Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，涉及落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明提供長白落葉松Csl D3基因的SNP標(biāo)記，為建立長白落葉松分子輔助育種技術(shù)提供了重要分子標(biāo)記。該SNP標(biāo)記位于長白落葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO：1所示序列的647bp處或680bp處，本發(fā)明的SNP標(biāo)記在鑒定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受長白落葉松的樹齡等限制，可大大加快長白落葉松的育種進(jìn)程。檢測方法準(zhǔn)確、簡便易操作。本發(fā)明用于長白落葉松育種領(lǐng)域。
【專利說明】
Cs I D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長白落葉松是我國林區(qū)主要的速生造林樹種之一，樹干端直、材質(zhì)堅韌、耐腐蝕， 具有生長快，材質(zhì)好、適應(yīng)性強、分布廣等特性，被廣泛的應(yīng)用于建筑、橋梁和木纖維工業(yè)原 料等多個方面，具有重要的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)價值。在優(yōu)良品種的定向培育中，與造紙有關(guān)的材性 性狀，如纖維素含量、木質(zhì)素含量等是僅次于生長指標(biāo)的主要考慮因素，高纖維素、低木質(zhì) 素的木材原料可以在很大程度上降低制成紙漿的成本與消耗。通過分子技術(shù)達(dá)到調(diào)節(jié)植物 次生代謝過程，提高植物纖維素含量降低植物木質(zhì)素含量，成為了目前解決這一難題的重 要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記位于長白落葉松 Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp處，此處堿基為C的長白落葉松的纖 維素含量顯著高于此處為T的長白落葉松。
[0005] 本發(fā)明還提供用于檢測上述與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，包 括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。
[0006] 本發(fā)明另一個Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記位于長白落 葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的680bp處，此處堿基為T的長白落葉松 的纖維素含量顯著高于此處為C的長白落葉松。
[0007] 本發(fā)明還提供用于檢測上述與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，包 括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。
[0008] 本發(fā)明還提供上述與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定長白落葉松高 纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其包括以下步驟：
[0009] 一、以長白落葉松針葉為材料，提取其基因組DNA;
[001 0]二、以提取的基因組DNA為模板，以引物F和R，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長白落葉松Csl D3基 因片段;所述引物卩為5'-176〇0：1'0^丁66(：1'11^-3'，引物1?為5'-(^0^0^(：1'(：1'1'0^厶丁61'-3'。 [0011]三、檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中647bp處的堿基為C，或者擴(kuò)增產(chǎn)物序 列中680bp處的堿基為T，則待測長白落葉屬于纖維素含量高的優(yōu)勢品種。
[0012]本發(fā)明的有益效果：
[0013]本發(fā)明主要篩選對長白落葉松Csl D3基因中與纖維素含量顯著相關(guān)的SNP位點， 利用SNP輔助育種早期選擇策略選取纖維素含量高的優(yōu)質(zhì)變異單株，為長白落葉松高效育 種提供更多的功能標(biāo)記。
[0014] 1、本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受長白落葉松的樹齡等限制，可大大加快長白落 葉松的育種進(jìn)程。
[0015] 2、本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確。
[0016] 3、本發(fā)明的檢測方法簡便易操作。
【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0018] 一:本實施方式Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP 標(biāo)記位于長白落葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp處，此處堿基為 C的長白落葉松的纖維素含量顯著高于此處為T的長白落葉松。
[0019]本實施方式篩選出與纖維素含量顯著相關(guān)的功能基因標(biāo)記位點，以此來選育優(yōu)良 針葉紙漿用材樹新品系，為在長白落葉松中進(jìn)行木材纖維品質(zhì)基因輔助育種以及工業(yè)用材 林的培育奠定良好的技術(shù)和材料基礎(chǔ)，同時為根據(jù)纖維素合成酶的關(guān)鍵SNP位點對長白落 葉松苗木的早期選擇提供標(biāo)準(zhǔn)和理論依據(jù)。
【具體實施方式】 [0020] 二:本實施方式與一不同的是：用于檢測Csl D3基因 中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記引物，其特征在于包括正向引物5'-TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。其它與 一相同。
【具體實施方式】 [0021] 三:本實施方式Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP 標(biāo)記位于長白落葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO: 1所示序列的680bp處，此處堿基為 T的長白落葉松的纖維素含量顯著高于此處為C的長白落葉松。
