一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其包括以下各組分：Tris的濃度為10mM?100mM；牛磺酸的濃度為10mM?200mM。本發(fā)明的高效轉(zhuǎn)膜緩沖液相對(duì)于目前常用的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)膜緩沖液相比，使用了緩沖能力更強(qiáng)的?；撬岢煞?，提高了緩沖液在電泳時(shí)的緩沖能力，對(duì)分子量范圍寬泛的蛋白質(zhì)分子都有很高的轉(zhuǎn)膜效率，可以縮短蛋白轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，同時(shí)，該緩沖液在電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量較低，不需要借助冰袋等來(lái)降溫，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)膜時(shí)的操作，且需要的甲醇濃度更低，在10％的濃度就可以實(shí)現(xiàn)較好的轉(zhuǎn)膜效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)印跡法即Western Blot，是分子生物學(xué)，免疫遺傳學(xué)和生物化學(xué)中常見(jiàn)的 一種實(shí)驗(yàn)方法，是將電泳分離后的細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支撐物上，如硝酸 纖維素膜(NC膜）、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜），再用特異性抗體檢測(cè)特定抗原的一種蛋白質(zhì) 檢測(cè)技術(shù)。如今已廣泛應(yīng)用于抗體活性檢測(cè)、疾病早期診斷和蛋白質(zhì)水平表達(dá)研究等多個(gè) 方面。轉(zhuǎn)膜是蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要的步驟，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離后 的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜步驟，即從PAGE膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上，才能用各種方法進(jìn)行 Western Blot的檢測(cè)和顯色。
[0003] 轉(zhuǎn)膜過(guò)程通常是在半液體或液體環(huán)境中進(jìn)行的，轉(zhuǎn)膜緩沖液可以給電場(chǎng)提供介 質(zhì)，讓蛋白在電場(chǎng)力的作用下從負(fù)極向正極泳動(dòng)，因此轉(zhuǎn)膜緩沖液在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率中起 重要的作用。目前常用的轉(zhuǎn)膜緩沖液都是基于Tris-Glycine，，構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)膜緩沖液系統(tǒng)。 用該轉(zhuǎn)膜緩沖液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移蛋白時(shí)，電泳液溫度會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加，高溫會(huì)降低轉(zhuǎn)膜的 效果，還會(huì)使得PAGE膠和固相支撐物發(fā)生位移，蛋白條帶發(fā)生變形等情況發(fā)生，因此常需要 加入冰袋或者在冰上轉(zhuǎn)膜來(lái)降低轉(zhuǎn)膜時(shí)產(chǎn)生的高溫。此外，Tris-Glycine轉(zhuǎn)膜緩沖液對(duì)高 分子量的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效果較低，只能讓部分大分子蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至固相支撐物上。該 體系還需加入20%的甲醇、SDS等物質(zhì)，其中甲醇被大眾所熟知的，是一種具有毒性的物質(zhì)， 高濃度的甲醇對(duì)人體會(huì)造成強(qiáng)的傷害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種高效的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩 沖液及其制備方法。在該體系中，加入了一種親水性很強(qiáng)的極性氨基酸，即牛磺酸，能為電 泳緩沖液提供很強(qiáng)的緩沖能力。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其包括以下各組分：
[0007] Tris的濃度為lOmM-lOOmM;牛磺酸的濃度為10mM-200mM。
[0008] 進(jìn)一步地，包括以下各組分:Tr i s的濃度為1 OmM;?；撬岬臐舛葹? OmM。
[0009] 進(jìn)一步地，包括以下各組分:Tr i S的濃度為100mM;?；撬岬臐舛葹?00mM。
[0010] 進(jìn)一步地，包括以下各組分:Tr i S的濃度為40mM;牛磺酸的濃度為70mM。
[0011] 進(jìn)一步地，還包括以下組分：甲醇的體積分?jǐn)?shù)為5-10%和/或SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0·01-0·05%〇
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)方面公開(kāi)了一種高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液的制備方法，具體包括以 下步驟：
[0013] (1)稱(chēng)量下列試劑，置于1000ml燒杯中：
[0014] Tris 10-100mM;?；撬?10-200mM;SDS 0·卜0.5g;
