專(zhuān)利名稱(chēng)：端酯基硅膠高效疏水色譜填料及合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)硅膠基質(zhì)有機(jī)化合物及其合成方法，特別是一類(lèi)端酯基高效疏水作用色譜的填料及其合成方法。
疏水相互作用色譜(Hydrophobic Interaction Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)疏水色譜)是七十年代發(fā)展起來(lái)的分離純化蛋白質(zhì)的一種液相色譜方法。它具有不用有毒和昂貴的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相、純化后的蛋白質(zhì)活性損失小和分離選擇性能好等優(yōu)點(diǎn)，從而得到了迅速的發(fā)展?，F(xiàn)在已成為生物工程產(chǎn)品后處理、蛋白質(zhì)藥物分離純化中的一個(gè)重要手段。
早期的疏水色譜填料是利用瓊脂糖、葡聚糖等為基質(zhì)在其表面鍵合上一個(gè)有機(jī)基團(tuán)制得的。后來(lái)又有將苯基和丁基等烴基鍵合到親水性聚合物基質(zhì)上以得到半剛性的疏水色譜填料。后者分離性能較好，但是機(jī)械性能差，不耐高壓，不能用于高效液相色譜，因此分離速度慢。目前最好的疏水色譜柱是由日本的TOYO SOTA公司生產(chǎn)的，在親水聚合物基質(zhì)上鍵合苯基得到的商品名為T(mén)SK pheny1-5pw型疏水色譜填料。但是，使用該柱子每次進(jìn)樣后都要用NaOH溶液再生，過(guò)程復(fù)雜。而且，因疏水性太強(qiáng)，某些蛋白不出峰，耐壓性能也較差。
八十年代中期出現(xiàn)了以硅膠為基質(zhì)的高效疏水色譜填料(High perform-ance Hydrophobic Interaction Chromatography，HPHIC簡(jiǎn)稱(chēng)高效疏水色譜)一般是應(yīng)用硅膠表面的硅羥基的反應(yīng)活性鍵合上合適的配基而制得。其中報(bào)道最多、效果較好的是聚乙二醇類(lèi)配基的疏水色譜填料，其配基是-(CH2CH2O)n-R(R＝H、甲基、乙基、苯基)。這類(lèi)填料機(jī)械性能好、耐高壓、可用于高效液相色譜，但是耐高濃度鹽酸胍溶液的性能差，分離度一般。因此在生物工程產(chǎn)品的后處理中受到限制。
本發(fā)明是在采用多種合成方法合成的多種不同結(jié)構(gòu)的硅膠基質(zhì)化合物的基礎(chǔ)上，從中篩選出了可用作高效疏水色譜填料的化合物品種和合成方法，以滿足生物工程產(chǎn)品的后處理和科研工作的需要。這類(lèi)化合物，用作液相色譜填料時(shí)，耐高壓、耐鹽酸胍、分離性能好、易再生，蛋白質(zhì)活性回收率高、疏水性適當(dāng)，適用于生物工程產(chǎn)品的后處理，性能優(yōu)于現(xiàn)有的產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的是采用一種新的合成方法和工藝，合成了一類(lèi)新型硅膠基質(zhì)的化合物。這類(lèi)化合物可以用于高效液相色譜中，作為分離蛋白質(zhì)的高效疏水色譜填料。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明是在硅膠基質(zhì)上，采用多步鍵合的方法得到一類(lèi)端基為酯基的硅膠基質(zhì)化合物。其結(jié)構(gòu)為硅膠≡
。該類(lèi)物質(zhì)是性能良好的高效疏水色譜填料。