[0022]【具體實施方式】四：本實施方式與【具體實施方式】三不同的是：用于檢測Csl D3基因 中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記引物，其特征在于包括正向引物5'-TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。其它與【具體實施方式】 三相同。
[0023]【具體實施方式】五:本實施方式Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP 標(biāo)記在鑒定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其包括以下步驟：
[0024] 一、以長白落葉松針葉為材料，提取其基因組DNA;
[0025]二、以提取的基因組DNA為模板，以引物F和R，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長白落葉松Csl D3基 因片段;所述引物卩為5'-176〇0：1'0^丁66(：1'11^-3'，引物1?為5'-(^0^0^(：1'(：1'1'0^厶丁61'-3'。 [0026]三、檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中647bp處的堿基為C，或者擴(kuò)增產(chǎn)物序 列中680bp處的堿基為T，則待測長白落葉屬于纖維素含量高的優(yōu)勢品種。
[0027]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】五不同的是:步驟二中PCR反應(yīng)體系 為50μ1，具體如下：
[0029] 。其它與【具體實施方式】五相同。
[0030] 【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】五不同的是:步驟二中PCR反應(yīng)程序 為：
[0032]。其它與【具體實施方式】五相同。
[0033]為驗證本發(fā)明的有益效果，進(jìn)行以下實驗：
[0034] 1、植物材料
[0035]本試驗材料取自于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗林場長白落葉松第二種源試驗林，采 用完全隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)五次。1980年于和龍、露水河、小北湖等10個地點（種源)采種，第 二年育苗，第三年進(jìn)行造林，小區(qū)內(nèi)每個種源60株，雙行排列，共計3000株。1995年進(jìn)行隔行 去行間伐，2001年進(jìn)行隔一株去2株間伐。現(xiàn)從五個區(qū)組中選取I、II、IV、V區(qū)組，每個種源挑 取6個單株，10個種源共計240個個體。
[0036] 2、表型測定
[0037]對長白落葉松240株單株進(jìn)行了材性性狀表型測定，利用濾袋技術(shù)對纖維素 (cellulose)進(jìn)行測定，纖維素分析儀為ANKOM A2000i型。樣品用粉碎機粉碎好，用40目和 60目的篩子篩取，于102°C烘箱將水分烘干。
[0038] 1)中性洗滌纖維NDF的分析方法
[0039] 中性洗滌纖維檢測方法，消解后殘留物為半纖維素、纖維素和木質(zhì)素。
[0040] a.中性洗滌液的配制：稱取90g十二烷基硫酸鈉、55.83g的乙二胺四乙酸二鈉、 20.43g的四硼酸鈉、13.68g的磷酸氫二鈉和30ml的三乙二醇。將上述藥品與試劑加入3L去 離子水中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH為7.0，即為NDF中性洗滌液。在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
[0041 ] b.將配置好的NDF中性洗滌液放在ANKOM A2000i型纖維素分析儀左邊的架子上， 并在右邊的藍(lán)色塑料杯中加入208ml去離子水。熱水器加熱調(diào)至最大。
[0042] c.用記號筆給濾袋編號并稱重，取0.5g的樣品放入濾袋中，距濾袋口4mm處用封口 機封口。同時做一空白對照。
[0043] d.樣品脫脂:在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，將裝好樣品的濾袋放入3L的燒杯中，加入足量的丙 酮至樣品能全部覆蓋，震蕩并浸泡5-10min，將濾袋挑出，放置風(fēng)干。輕輕敲擊濾袋，使樣品 能平鋪于濾袋中。
[0044] e.濾袋放入儀器的托盤中，每個托盤放入3個樣品，最上層不放任何東西，托盤間 呈120°角放置，確保最上面的托盤放入重錘后可全部浸入洗滌液中，放入重錘。
[0045] f.開啟機器，待洗滌液浸滿液缸中加入20g無水亞硫酸鈉，至攪拌均勻。
[0046] g.NDF分析洗滌結(jié)束后，打開蓋子取出樣品，將樣品上的水?dāng)D壓干凈，浸入丙酮3-5min，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，放入烘箱102 °C烘干3h。
[0047] h.取出濾袋放置于干燥器中，待樣品冷卻后稱取重量。
[0048]公式計算：
[0049] NDF(as-received basis)% =(W3-(fflx Cl))x100 /W2
[0050] Wl=濾袋質(zhì)量 [0051 ] W2 =樣品質(zhì)量
[0052] W3 =消解后濾袋干重
[0053] C1 =灰分空白濾袋因素（點燃失重的空白/原空白值）
[0054] 2)酸性洗滌纖維ADF的分析方法
[0055]酸性洗滌纖維檢測方法，用硫酸和十六烷基三甲基溴化銨CTAB消解剩余的殘渣， 纖維殘留物主要是纖維素及木質(zhì)素。
[0056] a.稀硫酸配制:81ml的濃硫酸加入3L去離子水中，即配制成1.00N的硫酸溶液。
[0057] 酸性洗滌液的配置:20g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入到1L的1.00N的硫酸溶 液中，適當(dāng)攪拌使其溶解。
[0058] b.將配置好的ADF酸性洗滌液放在ANKOM A2000i型纖維素分析儀右的架子上。
[0059] c.將測量好NDF的樣品放入儀器托盤中，放入重錘。熱水器加熱調(diào)至最大。開啟機 器
[0060] d.ADF分析洗滌結(jié)束后，打開蓋子取出樣品，將樣品中的水輕輕擠壓干凈，浸入丙 酮3-5min，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，放入烘箱102 °C烘干3h。
[0061] e.取出濾袋放置于干燥其中，待樣品冷卻后稱取重量。
[0062]公式計算：
[0063] ADF(as-received basis)% =(W3-(fflx Cl))x100 /W2
[0064] Wl=濾袋質(zhì)量
[0065] W2 =樣品質(zhì)量
