一種用制備液相法同時得到多種淫羊藿黃酮的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用制備液相法同時得到多種淫羊藿 黃酮的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 淫羊藿戒是來源于小檗科（Berberidaceae)淫羊藿屬（Epimedium)植物的一種大 多含有異戊烯基的黃酮甙類化合物，研宄表明淫羊藿黃酮苷具有改善心腦血管系統(tǒng)功能、 增強(qiáng)機(jī)體免疫力和促進(jìn)DNA合成等生理活性。具有強(qiáng)心、降血壓、抗心律失常、增加腦血流 量、抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗腫瘤等多種作用，具有較高的藥用和保健價值。但是，目 前對淫羊藿的開發(fā)研宄還處于初級階段，對淫羊藿有效成分的研宄尚不夠深入。因此，利用 我國的淫羊藿資源優(yōu)勢，運用祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在其有效成分、制 劑工藝、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行深入的研宄，淫羊藿有可能成為具有良好開發(fā)前 景的增強(qiáng)免疫功能和免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松、治療心腦血管疾病的優(yōu)勢藥物，具有廣闊的應(yīng) 用前景。
[0003] 目前從淫羊藿中初分離淫羊藿總黃酮苷的方法有兩大類。一類是采用溶劑萃取的 方法進(jìn)行初分離，此法得到的是淫羊藿總黃酮苷的粗品，且收率不高，還有有機(jī)溶劑殘留會 影響產(chǎn)品質(zhì)量。另一類采用大孔吸附樹脂來分離，但其技術(shù)關(guān)鍵都是傳統(tǒng)的吸附-解吸工 藝，操作過程無法跟蹤檢測，此方法也是只能得到淫羊藿總黃酮苷粗品。淫羊藿中黃酮苷類 單體物質(zhì)的分離鑒定文獻(xiàn)中涉及到大量的采用正相硅膠柱層析，凝膠柱層析，反相半制備 HPLC分離的方法，其中正相硅膠柱層析由于對苷類物質(zhì)吸附強(qiáng)而使分離效果拖尾嚴(yán)重，分 離效果不佳，凝膠柱層析和反相半制備HPLC分離由于要用到昂貴的色譜級溶劑和分離量 小無法用于規(guī)模化分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用制備液相法同時得到多種淫羊藿黃酮的分 離方法，成本低廉，操作簡便，可以同時分離多種成分，提高了淫羊藿的利用價值，適合實驗 室及工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)需求。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] -種用制備液相法同時得到多種淫羊藿黃酮的分離方法，包括如下步驟：
[0007] S1、將淫羊藿藥材粉碎，稱取3Kg，置于50L提取罐中，用30L 70%乙醇回流提取兩 次，每次3h，過濾，合并濾液，得提取液；
[0008] S2、將步驟Sl所得的提取液減壓濃縮至lOOOmL，得淫羊藿粗提物濃縮液；
[0009] S3、在步驟S2所得的濃縮液中加入2000mL95%乙醇，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置24h，過 濾，將濾液濃縮至500mL后，再加入2000mL95%乙醇，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置24h，過濾，將濾液 濃縮至無醇味，過高速離心機(jī)離心，得到淫羊藿醇沉組分600mL ;
[0010] S4、取步驟S3所得的淫羊藿醇沉組分，加樣至已處理好的D-101型大孔樹脂層析 柱中；依次用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，3倍柱體積30%乙醇洗脫，最后用3倍柱體積的 85%乙醇洗脫，得淫羊藿總黃酮液，濃縮備用；
[0011] S5、步驟S4所得的淫羊藿總黃酮采用制備液相色譜分離。用初始流動相平衡色 譜柱20min，取步驟S4所得的淫羊藿總黃酮濃縮液稀釋5倍，進(jìn)樣，每次進(jìn)樣體積5mL， 按設(shè)定梯度洗脫，紫外檢測實時監(jiān)控，根據(jù)峰及峰的保留時間進(jìn)行收集，收集保留時間為 16. 72min、17. 65min、18. 45min、19. 13min、20. 48min、26. 79min、27. 95min 和 30. 39min 的共 8個目標(biāo)組分；
[0012] S6、40min以后，按照初始梯度平衡色譜柱，再次進(jìn)樣，收集洗脫組分；共進(jìn)樣5次， 將5次收集得到的洗脫組分按保留時間合并相同部分，濃縮，真空離心干燥得到不同黃酮 苷成分；
[0013] S7、將收集得到的各組份經(jīng)HPLC檢驗純度，均為為98. 5%。由于梯度分析樣品時 間較長，所以樣品純度分析時用等度檢測。
[0014] 其中，所述步驟S3中離心機(jī)的頻率為25000r/min。
[0015] 其中，所述步驟S5中色譜柱為c 18 (10 μ m，250mmX 50mm)，紫外檢測波長為270nm， 柱流速為60mL/min，洗脫梯度：洗脫劑采用乙腈-水-磷酸體系，首先用體積百分比為15 % 的乙腈，體積百分比為0.2%的磷酸洗脫；再用體積百分比為30%的乙腈，體積百分比為 0. 2%的磷酸洗脫；再用體積百分比為45%乙腈，體積百分比為0. 2%的磷酸洗脫，最后用 體積百分比為60%乙腈，體積百分比為0. 2%的磷酸洗脫，40min完成一個分離周期。
[0016] 其中，所述步驟S7中制備柱中保留時間為20. 48min及其前面的4個成分的HPLC 分析條件為：〇18(5 4111，25011111^4.6臟），流動相為乙腈：水：磷酸30:69.8:0.2，檢測 波長為270nm，流速為lmL/min，柱溫為25°C 〇
[0017] 其中，所述步驟S7中制備柱中保留時間在20. 48min后面的3個樣品的HPLC分析 條件為：(：18(5 4111，25011111^4.6臟），流動相為乙腈：水：磷酸50:49.8:0.2，檢測波長 為270nm，流速為lmL/min，柱溫為25°C。
[0018] 根據(jù)文獻(xiàn)及核磁共振譜圖解析結(jié)果，所得組分依次為大花淫羊藿苷A、朝藿定A、 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷Sutchuenmedin A、斯皮諾鼠李糖苷、鼠李糖淫羊藿次苷II和 淫羊藿次苷II。
[0019] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 提取方法，工藝精簡，原料淫羊藿來源廣泛，成本低廉，提取制備過程環(huán)境友好，成 本低廉，操作簡便，可以同時分離多種成分，提高了淫羊藿的利用價值，適合實驗室及工業(yè) 化規(guī)模的生產(chǎn)需求。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例中淫羊藿大孔樹脂洗得總黃酮的HPLC分析圖譜。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例中淫羊藿總黃酮中各單體成分分離的制備HPLC譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0024] 本發(fā)明實施例提供了一種用制備液相法同時得到多種淫羊藿黃酮的分離方法，包 括如下步驟：
[0025] S1、將淫羊藿藥材粉碎，稱取3Kg，置于50L提取罐中，用30L70%乙醇回流提取兩 次，每次3h，過濾，合并濾液，得提取液；
[0026] S2、將步驟Sl所得的提取液減壓濃縮至lOOOmL，得淫羊藿粗提物濃縮液：
[0027] S3、在步驟S2所得的濃縮液中加入2000mL95%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置24h，過 濾，將濾液濃縮至500mL后，再加入2000mL95 %乙醇，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置24