[0015 ] (2)向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?br>[0016] (3)加入50-100ml的甲醇，加去離子水將溶液定容至1000ml后室溫保存。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)方面公開(kāi)了一種高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液的使用方法，具體包括以 下步驟：
[0018] a.將PAGE凝膠浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘；
[0019] b.根據(jù)凝膠的大小裁剪膜和濾紙，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘，如果使用PVDF 膜需要用甲醇浸泡飽和5-10秒鐘；
[0020] c.裝配轉(zhuǎn)移三明治轉(zhuǎn)膜體系：依次裝配海綿、3層濾紙、凝膠、3層濾紙、海綿;每層 放好后，將氣泡趕去；
[0021] d.將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中，放入三明治轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，開(kāi)始 設(shè)置0.3A的恒流電泳。
[0022]?；撬?Taurine)又稱(chēng)β-氨基乙磺酸，為無(wú)色或白色斜狀晶體，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 該分子中同時(shí)具有很強(qiáng)的酸性和堿性官能團(tuán)，在水中可電離，具有很強(qiáng)的親水性，是一種極 性氨基酸，具有很強(qiáng)的緩沖能力。Tris又稱(chēng)三羥甲基丙烷，一種白色結(jié)晶或粉末，為弱堿性。 常用作生物緩沖液，是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液等主要成分之一。還可以在轉(zhuǎn)膜緩 沖液中包含甲醇、SDS等成分，協(xié)同蛋白質(zhì)從PAGE轉(zhuǎn)移到固相支撐物上。
[0023]本發(fā)明的轉(zhuǎn)膜緩沖液至少包含兩種成分，即Tris和?；撬岬乃芤?。每種成分在 轉(zhuǎn)膜緩沖液中的濃度分別在l〇-l〇〇mM和10-200mM之間。實(shí)驗(yàn)中，使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)膜緩沖液， 在從PAGE凝膠向印跡膜(如PVDF膜、NC膜)轉(zhuǎn)移分子量范圍寬泛(如180KD-10KD)蛋白時(shí)，與 常規(guī)的緩沖液相比（Tris-Glycine體系），該緩沖液顯示更高的轉(zhuǎn)移能力，可高效地完成蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)移，不論大分子量和小分子量的蛋白質(zhì)，縮短蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜的時(shí)間。常規(guī)的轉(zhuǎn)膜緩沖液 在電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的熱，使得電泳槽內(nèi)緩沖液溫度快速的升高，而本發(fā)明的轉(zhuǎn)膜液在電 泳時(shí)，產(chǎn)生的熱量較小，完全可以不用借助于冰袋等來(lái)降溫。
[0024]本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是：
[0025]本發(fā)明的高效轉(zhuǎn)膜緩沖液相對(duì)于目前常用的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)膜緩沖液相比，使用了緩沖能 力更強(qiáng)的?；撬岢煞?，提高了緩沖液在電泳時(shí)的緩沖能力，對(duì)分子量范圍寬泛的蛋白質(zhì)分 子都有很高的轉(zhuǎn)膜效率，可以縮短蛋白轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，同時(shí)，該緩沖液在電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量較 低，不需要借助冰袋等來(lái)降溫，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)膜時(shí)的操作，且需要的甲醇濃度更低，在10%的濃 度就可以實(shí)現(xiàn)較好的轉(zhuǎn)膜效果。
【附圖說(shuō)明】
[0026]附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0027] 圖1是本發(fā)明轉(zhuǎn)膜緩沖液在0.3A恒流，20分鐘轉(zhuǎn)移至PVDF膜的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí) 施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] (1)稱(chēng)量下列試劑，置于1000ml燒杯中：
[0031] Tris 4g;?；撬?.07mol;SDS 0.15g;
[0032] (2)向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?br>[0033] (3)加入50-100ml的甲醇，加去離子水將溶液定容至1000ml后室溫保存。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] (1)稱(chēng)量下列試劑，置于1000ml燒杯中：
[0036] Tris O.Olmol;牛橫酸O.Olmol ;SDS 0· lg;
[0037] (2)向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢杌靹颍?br>[0038] (3)加入50-100ml的甲醇，加去離子水將溶液定容至1000ml后室溫保存。