[0066] W3 =消解后濾袋干重
[0067] Cl=灰分空白濾袋因素（點燃失重的空白/原空白值）
[0068] 3)酸性洗滌木質(zhì)素 ADL的分析方法
[0069] a.配制72%的硫酸溶液:取734.69ml的濃硫酸，加入到265.31的蒸餾水中。
[0070] b.將ADF處理后的濾袋放入3L燒杯中，加足量的72%的硫酸，將濾袋浸沒即可。注： 濾袋必須完全干燥，待其冷卻至室溫后加入硫酸，如濾袋有水分，加入硫酸后會產(chǎn)生熱，容 易將濾袋中的樣品燒焦，影響測定結(jié)果。
[0071] C .將2L的燒杯放到3L的燒杯中，使濾袋完全浸沒在硫酸中，充分?jǐn)嚢铻V袋，并在 30min內(nèi)將2L燒杯上下提起大約30次。之后靜置3h。
[0072] d.將濾袋取出用流水沖洗樣品并浸泡，洗至pH為中性，將樣品中的水分?jǐn)D出。浸入 丙酮3-5min，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，放入烘箱102 °C烘干4h
[0073] e.放入烘箱中（102°C)干燥4h，之后放入干燥袋中冷卻至室溫，稱重，記錄數(shù)據(jù)。
[0074] f.提前準(zhǔn)備好坩堝并標(biāo)號，將坩堝干燥至恒重（250°C，2h即可），取出放入干燥其 中冷卻至室溫，稱重。將干燥的坩堝和濾袋一起放入馬弗爐中300°C碳化半小時，不要蓋蓋 子，然后再升溫至600°C，2h，取出放入干燥器中冷卻至室溫，稱重記錄數(shù)據(jù)。
[0075]公式計算：
[0076] ADL(%) = [(m2-mlx Cl)-((m4-m3)]x100 /m
[0077] 其中:ml為空袋質(zhì)量，g;m2為提取烘干后濾袋+樣品質(zhì)量，g;m3為坩堝質(zhì)量，g;m4為 坩堝+灰分質(zhì)量;C1為空白袋子校正系數(shù)(烘干后質(zhì)量/原來質(zhì)量）;m為樣品質(zhì)量。
[0078] 3、基因組DNA的提取
[0079]將采取的長白落葉松葉子及時貯藏在-80 °C冰箱保存。DNA采取改進(jìn)的CTAB法提 取。
[0080]提取前工作：1)將水浴鍋升溫至65°C;2)預(yù)熱提取緩沖液;3)配制比例為24:1的氯 仿和異戊醇混合液;4)將異丙醇放入冰箱中預(yù)冷。
[0081 ] 1)在1.5ml離心管中加入600yL CTAB提取液，將其放入65°C恒溫水浴鍋中預(yù)熱。稱 取1-1.5g嫩葉于酒精消過毒并用液氮冷凍過的研缽中，倒入液氮使其充分預(yù)冷，液氮揮發(fā) 至不再沸騰時研磨至粉末狀，可再次加入液氮使其研磨更充分，樣品研磨越細(xì)，DNA提取效 率越好。將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)熱的CTAB緩沖液中，上下顛倒混勻，放入65 °C水浴鍋中恒溫15min。 [0082] 2) 15min后加入600yL氯仿異戊醇混合液，充分顛倒混勾，12000rpm/min，離心 5min，抽取上清液于1.5ml離心管中。
[0083] 3)重復(fù)步驟2)。
[0084] 4)將上清液移入新的1.5ml的離心管中，加入400yL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫 靜置lOmin，可見白色絮狀沉淀，沉淀即為核酸。12000rpm/min，離心5min，棄掉上清液。 [0085] 5)加入500yL、70%乙醇洗滌沉淀，顛倒并旋轉(zhuǎn)離心管，洗去殘存的鹽離子及管壁 的異丙醇。12000rpm/min，離心2min。
[0086] 6)棄掉上清液，將離心管倒置在吸水紙上去除殘液。沉淀風(fēng)干后，溶于30yL DEPC 緩沖液或去離子水中溶解DNA。加入2yL RNase消化處理1 h，得到高質(zhì)量的DNA樣品。
[0087] 7)將提取的DNA置于-20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0088] 4、引物設(shè)計與篩選
[0089]根據(jù)長白落葉松轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果檢索到的Csl D3基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計 引物(如表1所示），以實驗采集的長白落葉松個體的DNA為模板擴(kuò)增基因片段克隆測序。 [0090]表1目的基因引物信息
[0092] 5、基因克隆
[0093] 1)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件
[0094] 表2 50μ1反應(yīng)體系
[0096]反應(yīng)條件：
[0098] 2)PCR產(chǎn)物的回收
[0099] 將PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，利用北京全式金Easy Pure Quick Gel ExtractionKit膠回收試劑盒純化和回收目的條帶。
[0100] a.切取瓊脂糖凝膠中的目的DNA條帶，放入干凈的離心管中稱重，每100mg凝膠加 入3倍體積Gel Solubilization Buffer溶液(Yellow)。
[01 01 ] b.水浴10min，每2-3min混合，確保膠塊完全融化，當(dāng)膠塊完全融化后，觀察溶液的 顏色，若為紫色，則加入3M pH5.2醋酸鈉，調(diào)顏色為黃色。
[0102] c.待溶液靜置降至室溫時，10000rpm/min離心lmin，棄流液。
[0103] d ·加入650μ1 Wash BufTer(使用前已加入 100% 乙醇），10000rpm/min離心lmin， 棄流液。
[0104] e.重復(fù)步驟d，再 10000rpm/min空離l_2min，去除殘留的Wash Buffer。
[0105] f.將離心柱至于新的離心管中，打開蓋子靜置l_2min，使殘留的乙醇揮發(fā)干凈，在 離心柱中央加入30μ1去離子水(pH>7.0)，去離子水提前在65°C水浴中預(yù)熱，室溫靜止5min。
[0106] g. 10000rpm/min 離心 lmin，洗脫的 DNA 保存于-20°C 冰箱。
[0107] 3)回收產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化并測序
[0108] 克隆載體選用TaKaRa公司pMD18-T Vector載體。
[0109] 感受態(tài)選用北京全式金Trans5aChemically Competent Cell。
[0110] a.體系全量5μ1，如表3所示。
[0111] 表3 5μ1載體體系
[0113] b.l6°C 反應(yīng) lh。
[0114] c.取50μ1感受態(tài)細(xì)胞冰上助融，加入5μ1上述體系，輕輕混勻，冰上靜置30min。
[0115] d. 42 °C水浴熱激45秒，快速置于冰上冰浴靜置2min。
