jù)是以平均值士S.E.M.呈現(xiàn)；*p< 0.05。圖5顯示出GNMT基因剔除鼠與野生型老鼠在開放式空間活動力并無顯著差異。圖6顯示出GNMT基因剔除小鼠從旋轉(zhuǎn)平衡桿上對于短期潛伏有運動障礙的下降 趨勢。數(shù)據(jù)是以平均值士S. E. M.呈現(xiàn)；*p < 0. 05.圖7利用Q-PCR分析顯示在GNMT基因剔除公老鼠大腦皮質(zhì)中與阿茲海默癥關(guān)聯(lián) 的基因包括 APP，BACE1, BACE2, APH-1 a，GSK-3 3，MAPT, SNC a 及 IDE 等 mRNA 表現(xiàn)。數(shù)據(jù) 是以平均值士 S. E.M呈現(xiàn)；*p <0.05。圖8利用用免疫熒光影像顯示在神經(jīng)前驅(qū)細(xì)胞表現(xiàn)出巢蛋白(A)及GNMT(B)。圖9利用RT-PCR分析顯示GWT mRNA表現(xiàn)在野生型老鼠的腦情形。(A) GWT mRNA 位于老鼠不同腦區(qū)的部分。⑴嗅腦⑵皮層層⑶紋狀體⑷中腦(5)小腦(6)脊髓(7) 海馬體(8)視丘和下視丘(9)橋腦和延腦(10)腦干。(B)利用免疫組織化學(xué)染色法觀察野 生型老鼠腦部的GNMT的表現(xiàn)。
具體實施例方式在細(xì)胞模式中可以發(fā)現(xiàn)，GNMT表現(xiàn)于老鼠的神經(jīng)前驅(qū)干細(xì)胞；而在老鼠動物模式 中，GNMT基因也可以被觀察到于神經(jīng)前驅(qū)干細(xì)胞和腦部部分區(qū)域，如皮質(zhì)層、紋狀體及黑質(zhì) (substantia nigra)等區(qū)域表現(xiàn)。除此之外，有類似憂郁癥和精神分裂癥傾向的行為主要 表現(xiàn)在GNMT基因剔除鼠。這些結(jié)果表明在腦部功能以及發(fā)展過程中，GNMT可能扮演著重 要的作用。根據(jù)實驗結(jié)果顯示，GNMT基因剔除鼠腦部的多巴胺以及多巴胺的代謝物(二羥基 苯基乙酸)顯著的減少。另外，與野生型老鼠相比，我們觀察到GNMT基因剔除鼠在聽覺驚 嚇測試(acoustics tartle test)的前脈沖抑制反應(yīng)方面，呈現(xiàn)出顯著的缺乏情形，同時也 觀察到GNMT基因剔除鼠在懸吊尾巴實驗以及強(qiáng)迫游泳實驗中比較容易放棄掙扎，靜止不 動的時間顯著增加。從RotaRod滾輪實驗結(jié)果顯示，GNMT基因剔除鼠平衡運動能力不如野 生型老鼠。GNMT基因剔除鼠呈現(xiàn)類似憂郁癥和精神分裂癥的行為。利用微數(shù)組分析顯示， 在GNMT剔除的小鼠模式中，與阿茲海默癥相關(guān)的基因顯著增加。因此，本發(fā)明動物模式可 用于研究抑郁癥，精神分裂癥和阿茲海默癥。于本發(fā)明動物模型，其中該動物包括(但不限定于)哺乳動物、靈長類動物和嚿齒動物。較好的具體實施例為老鼠。本發(fā)明亦提供一種用于生產(chǎn)可表現(xiàn)出憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的病理狀 態(tài)的動物的方法，其包含經(jīng)由在GNMT基因座進(jìn)行再重組而破壞該動物的GNMT基因。病理 狀態(tài)的特點是在前脈沖抑制反應(yīng)中呈現(xiàn)出顯著前脈沖抑制缺乏，增加懸吊尾巴實驗和強(qiáng)迫 游泳實驗靜止不動的時間，或阿茲海默癥相關(guān)基因的表現(xiàn)量提升。在阿茲海默癥的相關(guān)基 因的表現(xiàn)方面，包括(但不限定于)BACE UBACE 2、APH_1、GSK_3、MAPT及IDE的表現(xiàn)量顯 著增加。本發(fā)明還提供了一種篩選用于預(yù)防或治療憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的候 選藥物的方法，包括(a)將潛在候選藥物投藥給予本發(fā)明的動物模式，(b)測量該動物對 于該候選藥物的反應(yīng)，(c)將該動物與具有野生型GNMT基因的動物的反應(yīng)相互比較，及(d) 基于該動物和該具有野生型GNMT基因的動物間所觀察出不同的反應(yīng)篩選出候選藥物。本文中所使用的"候選藥物"是指該組成物質(zhì)是正值研究其是否具有藥理或其 它活性，或者是已知具有藥理或其它活性，但目前正在測試是否在特定個體中有任何類型 的活性者，候選藥物包括核酸、多勝肽和化合物。候選藥物的療效是一個藥理活性的例子。 此外，臨床結(jié)果可以成為候選藥物活動的特點。本發(fā)明亦提供一種篩選用于治療憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的候選藥物的 方法，包括(a)提供一哺乳動物細(xì)胞其內(nèi)生GNMT基因有被破壞，其中該破壞會導(dǎo)致在相同 的條件下，該哺乳動物細(xì)胞的GNMT生物活性水平相較于野生型細(xì)胞有被降低，(b)將可能 的候選藥物投藥予步驟(a)的細(xì)胞，(c)將該細(xì)胞的反應(yīng)與具有野生型GNMT基因的細(xì)胞的 反應(yīng)相互比較，及(d)基于出該細(xì)胞和該具有野生型GNMT基因的細(xì)胞間所觀察的不同反應(yīng) 篩選出候選藥物。