本發(fā)明的合成方法是，大孔硅膠先經(jīng)酸洗處理，然后與γ-縮水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷反應(yīng)，制得含環(huán)氧基的硅膠。環(huán)氧基硅膠再與一個(gè)兩頭端基分別為羥基和酯基的化合物反應(yīng)，以得到帶端酯基的產(chǎn)物;也可以讓含環(huán)氧基硅膠先與一個(gè)二元醇反應(yīng)，然后再讓此產(chǎn)物進(jìn)一步與酸酐或酰氯反應(yīng)，得到本發(fā)明的端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料。
本發(fā)明的具體合成步驟如下1、硅膠的酸洗處理及活化向大孔硅膠(孔徑30nm～100nm)中加入適量的硝酸或鹽酸溶液，在超聲振蕩器中超聲，同時(shí)抽真空1～5分鐘，以盡可能地除去硅膠細(xì)孔內(nèi)存留的氣體，盡可能使吸附在硅膠表面上的氣體被反應(yīng)的溶液置換?；亓?～5小時(shí)，以最大限度地除去殘留在硅膠表面的各種雜質(zhì)并使硅醚鍵破壞變成硅醇基，用玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用蒸餾水洗至PH值不變，在130～200℃下烘干，將活性好的硅膠放在干燥器內(nèi)保存。
2、環(huán)氧基硅膠的制備向酸洗處理過(guò)的活性硅膠中加入適量的3-15%的γ-縮水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷水溶液，在超聲和抽氣處理后，調(diào)PH值為4～7，在80～110℃的熱浴中加熱攪拌0.5～1小時(shí)。然后用砂芯漏斗過(guò)濾，用水洗，再用甲醇洗，放在真空干燥器中干燥48小時(shí)。
該反應(yīng)為
3、端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的制備(Ⅰ)第二步制得的環(huán)氧基硅膠與羧酸的二元醇酯(
)在三氟化硼催化下，在無(wú)活潑氫溶劑的溶液中反應(yīng)。反應(yīng)物先作超聲抽真空處理，在80～120℃油浴中加熱攪拌0.5～1小時(shí)，反應(yīng)完成后加入適量2～6mol/L NaOH溶液破壞三氟化硼，然后過(guò)濾，用水、甲醇洗滌，抽干。所得產(chǎn)物是本發(fā)明的一類(lèi)硅膠基質(zhì)的酯基化合物，即酯基高效疏水色譜填料。
其中R＝烷基，苯基，
;R1＝苯基，烷基，取代苯基R和R1兩個(gè)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)決定了填料的疏水性，對(duì)色譜的選擇性和分離度也起著至關(guān)重要的作用。
4、端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的制備(Ⅱ)硅膠基質(zhì)酯基化合物還可以用另一種方法合成。
第二步制得的環(huán)氧基硅膠先與α、ω二元醇或聚二元醇反應(yīng)，得到一個(gè)含端羥基的硅膠基質(zhì)化合物，此化合物在三級(jí)胺等無(wú)活潑氫的堿性有機(jī)物催化下，與酸酐或酰氯反應(yīng)，得到端酯基的硅膠基質(zhì)化合物，即本發(fā)明的酯基高效疏水色譜填料。
(A)環(huán)氧基硅膠與二元醇的反應(yīng)。
環(huán)氧基硅膠與二元醇或聚二元醇的反應(yīng)條件及后處理皆同第3步。