[0116] e.離心管中加入500μ1不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C200rmp/h培養(yǎng)lh。
[0117] f.吸取150μ1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于LB固體培養(yǎng)基中（已加入50mg/ml氨芐），至 液體被吸收。倒置平板于37 °C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)12h。
[0118] g.隨機挑取6個白斑分別于50ml錐形瓶中，加入5ml LB液體培養(yǎng)基（已加入50mg/ ml氨芐），37°C200rpm/h培養(yǎng) 12h。
[0119] h.取600μ1菌液與600μ150%滅菌甘油于2ml離心管中混勻，保存菌種送上海生物 工程有限公司測序，即為長白落葉松Csl D3基因。
[0120] 6、SNP位點的篩選
[0121] 將測序獲得的克隆片段利用NCBI的在線工具BLAST中的Nucleotide BLAST進(jìn)行同 源序列比對。序列采用Bioedit進(jìn)行編輯，其中Clustal W程序可將同一基因的多個序列進(jìn) 行比對，頻率超過10%確定為常見SNP，同時利用NCBI在線程序VecScreen去除載體序列。結(jié) 合每一條序列的測序峰值圖進(jìn)行基因分型分析并確定SNP位點，在同一個位點上出現(xiàn)兩個 峰，即為雜合子，純合子為單峰。
[0122] 在Csl D3基因中發(fā)現(xiàn)56個SNP位點，分別為：
[0123] SNPl(Csl D3.g.32C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的32bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和C兩個等位基因；
[0124] SNP2(Csl D3.g.36A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的36bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0125] SNP3(Csl D3.g.50C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的50bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0126] SNP4(Csl D3.g.67A>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的67bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和T兩個等位基因；
[0127] SNP5(Csl D3.g.68G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的68bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0128] SNP6(Csl D3.g.69C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的69bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0129] SNP7(Csl D3.g.74C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的74bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0130] SNP8(Csl D3.g.94C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的94bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0131] SNP9(Csl D3.g.97A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的97bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0132] SNP10(Csl D3.g.l26A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的126bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0133] SNPll(Csl D3.g.l27A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的127bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0134] SNP12(Csl D3.g.l73G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的173bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0135] SNP13(Csl D3.g.213A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的213bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0136] SNP14(Csl D3.g.219G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的219bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0137] SNP15(Csl D3.g.233A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的233bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0138] SNP16(Csl D3.g.241C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的241bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0139] SNP17(Csl D3.g.253A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的253bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0140] SNP18(Csl D3.g.255C>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的255bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和G兩個等位基因；