于本發(fā)明方法，其中該細(xì)胞是存在于基因剔除非人類哺乳動物內(nèi)，且較好 的細(xì)胞是腦部的神經(jīng)細(xì)胞。實施例1 :GNMT基因剔除鼠的制備構(gòu)建目標(biāo)靶定載體，將從噬菌體純株3-2和5-3消化得到的DNA片段插入質(zhì) 體-pBluescrip II KS中。使用Pst I將左臂從純株5-3切出，并將其插入pNeo載體中。 使用Hinc II將右臂從噬菌體純株3-2切出，并將其插入TK載體中。使用Not I將含有右 臂和TK基因的片段切出，并將其插入含有左臂的pNeo載體中，產(chǎn)生目標(biāo)靶定載體(圖1)。在該目標(biāo)靶定載體的新霉素基因(用以取代小鼠GNMT基因的外顯子1_4和部 分外顯子5)架構(gòu)兩個DNA片段(3. lkb和3. 7kb)。使用胸苷激酶基因作為負(fù)選擇標(biāo)記 (圖2A)。將40iig目標(biāo)靶定載體使用直線化，并藉由電穿孔方法引入胚胎干細(xì)胞(129/ Sv-derived)中。于利用南方墨點分析法篩選278個純株(圖2B)之后，將重組純株分離出 來并利用顯微注射到胚胎母細(xì)胞。得到4只雄性嵌合體小鼠，并將其用于繁殖雌性C57BL/6 小鼠。將灰色F1后代進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)以偵測出被破壞的等位基因的種系遺傳。將雜合 的F1雄性小鼠與雌性野生型C57B/6小鼠進(jìn)行回交，而產(chǎn)生出C57BL/6基因組背景的小鼠。開發(fā)出用以區(qū)分野生型(+/+)、GNMT雜合型(+/-)和GNMT剔除-/-小鼠的PCR 技術(shù)的。以下列示用于PCR的引子針對G匪T的引子為GNMT-F (5 ’ -GCGGCGGCCGCATGC TGGTGGAAGAGGGC)和 G 匪 T-R (5，-TTGCAGTCTGGCAAGTGAGC)；針對新霉素的引子為新霉 素-F (5 ‘ GTTCCTTGCGCAGCTGTGCT)和新霉素-R (5 ‘ -CGGCCACAGTCGATGAATCC)。正常GNMT等位基因經(jīng)由GNMT引子產(chǎn)生772bp片段，而受破壞的等位基因經(jīng)由新霉素引子產(chǎn)生409bp片段(圖2C)。利用西方墨點法分析肝臟內(nèi)GNMT蛋白的表現(xiàn)；結(jié)果顯 示，相對于野生型，GNMT+/-小鼠于肝臟內(nèi)表現(xiàn)的GNMT減少了幾乎50 %，而在GNMT-/-小鼠 的肝臟內(nèi)無法偵測到GNMT(圖2D)。實施例2 前脈沖抑制反應(yīng)該裝置包括兩個驚嚇室(Med Associates,Georgia,VT)0從野生型對照組選出一 只老鼠，而從GNMT缺陷組選出另一只老鼠同時進(jìn)行實驗。將每只老鼠放入背景值聲音60 分貝的聲音驚嚇室5分鐘適應(yīng)環(huán)境。接下來，給予10次驚嚇脈沖，平均每15秒給予一次刺 激(120分貝，40毫秒時間)。然后，在未來20分鐘內(nèi)隨機(jī)測量6次的分別給予無刺激(背 景噪音，68分貝)，只有前脈沖(72，76和84分貝，持續(xù)時間20毫秒)，只有驚嚇脈沖，以及 給予前脈沖后的80毫秒后再給予驚嚇脈沖。前脈沖抑制反應(yīng)(PPI)系定義為在有前脈沖存在下產(chǎn)生的驚嚇幅度，和在無前脈 沖存在下的驚嚇幅度相比所減少的量。％PPI = [1-(前脈沖試驗/單驚嚇試驗)]X100。 圖3顯示GNMT-/-小鼠在前脈沖刺激反應(yīng)中呈現(xiàn)出顯著前脈沖抑制缺乏。實施例3:懸吊尾巴實驗將8-12周雄鼠和雌鼠尾巴固定并懸吊。經(jīng)過'激動'或'逃避’的行為，老鼠呈 現(xiàn)不動的姿勢反映出沮喪狀態(tài)。記錄于5分鐘測試期間的靜止不動時間。圖4A結(jié)果顯示 出GNMT-/-小鼠呈現(xiàn)出的靜止不動的時間顯著的增加。實施例4 強(qiáng)迫游泳實驗將8-12周雄鼠和雌鼠(野生型n= 11，及基因剔除型n= 13)分別放置于充滿了 12厘米水深的長方形籠(高30厘米，直徑15厘米)(溫度22 士 1°C)長達(dá)6分鐘。整個過 程固定不動，于最后5分鐘作記錄。圖4BGNMT-/-小鼠減少動作，動作的定義是缺乏主動運 動和被動搖擺。實施例5 活動力測試分析選擇年齡8-12周的GNMT-/-動物及其野生型于長寬高90厘米X 90厘米X 30厘 米的開放空間進(jìn)行測試每只小鼠進(jìn)行10分鐘活動力測試，測試時間皆于17:00到19:00之間進(jìn)行。如圖 5 所示的結(jié)果是藉由 TrackMot 軟件偵測產(chǎn)生(Diagnostic &Research. Instruments Co.， Taoyuan, Taiwan)。兩種性別野生型和GNMT-/-的小鼠并無顯著差異。實施例6 :Rotarod旋轉(zhuǎn)滾輪實驗進(jìn)行測試當(dāng)天，所有動物將會轉(zhuǎn)移到測試房適應(yīng)環(huán)境至少半個小時，然后將老鼠 置于rotarod儀器上旋轉(zhuǎn)桿(直徑3厘米，堅固的防滑塑料制品)進(jìn)行測試。所有的老鼠 都適應(yīng)儀器的轉(zhuǎn)速至少連續(xù)進(jìn)行四次前測試，其中儀器旋轉(zhuǎn)桿的轉(zhuǎn)速會保持恒定(一次是 Orpm而另三次是5rpm)。每次前測試時間間隔為5分鐘。訓(xùn)練的動物能夠留在每分鐘5轉(zhuǎn) 速60秒連續(xù)三場試驗。三個試驗為每5固定轉(zhuǎn)速(14、18、22、26和30rpm)每一速度持續(xù) 150秒進(jìn)行直到動物掉下來。記錄每只動物能夠留在每一桿的旋轉(zhuǎn)速度的時間長度(直到 掉下來)。無論是完成或掉下來，在每次完成試驗每個動物被允許休息至少5分鐘單獨測試 速度和30分鐘的測試。整體的平均表現(xiàn)(0RP)三個試驗中每個老鼠的計算方法為梯形曲 線下面積在為于桿上的時間對上桿子轉(zhuǎn)動的速度(圖6)。實施例7 :RNA分離和RT PCR
