版納繩蚋抗菌肽SibaCec及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種吸血昆蟲版納繩蚋AaiMaease)抗菌肽57AaCec及其 基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 當前由抗生素引起的耐藥性問題日益嚴峻，多肽類抗微生物(抗菌肽）藥物的潛在 應(yīng)用價值引起了各國科研人員的研究興趣。抗菌肽是一種新型的抗微生物多肽，大多數(shù)抗 菌肽分子量小于10000道爾頓，帶正電，富含疏水堿基，能夠形成兩親性的結(jié)構(gòu)。研究表明， 抗菌肽能夠在低濃度下快速殺滅各種革蘭氏陽性和陰性細菌、真菌、寄生蟲等病原微生物， 而且也能殺死多種腫瘤細胞，抑制病毒的繁殖與擴散。此外，它們還無致畸變作用，無蓄積 毒性，不容易產(chǎn)生抗藥性。一些臨床前期的數(shù)據(jù)表明，抗菌肽對于局部感染和全身感染都有 效，有希望成為新一代抗微生物藥物。
[0003] 昆蟲是地球上最大的生物種群，除海洋外，其余所有的生態(tài)環(huán)境都有昆蟲的分布。 昆蟲不像高等動物那樣具有高度專一的獲得性免疫系統(tǒng)，即在昆蟲體內(nèi)缺乏T和B淋巴細 胞系統(tǒng)，也無免疫球蛋白及補體系統(tǒng)。然而昆蟲能在幾億年的自然進化當中仍然占據(jù)種群 優(yōu)勢，表明其應(yīng)該有非常強大的先天免疫系統(tǒng)，使得昆蟲能夠抵御環(huán)境中諸多微生物的侵 襲。研究表明，昆蟲的先天免疫系統(tǒng)能夠快速大量合成多種抗菌肽直接殺滅入侵機體的各 種病菌。此外，它們還可以通過參與、調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮各種防御功能。目前， 從昆蟲來源的抗菌肽中篩選潛在的抗生素替代物是當前學界的研究熱點。這些抗菌肽具有 不同的結(jié)構(gòu)和抗菌活性，是新型多肽類抗微生物藥物開發(fā)的優(yōu)良模板庫。吸血昆蟲版納繩 蚋屬于昆蟲綱雙翅目蚋科蚋屬，主要分布于云南省西雙版納，其體內(nèi)的抗菌活性物質(zhì)成分 尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(革蘭氏陰性細菌）的版納繩 蚋抗菌肽及其基因和應(yīng)用。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： (1)版納繩蚋抗菌肽57AaCec :抗菌肽57AaCec，是中國吸血昆蟲版納繩蚋抗菌肽基因 編碼的一種直鏈多肽，含有34個氨基酸殘基，分子量3432. 12道爾頓，等電點10. 73。多肽 全序列一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列SEQ ID NO: 1)為：
[0006] (2)版納繩蚋抗菌肽57AaCec前體的基因克?。喊婕{繩蚋唾液腺總RNA提取，mRNA 純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計引物，利用PCR方法篩選抗菌肽57AaCec基因。 擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5'41644(：1'11^64441'(：1'1'1'11^13'，？0?另一擴增 引物為 CLONTECH 公司 SMART ? cDNA Library Construction Kit 中的 3 ' PCR Primer 引 物，其序列為5'ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列 測定。測序結(jié)果表明編碼版納繩蚋抗菌肽前體的基因由272個核苷酸（SEQ ID N0:2)組成 (GenBank accession KT223121)，其自 5' 端至 3' 端序列為：
(3)版納繩蚋抗菌肽的制備方法(常規(guī)方法）：根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基酸序列，采 用自動多肽合成儀化學合成其氨基酸序列，C末端酰胺化。通過HPLC反相C18柱層析脫 鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法（Fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS )，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測 序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0007] 本發(fā)明的版納繩蚋抗菌肽57AaCec作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明克隆得到版納繩蚋抗菌肽57如Cec的編碼基因， 利用化學合成的方法合成了 57AaCeC。該抗菌肽對大腸桿菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和 鮑氏不動桿菌具有強的殺滅作用，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、溶血活性低、制備方法簡 單的有益特點。
【具體實施方式】
[0009] 下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此。
[0010] 實施例一、版納繩蚋抗菌肽57AaCec前體的基因克隆 (1)、版納繩蚋唾液腺總RNA提?。?A.版納繩蚋于解剖顯微鏡下取唾液腺組織，累積300 mg樣品，加入3 ml Trizol溶液， 于20 ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
[0011]B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000 rpm離心10 分鐘，棄除沉淀。