[0141] SNP19(Csl D3.g.258A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的258bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0142] SNP20(Csl D3.g.277G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的277bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0143] SNP21(Csl D3.g.286C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的286bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0144] SNP22(Csl D3.g.288A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的288bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因
[0145] SNP23(Csl D3.g.312G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的312bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0146] SNP24(Csl D3.g.318A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的318bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0147] SNP25(Csl D3.g.322C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的322bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0148] SNP26(Csl D3.g.323C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的323bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0149] SNP27(Csl D3.g.363A>C)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的363bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0150] SNP28(Csl D3.g.398A>C)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的398bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和C兩個等位基因；
[0151] SNP29(Csl D3.g.408A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的408bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0152] SNP30(Csl D3.g.422A>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的422bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和T兩個等位基因；
[0153] SNP31(Csl D3.g.428C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的428bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0154] SNP32(Csl D3.g.435C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的435bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0155] SNP33(Csl D3.g.444A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的444bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0156] SNP34(Csl D3.g.487C>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的487bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和G兩個等位基因；
[0157] SNP35(Csl D3.g.517A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的517bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和G兩個等位基因；
[0158] SNP36(Csl D3.g.519C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的519bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0159] SNP37(Csl D3.g.534A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的534bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0160] SNP38(Csl D3.g.542G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的542bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和T兩個等位基因；
[0161] SNP39(Csl D3.g.581C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的581bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0162] SNP40(Csl D3.g.594C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的594bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和Τ兩個等位基因；