使用TRIzol萃取液(Invitrogen，Carlsbad, CA)從組織萃取出總RNA。使用 superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)萃取出嗅球，紋狀體，中腦，小腦，脊髓，海 馬體，下視丘，髓質(zhì)和腦干核糖核酸(5y g)并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。聚合酶鏈反應(yīng)條件為 94°C下預(yù)熱變性5分鐘，之后進(jìn)行30個擴(kuò)增循環(huán)94°C下30秒，60°C下30秒，72°C下1分 鐘，接下來的步驟為72°C下10分鐘。引子序列如下GNMT使用的引子為m-GNMT_F(5’-GCG GCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC)及 m_GNMT-R(5，-TTGCAGTCTGGCAAGTGAGC)；針對 0 -肌動 蛋白的引子為肌動蛋白-F(5’-GGGCGCCCCAGGCACCA)及3 -肌動蛋白-R(5’-CTCCTTAA TGTCACGCCGATTTC)。實施例8 實時監(jiān)測PCR10個屬于阿茲海默癥形成途徑中的相關(guān)基因，以實時監(jiān)測PCR分析。利用引子表 達(dá)軟件設(shè)計實時監(jiān)測PCR的引子(Version 2. 0，AppliedBiosystems)，并利用BLAST驗證 序列的特異性。于總體積為10 yl的含有稀釋cDNA樣本、引子(lOOnM)和含核苷酸的熒光 染料反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。使用Applied Biosystems Prism 7000序列檢測系統(tǒng)來進(jìn)行 監(jiān)測分析。經(jīng)過一個循環(huán)后，經(jīng)由將PCR最終產(chǎn)物緩慢變性產(chǎn)生出一熔化曲線，以驗證擴(kuò)增 特異性。預(yù)測的循環(huán)閾值(CT)可利用EXCEL工作表分析。使用比較(^方法來決定相對于 GAPDH的相對基因表現(xiàn)倍率。用于實時監(jiān)測PCR的引子列示如下APP-F(5，-GCCAGCCAATACCGAAAATG)及APP-R(5，-GATGTTTGTCAGCCCAGAACCT)針對 APP ；BACE1-F (5，-ACGACTCTTTGGAGCCCTTCT)及BACE1-R (5，-AGAGCTGCAGGGAAAAGATGTT)針對 BACE1 與 BACE ；BACE2-F (5，-CACGGA AGACATAGCCAGCAA)及BACE2-R(5，-TCAGGGCATAGGACACAATCC)針對 BACE2 ；IDE-F(5，-CGTCCAATCTGATGGCGATT)及IDE-R(5' -AGAACAGCTTCACCACCAGGTTA)針對 IDE ；SNCA-F(5，-AAACACCTAAGTGACTACCACTTATTTCTAAA)及SNCA-R(5，-TCTTGGAGCAAATCACAACTTCTT)針對 SNCA ；MAPT-F(5' -AGCAATGAGAGATTTGAGACTTGGT)及MAPT-R(5' -CCTTCGCTGTCGCTGTTTC)針對 MAPT ；APH1 a -F(5，-ATGCACGGCTCCAGTATGG)及APH1 a -R(5，-GCAAAACGGAACACTTCCTGTAG)針對 APH1 a ；GSK3 3 -F (5，-CGGGACCCAAATGTCAAACT)及GSK3 3-R(5，-TCCGAGCATGTGGAGGGATA)針對 GSK3 3 ；GAPDH-F(5' -TGGTATCGTGGAAGGACTCA)及GAPDH-R(5' -AGTGGGTGTCGCTGTTGAAG)針對 GAPDH。(圖 7)實施例9 免疫熒光染色神經(jīng)前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)是遵循Zhou等人所發(fā)表的方式，經(jīng)過7到10天的培養(yǎng)基 培養(yǎng)后，利用0. 1M冰的PBS沖洗三次，然后用4%的三聚甲醛固定4小時后再用0. TritonX-100浸泡30分鐘。使用對抗(a)神經(jīng)前驅(qū)干細(xì)胞的巢蛋白的抗體(1 500) (BDBiosciences)，或(b)GNMT(l 250)的抗體染色的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，來檢驗神經(jīng)球體的 表現(xiàn)型表達(dá)(圖8)。