多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測器件及檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]瘧疾是一種急性傳染病，是目前世界上對人類危害最為嚴(yán)重的蚊媒寄生原蟲病，病原體是瘧原蟲，癥狀為周期性發(fā)冷發(fā)熱。由于瘧原蟲的生活周期復(fù)雜，抗原具有階段特異性等特點，瘧疾的防治成為世界性的難題之一。其中，惡性瘧疾每年感染3 — 5億人，奪取數(shù)百萬人的生命。2011年11月，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計有2.16億瘧疾病例發(fā)生，死亡率高達(dá)655，000人。瘧原蟲主要分布在地球熱帶、亞熱帶各國，S卩非洲、東南亞、南美等地區(qū)，約有20億人口仍生活在疫區(qū)，每年死于瘧疾的兒童約100萬。我國在華南、華中的某些地區(qū)，特別是云南和海南省為高發(fā)區(qū)。因此，瘧疾也嚴(yán)重阻礙著發(fā)展中國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
[0003]由于瘧疾治療藥物的特殊性，精確快速的診斷不僅能及時發(fā)現(xiàn)并治療瘧疾患者，大大降低病死率，也能通過早期排除瘧疾，及時挽救感染了其它傳染性疾病患者的生命。以此同時，精確快速的早期診斷也是對瘧疾實時流行病監(jiān)測和控制的必要手段。目前，診斷瘧疾的經(jīng)典方法仍為血涂片顯微鏡檢法，該方法對檢驗者的技能和檢驗要求很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足非洲和南美洲等發(fā)展中國家中絕大多數(shù)生活在偏遠(yuǎn)地區(qū)患者的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種對瘧疾的診斷有用的多肽、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)中的用途、該多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0005]S卩，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案:
1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0006]2.一種檢測器件，其包括:固體載體，以及連接于該固體載體上的項I所述的多肽。
[0007]3.根據(jù)項2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0008]4.一種檢測試劑盒，其包括項I所述的多肽、或者項2或3所述的檢測器件。
[0009]5.抗項I所述的多肽的抗體。
[0010]6.項I所述的多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0011]7.項6所述的用途，其中，所述疾病是瘧疾。
[0012]8.項6或7所述的用途，其中，所述瘧原蟲是惡性瘧。
[0013]9.編碼項I所述的多肽的核酸。
[0014]10.包含項9所述的核酸的表達(dá)載體。
[0015]11.導(dǎo)入了項10所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0016]將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【附圖說明】
[0017]圖1將多肽通過化學(xué)共價固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0018]圖2對SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)的制作過程進(jìn)行說明的示意圖。
[0019]圖3對多肽微陣列化學(xué)固定過程進(jìn)行說明的圖。
[0020]圖4說明多肽微陣列點樣模式的示意圖。
[0021]圖5是顯示對健康正常人或非瘧疾病人血清進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。
[0022]圖6是顯示對瘧疾病人血清進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明的多肽
本發(fā)明的多肽是30肽。本發(fā)明的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成，即:MYNDNEDYFDDLDDNEQFLNSKDLLYYDDG。如實施例所示，其對瘧疾病人的血清呈陽性反應(yīng)，而對健康正常人或非瘧疾病人血清呈陰性反應(yīng)。因此，該30肽作為瘧原蟲(例如惡性瘧)引起的疾病(例如瘧疾)的診斷工具是有用的。
[0024]本發(fā)明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用⑴化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來獲得，其中化學(xué)合成更為簡便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
[0025]此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子W02004/011653號所述的方法。S卩，可以這樣來生產(chǎn):將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出:具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0026]而且，除了上述的酶方法、化學(xué)合成方法以外，有些情況下，本發(fā)明的多肽還可能是天然存在(但未被分離出來)的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來。
[0027]本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體宿主細(xì)胞，以及抗本發(fā)明的多肽的抗體
本發(fā)明還涉及編碼該多肽的核酸(本發(fā)明的核酸)、包含該核酸的表達(dá)載體(本發(fā)明的表達(dá)載體)、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(本發(fā)明的宿主細(xì)胞)，它們優(yōu)選可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明的多肽的抗體，其可用于檢測本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備。
[0028]本發(fā)明的檢測器件
本發(fā)明還涉及一種檢測器件(本發(fā)明的檢測器件)，其包括固體載體、以及連接于該固體載體上的本發(fā)明的多肽。
[0029]在本發(fā)明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。
[0030]構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于:硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組入坐I=I 寸 O
[0031]固體載體的形狀包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0032]在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25ηπΓ約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實施方式中，磁珠具有約50ηπΓ約1ym范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。
[0033]在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μ πΓ約165 μ m范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24 μ πΓ約44 μ m范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。
[0034]具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0035]二氧化硅(S12)-處理或二氧化硅(S12)基的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington,PA購買的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，還可以使用可從Dynal B1tech購買的M-280等。
[0036]具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences, Warrington, PA銷售的珠子(名稱:B1mag(注冊商標(biāo))竣基)、或者 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子?；蛘撸梢允褂肈ynal B1tech銷售的M-270等。
[0037]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠。蘇州傯聚生物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成份(使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate)，pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性娃膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(Nonspecific protein adsorpt1n, NPA)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對O”水平(接近或低于儀器的檢測極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強(qiáng)的信號擴(kuò)增手段來提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州傯聚公司已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過控制修飾反應(yīng)時間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。
[0038]本發(fā)明的多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進(jìn)行。例如，對于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[l-ethyl-3-(3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-輕基玻拍酷亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反應(yīng)將改性石圭膠表面高分子鏈上的羧基(-C00H)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應(yīng)從而實現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面(參見圖1)。
[0039]對于點樣時使用的點樣液中本發(fā)明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為I μ g~1000 μ g/mL,更優(yōu)選10 μ g~500 μ g/mL。此外，對于本發(fā)明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為Γ100 點 /10mm2，更優(yōu)選 5?50 點 /1mm20
[0040]本發(fā)明的檢測器件可以用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)、或者制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的試劑盒。
[0041]本發(fā)明的檢測試劑盒
本發(fā)明還涉及一種檢測試劑盒(本發(fā)明的檢測試劑盒)，其