[0163] SNP41(Csl D3.g.597A>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的597bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和Τ兩個等位基因；
[0164] SNP42(Csl D3.g.605A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的605bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0165] SNP43(Csl D3.g.626C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的626bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0166] SNP44(Csl D3.g.647C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的647bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和Τ兩個等位基因；
[0167] SNP45(Csl D3.g.660G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的660bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和Τ兩個等位基因；
[0168] SNP46(Csl D3.g.671A>C)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的671bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和C兩個等位基因；
[0169] SNP47(Csl D3.g.680C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的680bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0170] SNP48(Csl D3.g.686A>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的686bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和T兩個等位基因；
[0171] SNP49(Csl D3.g.704A>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的704bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和Τ兩個等位基因；
[0172] SNP50(Csl D3.g.722G>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的722bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在G和Τ兩個等位基因；
[0173] SNP51(Csl D3.g.730A>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的730bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在Α和G兩個等位基因；
[0174] SNP52(Csl D3.g.757A>C)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的757bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和C兩個等位基因；
[0175] SNP53(Csl D3.g.768C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的768bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因；
[0176] SNP54(Csl D3.g.775C>G)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的775bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和G兩個等位基因；
[0177] SNP55(Csl D3.g.777A>C)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的777bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在A和C兩個等位基因；
[0178] SNP56(Csl D3.g.780C>T)，該SNP位點存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的780bp，在基因型檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，該位點存在C和T兩個等位基因。
[0179] 7、關(guān)聯(lián)分析
[0180]對篩選出的SNP標(biāo)記基因型與纖維素含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行 單因素方差分析(AN0VA)找到與纖維素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記。通過關(guān)聯(lián)分析，在長白落 葉松Csl D3基因中找到2個與纖維素含量顯著相關(guān)的SNP位點，分別為：
[0181] SNP 44(Csl D3g.647C>T)在長白落葉松中的基因型檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點存在C 和T兩個等位基因，頻率分別為0.13和0.87，基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點存在CC和TT基因型， 頻率分別為0.13、0.87。SNP44位于外顯子上，同義突變。多重比較分析結(jié)果表明SNP44的CC 基因型長白落葉松纖維素含量為0.6224 ± 0.0257，與TT基因型纖維素含量0.5983 ± 0.0301 差異極顯著(P = 〇.0002)，基因型為CC的長白落葉松具有較高的纖維素。
