一株中等嗜熱地衣芽孢桿菌及其在高溫含油污水處理中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于高溫采油污水處理領(lǐng)域的微生物新技術(shù)，設(shè)及一株產(chǎn)耐高溫脂肪酶中 等嗜熱地衣芽抱桿菌及其在高溫含油污水處理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油是我國最重要的能源之一，2014年我國石油產(chǎn)量高達(dá)2.1億噸，在生產(chǎn)、生活 中都發(fā)揮著十分重要的作用。然而石油開采過程中產(chǎn)生大量含石油控的高溫（約50°C)污 水，如不能得到有效處理，將會對環(huán)境和人類健康造成巨大危害。
[0003] 微生物法具有處理成本低、操作簡便、石油類污染物降解效果好、不易引起二次污 染等特點而在采油污水處理領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。浙江海洋學(xué)院選取油污處理廠長期受油污 污染的±壤進(jìn)行富集化培養(yǎng)，篩選得到對柴油石油控具有分解作用的石油降解菌；中國海 洋大學(xué)開展高效石油降解菌的篩選及其在油田廢水深度處理中的應(yīng)用，從石油污染的±壤 和水體中富集、分離到12株高效石油降解菌，各單菌株的降油率為40.3%~57.6%，其中Ξ 種菌可耐受40°C的溫度。沈陽大學(xué)從迂河油田和大慶油田污染±壤中分離出兩株高效石油 降解菌，分別為枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)。除油率分別為39%和48%。生長溫度分別為25~35°C和28~40°C。但傳統(tǒng) 方法中用到的微生物多為嗜中溫微生物，因此在處理高溫采油污水時需要采用冷卻塔先降 溫，然后再采用微生物處理。該方法存在能耗大、產(chǎn)生揮發(fā)性氣體污染的問題。
[0004] 近年來，嗜熱細(xì)菌引起了越來越多科學(xué)家的重視和興趣。國內(nèi)北京大學(xué)郝瑞霞教 授早在2003年就開始降解石油控嗜熱細(xì)菌篩選。南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點 實驗室也長期從事石油控降解菌包括嗜熱細(xì)菌的篩選及應(yīng)用研究。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈標(biāo)教授 長期從事燒控代謝和嗜熱細(xì)菌的相關(guān)研究，分離獲得MH-1等具有石油控降解能力的嗜熱細(xì) 菌，并對其alkB基因的相關(guān)特性進(jìn)行了研究，運些前期研究為嗜熱細(xì)菌的驅(qū)油和污水處理 應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。
[0005] 中國石油大學(xué)公開了嗜熱菌在處理稠油污水方法中的應(yīng)用，（a)將嗜熱菌劑負(fù)載 于填料上；（b)將稠油污水W及負(fù)載于所述填料上的嗜熱菌劑共同置于反應(yīng)單元中。查閱大 量文獻(xiàn)和專利書，發(fā)現(xiàn)未見耐熱地衣芽抱桿菌在高溫(45~60°C)含油廢水處理中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] (1)本發(fā)明提供一株能應(yīng)用于處理采油污水和石油污染的中等嗜熱微生物菌株地 衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) 〇
[0007] (2)本發(fā)明將所述的微生物菌株可高效處理高溫采油污水和石油污染，并具有產(chǎn) 生耐高溫脂肪酶的能力。
[000引本發(fā)明上述目的通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0009]本發(fā)明提供了一株中等嗜熱地衣芽抱桿菌，該菌是從中國石油化工集團(tuán)公司華東 分公司泰州采油廠石油污染的±壤中W原油為唯一碳源的情況下55°C反復(fù)馴化獲得，命名 為 H43。
[0010] H43的細(xì)胞形態(tài)特征如下：在LB上培養(yǎng)2地的菌落直徑為4-5mm，菌落形態(tài)呈圓形， 邊緣整齊，表面濕潤光滑，淺黃色；油鏡下菌體呈短桿狀;生長溫度在40-60°C，最適生長溫 度50°C dpH為6~9，鹽度0~4%。菌體大小為(0.7~0.9皿）X (2.0~3.0皿），單個或短鏈排 列，端生鞭毛，中生芽抱，革蘭氏陽性菌。
[0011] 表1:地衣芽抱桿菌的生化特性
[0012]
[0013] 注：V'表示反應(yīng)陽性表示反應(yīng)陰性