實施例10 免疫組織化學(xué)染色取出野生型老鼠的腦組織固定于10%的中性緩沖福爾馬林。以溶解于PBS的30% 蔗糖溶液浸潤后，利用冰凍切片切下組織。將組織切片與濃度1/100的兔子抗GNMT血清 于4°C混合作用至隔天。經(jīng)由PBS中進(jìn)行清洗之后，將切片置于室溫下與生物素抗體及過 氧化物酶標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素(DAKO，Carpinteria, CA)培養(yǎng)10分鐘。將這些切片再與 3.3' - 二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽溶液培育以進(jìn)行成色反應(yīng)(圖9)。實施例11 統(tǒng)計分析根據(jù)基因型匯集所有數(shù)據(jù)，并確定每組平均值。結(jié)果以平均士SEM表現(xiàn)，并藉由 t-測試進(jìn)行分析，以P < 0. 05作為具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。熟悉本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的人士容易理解，本發(fā)明很適合進(jìn)行并取得上述目的和 優(yōu)點。細(xì)胞株、動物及產(chǎn)生彼等的過程和方法，為具代表性的最佳實施例、堪稱典范，而不是 用來限制本發(fā)明的范圍。其中的修改和其它用途將發(fā)生于此技術(shù)中。這些修改都包含發(fā)明 的精神并定義出申請專利范圍。這將是于所屬技術(shù)領(lǐng)域顯而易見的，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍之下，對本 發(fā)明進(jìn)行不同的替換和修改。所有專利及出版物說明書中提及的是表示那些一般在發(fā)明所屬技術(shù)的普通技巧。 所有專利和出版物由參考此中合并在同樣范圍上，每一單獨出版物明確地和單獨地被表明
由參考合并。本發(fā)明說明被描述出也許在沒有元素或有元素、限制或無限制時適宜地被實踐， 也沒有意圖在使用這種條件和排除任何等同的功能顯示和描述或其中的某些部分，各種的 修改是可能在于要求的發(fā)明范圍內(nèi)是被認(rèn)可的。因此，應(yīng)該了解到雖然本發(fā)明經(jīng)由最佳實施例及選定的功能具體揭露，本概念揭露的修改和變化可采取發(fā)明所 屬領(lǐng)域的技術(shù)，而這些修改和變化被認(rèn)為是本發(fā)明專利范圍內(nèi)所界定的附加要求。序列表<110>法瑪智財科技顧問股份有限公司<120> 一種憂郁癥、精神分裂癥和阿滋海默癥的小鼠動物模式<130>0783-YM-US<160>26<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>GNMT-F<220> <221>misc_feature0088]<222>(1). . (29)
0089]<400>1
0090]gcggcggccg catgctggtg gaagagggc 29
0091]<210>2
0092]<211>20
0093]<212>DNA
0094]<213>人工序列
0095]<220>
0096]<223>GNMT-R
0097]<220>
0098]<221>misc_feature
0099]<222>(1). . (20)
0100]<400>2
0101]ttgcagtctg gcaagtgagc20
0102]<210>3
0103]<211>20
0104]<212>DNA
0105]<213>人工序列
0106]<220>
0107]<223> 新霉素-F
0108]<220>
0109]<221>misc_feature
0110]<222>(1). . (20)
0111]<400>3
0112]gttccttgcg cagctgtgct20
0113]<210>4
0114]<211>20
0115]<212>DNA
0116]<213>人工序列
0117]<220>
0118]<223> 新霉素-R
0119]<220>
0120]<221>misc_feature
0121]<222>(1). . (20)
0122]<400>4
0123]cggccacagt cgatgaatcc20
0124]<210>5 0125]<211>29
0126]<212>DNA
<213>人工序列
<220><223>m-GNMT-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (29)<400>5gcggcggccg catgctggtg gaagagggc 29<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>m-GNMT-R<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>6ttgcagtctg gcaagtgagc20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>β-肌動蛋白-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (17)<400>7gggcgcccca ggcacca17<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>β-肌動蛋白-R<220><221>misc_feature<222>(1). . (23)