[0182] SNP 47(Csl D3g.680C>T)在長白落葉松中的基因型檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點存在C 和T兩個等位基因，頻率分別為0.20和0.80，基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點存在CC和TT基因型， 頻率分別為0.20和0.80ΑΝΡ47位于外顯子上，同義突變。多重比較分析結(jié)果表明SNP47的CC 基因型長白落葉松纖維素含量為0.5927 ± 0.0281，與ΤΤ基因型纖維素含量0.6034 ± 0.0318 差異顯著(Ρ = 〇.0500)，基因型為ΤΤ的長白落葉松具有較高的纖維素。
[0183] 表4 Csl D3基因與長白落葉松纖維素顯著關(guān)聯(lián)單個SNP位點(Ρ值）
【主權(quán)項】
1. Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于該SNP標(biāo)記位于 長白落葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp處，此處堿基為C的長白 落葉松的纖維素含量顯著高于此處為T的長白落葉松。2. 用于檢測權(quán)利要求1所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記 引物，其特征在于包括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '和反向引物5 ' - CTCCACCACTCTTCTAATGT-3'。 3. Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于該SNP標(biāo)記位于 長白落葉松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO: 1所示序列的68化P處，此處堿基為T的長白 落葉松的纖維素含量顯著高于此處為C的長白落葉松。4. 用于檢測權(quán)利要求3所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記 引物，其特征在于包括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '和反向引物5 ' - CTCCACCACTCTTCTAATGT-3'。5. 權(quán)利要求1所述Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定長白 落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其包括W下步驟： 一、 W長白落葉松針葉為材料，提取其基因組DNA; 二、 W提取的基因組DNA為模板，W引物巧PR，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長白落葉松Csl D3基因片 段;所述引物F為 5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '，引物R為 5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。 Ξ、檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中647bp處的堿基為C，則待測長白落葉屬于 纖維素含量高的優(yōu)勢品種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒 定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為50μ1，具體 如下： !〇χ PC民 Buffer 5μ1 2,5 niM dNTP Mix 4μ1 IQ μΜ正反向剝物 各1μ1 5 U/liL Taq DN Apolymerase ΙμL 娜販D職 4μ1 dd H2O 叩化 50μ] ο，7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒 定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)程序為： 預(yù)變性 變性 退乂 延伸 循環(huán)次數(shù)補延伸 保存 94 "C 94'C 58TJ 72'C 30 72'C 4"G 3min 觀 s 45.s 45 s 7min 。8. 權(quán)利要求3所述Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定長白 落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其包括W下步驟： 一、W長白落葉松針葉為材料，提取其基因組DNA; 二、W提取的基因組DNA為模板，W引物F和R，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長白落葉松Cs 1 D3基因片 段;所述引物F為 5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '，引物R為 5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。 S、檢巧UPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中680bp處的堿基為T，則待測長白落葉屬于 纖維素含量高的優(yōu)勢品種。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒 定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為50μ1，具體 如下： lOxPCRBuffijr 5μ1 2.5 mM clNTP Mix 4μ1 .1.0 μΜ正反向引物 各1 μ1 5 υ/μL TaqDN Apolymerase 1μ1 模板DNA 4μ1 'd.過，陡Ο up 化 5〇μ110. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的Csl D3基因中與長白落葉松纖維素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒 定長白落葉松高纖維素優(yōu)勢品種中的應(yīng)用，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)程序為： 預(yù)變性 變性 退火 延伸 循環(huán)次數(shù)補延伸 保存 94 它 ：94°仁1 如°C 72 υ 30 72 °C 4°C 3min 30 & 45 S 4：5& 7min 。
【文檔編號】C12N15/11GK105936938SQ201610473452
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】張磊, 趙佳麗, 張含國
【申請人】東北林業(yè)大學(xué)