[0014] 參照《Bergey's Mannual of Syetematic Bacteriology》的內(nèi)容，根據(jù)形態(tài)特征、 生理生化特征和16sDNA分子鑒定，H43為地衣芽抱桿菌屬(Bacillus licheniformis)。
[001引本發(fā)明H43菌株對55°C含1 %原油的污水處理7d后石油控的降解率達(dá)到46% ;對泰 州油田^相分離器出水口取得的高溫含油污水（156mg/L石油控含量）處理效率高達(dá) 89.9%，同時產(chǎn)生脂肪酶。W上試驗表明地衣芽抱桿菌屬(Bacillus lichenifo;rmis)H43在 運用于高溫含油廢水的處理上效果明顯，且在處理污水的同時產(chǎn)多種具有重要應(yīng)用價值的 生物工程產(chǎn)品。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43的原子力顯微鏡圖片 化43菌株原子力顯微鏡視圖）；
[0017] 圖2為本發(fā)明地衣芽抱桿菌的16s rDNA鑒定序列化43菌株經(jīng)寶生物工程(大連)有 限公司測序獲得16s rDNA基因序列）；
[001引圖3為本發(fā)明地衣芽抱桿菌經(jīng)NCBI BLAST之后得到的序列進(jìn)化樹化43菌株經(jīng)NCBI BLAST之后的系統(tǒng)進(jìn)化樹）；
[0019] 圖4為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43的抑、溫度、鹽度的生 長曲線化43菌株在不同溫度、pH和鹽濃度的生長變化）；
[0020] 圖5為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油氣相色 譜圖，a為作用前，b為作用后化43菌株作用前后原油氣相色譜圖）；
[0021 ] 圖6為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油中正燒 控碳數(shù)的分布情況化43菌株作用前后正構(gòu)燒控組分含）；
[0022] 圖7為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43對各正構(gòu)燒控的降解 率化43菌株作用后不同正構(gòu)燒控的降解率）；
[0023] 圖8為本發(fā)明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油表面粘 度與剪切速率的變化情況化43菌株作用前后，原油粘度隨剪切速率的變化）；
【具體實施方式】
[0024] 實施例1:地衣芽抱桿菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株的篩選；
[0025] 1.取樣:采用無菌容器從臺南油田聯(lián)合處理站采集原油(Ξ相分離器出口管道，先 流Imin后再取樣)和±壤(去除表層覆±0.5cm后取樣），隨后放置在4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 2.富集:分別取油污±壤樣品，按5%比例接入裝有l(wèi)OOmL培養(yǎng)基（ImL微量元素溶 液加 lOmL礦物鹽溶液，加無菌水至lOOmL)的250mLS角錐形瓶中，搖床培養(yǎng)7d(55°C， 16化pm)。取富集液5mL轉(zhuǎn)接至相同新鮮培養(yǎng)基內(nèi)，與相同條件下培養(yǎng)7d，如此連續(xù)富集培養(yǎng) 7次。
[0027] 3.分離:配置LB固體培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌（12rC，20min)，取出放置超凈臺冷卻到 45°C~50°C時倒入滅菌后的90mm培養(yǎng)皿內(nèi)（15mL)，待培養(yǎng)基冷卻凝固后將培養(yǎng)基倒置擱 放，24h后檢查無菌污染方可使用。用接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基上劃線，55Γ培養(yǎng)(培養(yǎng)皿用封 口膜密封，倒置培養(yǎng)）。24h后，選取不同的形態(tài)的菌，挑取單克隆于裝有1 OmL的LB液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)(55°C，160巧m)。
[0028] 4.所用培養(yǎng)基成分 ①無機(jī)鹽培養(yǎng)基： （g/L)
[0029] KH2PO4 0.5 g
[0031] W上培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌（12rc，20min)后置4Γ保存?zhèn)溆谩?br>[