(m＝1，2，3，n＝1～40)(B)酯基高效疏水色譜填料的制備上述環(huán)氧基硅膠與二元醇或聚二元醇的反應(yīng)產(chǎn)物，在三級(jí)胺或其他無(wú)活潑氫的堿性有機(jī)物催化下，與酸酐或酰氯反應(yīng)得到硅膠基質(zhì)酯基化合物，即酯基高效疏水色譜填料。酸酐和酰氯作反應(yīng)試劑時(shí)不同之處是，酸酐要加熱到60～120℃，酰氯不必加熱。三級(jí)胺或其他無(wú)活潑氫的堿性有機(jī)物可以接受反應(yīng)放出的質(zhì)子，促進(jìn)反應(yīng)。反應(yīng)可以用苯等惰性試劑作溶劑，有些三級(jí)胺本身也可兼作溶劑。反應(yīng)混合物應(yīng)經(jīng)超聲，抽真空處理。反應(yīng)完成后過(guò)濾出產(chǎn)物，順次用甲醇、水、甲醇洗滌，抽干，真空干燥。產(chǎn)品應(yīng)保存在陰涼、干燥處。
其中R1＝苯基，取代苯基，烷基R1的結(jié)構(gòu)對(duì)填料的疏水性、選擇性、耐腐蝕性都有影響。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用新合成路線和工藝方法，合成了一類(lèi)新型化合物-硅膠基質(zhì)酯基化合物。這類(lèi)化合物可用作高效疏水色譜填料，而且性能優(yōu)良。
由于本合成路線中反應(yīng)物之一是含大量小孔的固體硅膠，反應(yīng)在固-液兩相界面進(jìn)行。為了促使小孔內(nèi)的氣體排出，使反應(yīng)液與硅膠所有表面充分和均勻接觸，所以每步合成反應(yīng)中，都有超聲和同時(shí)抽真空的處理步驟。
本發(fā)明的端酯基硅膠基質(zhì)化合物，由于在端基上接了一個(gè)酯基，與原來(lái)端羥基、端甲基、端苯基填料相比，疏水性有所改變。在分離性能、耐鹽酸胍溶液的腐蝕性方面得到了改善?？朔硕肆u基疏水色譜填料不耐鹽酸胍溶液的弊病，改善了分離性能并提高了峰容量。對(duì)照

圖1和圖2，可看到本產(chǎn)品的填料明顯優(yōu)于原有端羥基的疏水色譜填料。
本發(fā)明的填料機(jī)械性能好，耐壓＞60MPa，可用于高效液相色譜，大大提高了分離和分析速度。蛋白活性回收率高，4℃時(shí)，溶菌酶和α淀粉酶的活性回收率＞90%。分離重現(xiàn)性好，可廣泛應(yīng)用于蛋白、酶和生物工程產(chǎn)品的分離中(圖1，圖3～圖6)。
填料使用壽命長(zhǎng)，在PH＝7情況下使用1500小時(shí)后的填料，經(jīng)清洗后，分離性能未見(jiàn)改變。
填料很容易再生，只要用10倍以上體積的稀鹽溶液(即疏水色譜中的B洗脫液)洗滌即可再生完全。不象某些商品柱那樣要在每次進(jìn)樣后用NaOH溶液再生。
在某些商品柱上有些蛋白不出峰。而本發(fā)明的填料無(wú)此不良現(xiàn)象。
生物工程產(chǎn)品的鹽酸胍溶液粗品可以直接上樣。在一步分離中達(dá)到了純化，除去鹽酸胍的目的，完成了過(guò)去需要幾步完成的工作。
圖1 蛋白質(zhì)和酶在酯基高效疏水色譜填料上的分離圖1、色譜柱4.1×100mm不銹鋼柱，硅膠孔徑50nm，2、洗脫液A、3mol/L(NH4)2SO4+0.01mol/LKH2PO4，PH7;B、0.01mol/LKH2PO4，PH7;3、流速1ml/min;4、梯度時(shí)間0～100%B 20分;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;5、蛋白樣品細(xì)胞色素C(1)，肌紅蛋白(2)，伴清蛋白(3)，溶菌酶(4)，α淀粉酶(5)，鐵蛋白(6)，胰島素(7)。
圖2 蛋白質(zhì)和酶在端羥基高效疏水色譜填料上的分離1 色譜柱4×150mm不銹鋼柱2 填料結(jié)構(gòu)為
3 色譜條件同圖14 蛋白樣品細(xì)胞色素C(1)，肌紅蛋白(2)，伴清蛋白(3)，溶菌酶(4)，α淀粉酶(5)，胰島素(6)圖3 酶和蛋白在酯基聚乙二醇間隔臂型高效疏水色譜柱上的分離圖。