[0039] 實(shí)施例3
[0040] (1)稱(chēng)量下列試劑，置于1000ml燒杯中：
[0041] TrisO · lmol;牛橫酸0 · 2mol; SDS 0 · 5g;
[0042 ] (2)向燒杯中加入約600m 1的去離子水，充分?jǐn)嚢杌旃矗?br>[0043] (3)加入50-100ml的甲醇，加去離子水將溶液定容至1000ml后室溫保存。
[0044] ( - )使用實(shí)施例1~3制備的轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)對(duì)PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜的效果，取 5ul的PageRuler? Prestained Protein Ladder樣品加入到PAGE凝膠孔中，電泳完畢之后， 按上述方法經(jīng)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)膜條件為0.3A恒流，時(shí)間為20分鐘，停止電泳，取出樣品經(jīng)行 觀察，如圖1所示，不同分子量的蛋白都完全轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PAGE凝膠上已觀察不出還有 蛋白的殘留。
[0045] (二)常規(guī)的轉(zhuǎn)膜多采用以下兩種配方，分別為：
[0046]對(duì)照案例l:Tris 5.8g，甘氨酸2.9g，SDS 0.376g，20% 甲醇
[0047] 對(duì)照案例2:Tris 3.05g，甘氨酸14.4g，20%甲醇
[0048] 將上述的對(duì)照案例1，對(duì)照案例2的轉(zhuǎn)膜緩沖液和本發(fā)明的高效轉(zhuǎn)膜緩沖液電泳經(jīng) 行檢測(cè)比較，取5ul的PageRuler? Prestained Protein Ladder樣品及HEK293細(xì)胞的裂解 物加入到PAGE凝膠孔中，電泳完畢之后，按上述方法經(jīng)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，電流設(shè)定為恒流0.3A， 不同時(shí)間段觀察電壓的變化及溫度的變化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)膜緩沖液的電壓一直維持在70V左 右，而對(duì)照案例緩沖液電壓都超了 100V以上，具體變化見(jiàn)下表：
[0049]
[0050] 由上表可以看出，同時(shí)使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)膜液產(chǎn)生的熱量和對(duì)照案例的產(chǎn)生的熱量 要小，溫度上升不明顯，維持在一個(gè)溫和的環(huán)境下完成電泳的過(guò)程。
[0051] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其特征在于，包括以下各組分： Tris的濃度為lOmM-lOOmM;牛磺酸的濃度為10mM-200mM。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其特征在于，包括以下各組分:Tris的 濃度為10mM;?；撬岬臐舛葹?0mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其特征在于，包括以下各組分:Tris的 濃度為l〇〇mM;?；撬岬臐舛葹?00mM。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其特征在于，包括以下各組分:Tris的 濃度為40mM;?；撬岬臐舛葹?0mM。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一所述的高效蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液，其特征在于，還包括以下組分： 甲醇的體積分?jǐn)?shù)為5-10%和/或SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-0.05%。6. -種高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟： ⑴稱(chēng)量下列試劑，置于1000ml燒杯中： Tris 10-100mM;牛磺酸 10-200mM;SDS 0.1-0.5g; (2) 向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢杌旃矗? (3) 加入50-100ml的甲醇，加去離子水將溶液定容至1000ml后室溫保存。7. -種高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液的使用方法，其特征在于，具體包括以下步驟： a. 將PAGE凝膠浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘； b. 根據(jù)凝膠的大小裁剪膜和濾紙，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘，如果使用PVDF膜需 要用甲醇浸泡飽和5-10秒鐘； c. 裝配轉(zhuǎn)移三明治轉(zhuǎn)膜體系：依次裝配海綿、3層濾紙、凝膠、3層濾紙、海綿;每層放好 后，將氣泡趕去； d. 將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中，放入三明治轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，開(kāi)始設(shè)置 0.3A的恒流電泳。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK105866220SQ201610239178
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】楊勇, 劉永雙
【申請(qǐng)人】蘇州新賽美生物科技有限公司