<400>8ctccttaatg tcacgccgat ttc 23<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>APP-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>9gccagccaat accgaaaatg20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>APP-R<220><221>misc_feature<222>(1). . (22)<400>10gatgtttgtc agcccagaac ct22<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>BACE1-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (21)<400>11acgactcttt ggagcccttc t21<210>12
<211>22<212>DNA<213>人工序列
11<220>
<223>BACE1-R <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (22) <400>12
agagctgcag ggaaaagatg tt 22
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BACE2-F <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (21) <400>13
cacggaagac atagccagca a 21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BACE2-R <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (21) <400>14
tcagggcata ggacacaatc c 21 <210>15 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>IDE-F <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (20) <400>15
0
CN
9 0
2 3
215
216
217
218
219
220 221 222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
2 3
5 6 7 8
o o o ^ o 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1rMrMrMrMrMrMrMrMrMrM/■ 、/■ 、/■ 、/■ 、/■ 、/■ 、/■.、/■.、/■.、/■.、 yt yt yt yt 222222222222222222222222222222222222^^-^-
ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo -(- -(- -(- -(- -(- -- -- -- -- -- ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ _—_ _—_ _—_ _—_ _—_ _—_ _—_ _—_ _—_cgtccaatct gatggcgatt20
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IDE-R <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (23) <400>16
agaacagctt caccaccagg tta23
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SNCA-F <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (32) <400>17
aaacacctaa gtgactacca cttatttcta aa 32 <210>18 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>SNCA-R <220>
<221>misc_feature <222>(1). . (24) <400>18
tcttggagca aatcacaact tctt24
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>45
7
8
72
73
74
CN<223>MAPT-F<220>