[0012] C?上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C，12000 rpm，離心10分鐘，沉 淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為版納繩蚋唾液腺總RNA。
[0013](2 )、版納繩蚋唾液腺mRNA的純化： 版納繩蚋唾液腺mRNA分離純化采用美國PR0MEGA公司的PolyATtract? mRNA Isolation Systems 試劑盒。
[0014] A.提取的版納繩蚋唾液腺總RNA溶于500 yl DEPC水中，放入65°C水浴10分 鐘，加人3 yl的Oligo (dT)探針和13 yl 20 X SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A 液。
[0015] B?磁珠（SA-PMP)的洗滌：將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0? 5X SSC 0. 3 ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1 ml 0. 5XSSC懸浮，稱之為B液。
[0016] C?將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0? IX SSC洗滌4次，最后棄上清，加0. Lml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至 新的試管，再加入0. 15 ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則 上清中為純化的版納繩蚋唾液腺mRNA。
[0017] D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5. 2,等體積異丙醇，于-70°C放置30分鐘，4°C， 12000 rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10 y I DEPC水中。
[0018] (3)版納繩蚋唾液腺cDNA文庫構(gòu)建： 米用CL0NTECH公司Creator?SMART?cDNALibraryConstructionKit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。
[0019] A. cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）： 在0. 5 ml無菌的離心管加入I yl版納繩蚋唾液腺mRNA、l yl SMART IV寡聚核苷 酸、I yl CDS 111/3' PCR引物，加2 yl去離子水使總體積達到5 yl。
[0020] 混勻離心管中的試劑并以12000 rpm離心15秒，72°C保溫2分鐘。將離心管在冰 上孵育2分鐘。在離心管中加入以下試劑2. 0 y I 5X第一鏈緩沖、I. 0 y I 20mM二硫蘇 糖醇、1.0 yl 10 mM dNTP混合物、1.0 yl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑 并以12000 rpm離心15秒，在42°C保溫1小時。將離心管置于冰上中止第一鏈合成。從離 心管取2 y 1所合成的cDNA第一鏈備用。
[0021] B.采用長末端聚合酶鏈式反應(yīng)（LD- PCR )方法擴增第二鏈 95°C預(yù)熱PCR儀，將2 yl cDNA第一鏈（mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80 yl去離子水、10 yl 10\八如&拉&86 2?0?緩沖、2 4 150\(1犯13混合物、2 4 15'？0?引物、2 4 10)5 111/3' PCR引物以及2 iU大腸桿菌聚合酶離心管進行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴 增：95°C，20秒鐘；22個循環(huán)（95°C，5秒鐘；68°C，6分鐘）。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的 cDNA雙鏈進行抽提。
[0022] C.PCR產(chǎn)物用PR0MEGA公司的Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem試 劑盒進行抽提回收，步驟如下： 將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入 離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。12000 rpm離心30秒，倒掉收集 管中的廢液。加入700 W的洗脫液(含乙醇）于離心純化柱中，以12000 rpm離心30秒， 倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟2。12000 rpm離心5分鐘，將離心純化柱置于新的離心管 中。加入30 超純水，在室溫下靜置5分鐘。12000 rpm離心30秒，管底溶液即為所純化 過的cDNA雙鏈。 D.大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞的制備： 挑取單個DH5 a菌落，接種于3 ml不含氨芐青霉素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中， 37 °C培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50 ml LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩2小 時。當OD6。。值達到0. 35時，收獲細菌培養(yǎng)物。將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用 冰預(yù)