<221>misc_feature<222>(1). . (25)<400>19agcaatgaga gatttgagac ttggt 25<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>MAPT-R<220><221>misc_feature<222>(1). . (19)<400>20ccttcgctgt cgctgtttc19<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>APH1 alpha-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (19)<400>21atgcacggct ccagtatgg19<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>APH1 alpha—R<220><221>misc_feature<222>(1). . (23)<400>22gcaaaacgga acacttcctg tag 23
<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GSK3 beta—F<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>23cgggacccaa atgtcaaact20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GSK3 beta—R<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>24tccgagcatg tggagggata20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GAPDH-F<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>25tggtatcgtg gaaggactca20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GAPDH-R
15
<220><221>misc_feature<222>(1). . (20)<400>26agtgggtgtc gctgttgaag20
權(quán)利要求
一種用于研究憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的動物模式，其特征在于所述動物模式為其基因組已藉由在GNMT基因座進(jìn)行再重組(recombination)而被壞的哺乳動物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物模式，其特征在于所述哺乳類動物為靈長類或是嚿齒類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物模式，其特征在于所述嚿齒類動物是老鼠。
4.一種用于產(chǎn)生其呈現(xiàn)出憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的表病理狀態(tài)的動物的方 法，其特征在于包含藉由在GNMT基因座進(jìn)行再重組而破壞所述動物的GNMT基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述病理狀態(tài)的特征為在前脈沖刺激反 應(yīng)中呈現(xiàn)出顯著前脈沖抑制缺乏，懸吊尾巴實驗和強(qiáng)迫游泳實驗靜止不動的時間增加或是 提升阿茲海默癥相關(guān)基因的表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述阿茲海默癥相關(guān)基因為BACE1， BACE2, APH-1, GSK-3, MAPT，禾口 IDE。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述哺乳類動物為靈長類或是嚿齒類。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述動物是老鼠。
9.一種篩選用于治療憂郁癥、精神分裂癥和阿茲海默癥的候選藥物的方法，其特征在 于包含(a)將可能的候選藥物投藥給予如申請專利范圍第1項的動物模式；(b)測量所述動物對于所述候選藥物的反應(yīng)；(c)比較所述動物的反應(yīng)與具有GNMT基因野生型的動物的反應(yīng)；(d)基于所述動物與所述具有GNMT基因的野生型動物的間所觀察到對于所述藥物的 反應(yīng)差異而篩選出所述候選藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于；所述反應(yīng)為聽覺驚嚇反射，懸吊尾巴實 驗或是強(qiáng)迫游泳實驗。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于甘胺酸N-甲基轉(zhuǎn)移酵素(GNMT)動物模式及其用途。
文檔編號A01K67/027GK101874478SQ20091022543
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者楊境評, 陳宜民 申請人:法瑪智財科技顧問股份有限公司