1 色譜柱4.1×150mm不銹鋼柱，硅膠孔徑30nm。
2 色譜條件及蛋白樣品同圖1圖4 酶和蛋白在端酯基聚丁二醇間隔臂型高效疏水色譜柱上的分離圖1 色譜柱4×100mm不銹鋼柱;
2 色譜條件及蛋白樣品同圖1圖5 基因工程人干擾素γ的色譜圖1 色譜柱4×150mm不銹鋼柱2 填料為酯基聚乙二醇配基疏水色譜填料3 樣品基因工程干擾素γ的7M鹽酸胍粗品圖6 基因工程白細(xì)胞介質(zhì)素2的色譜圖1 色譜柱及填料同圖52 樣品基因工程的白細(xì)胞介質(zhì)素2的7M鹽酸胍溶液例(一)苯甲酸聚乙二醇酯基高效疏水色譜填料的制備1、硅膠的酸洗10克大孔硅膠中加入100ml 6mol/L鹽酸，在超聲振蕩器中振蕩同時(shí)抽真空處理2～5分鐘，然后回流4小時(shí)，用玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，用蒸餾水洗至PH值不變，在130～180℃下烘干，放在干燥器內(nèi)保存2、環(huán)氧基硅膠的制備10克酸洗處理過(guò)的硅膠中，加入70ml 5～10%的γ-縮水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷水溶液，調(diào)PH值到5.8，在超聲振蕩器上超聲的同時(shí)抽真空2～5分鐘，在80～110℃油浴中加熱并攪拌0.5到1小時(shí)，然后過(guò)濾。先用水洗，再用甲醇洗;放在真空干燥器中干燥待用。
3、環(huán)氧基硅膠與苯甲酸聚乙二醇酯的反應(yīng)10克環(huán)氧基硅膠中加入60ml 2～5%的1.4-二氧六環(huán)的聚乙醇400苯甲酸酯溶液，再加入三氟化硼乙醚溶液5ml。超聲抽真空處理，然后在80～110℃加熱攪拌0.5～1小時(shí)。反應(yīng)完成后加入4mol/L NaH 10ml，攪拌2分鐘。過(guò)濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌。抽干溶劑，真空干燥，即得本發(fā)明新型高效疏水色譜填料。
例(二)苯甲酸聚丁二醇酯基高效疏水色譜填料的制備1 硅膠的酸洗和環(huán)氧基硅膠的制備同例(一)2 環(huán)氧基硅膠中加入60ml 2～5%聚丁二醇(M≈800)的1，4-二氧六環(huán)溶液，再加入5ml三氟化硼乙醚溶液。超聲、抽真空二分鐘。在80～110℃加熱攪拌0.5～1小時(shí)。反應(yīng)完后，加入4mol/L NaOH 10ml，攪拌2分鐘。過(guò)濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌。抽干溶劑，真空干燥。
3、苯甲酸聚丁二醇酯基高效疏水色譜填料的制備10克上述第2步的產(chǎn)物中加入60ml無(wú)水三乙胺，2克苯甲酸酐、超聲、抽真空二分鐘?；亓?.5～1小時(shí)。過(guò)濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌。抽干溶劑，真空干燥。
例(三)乙酸酯基聚乙二醇800間隔臂高效疏水色譜填料的制備1 硅膠的酸洗和環(huán)氧基硅膠的制備同例(一)2 環(huán)氧基硅膠與聚乙二醇800的反應(yīng)10克環(huán)氧基硅膠中加入60ml 2～5%聚乙二醇800的1，4-二氧六環(huán)溶液，再加入5ml三氟化硼乙醚溶液。超聲、抽真空二分鐘。在80～110℃加熱攪拌0.5～1小時(shí)。反應(yīng)完后加入4mol/L NaOH 10ml，攪2分鐘。過(guò)濾，依次用甲醇、水、甲醇洗滌。抽干溶劑，真空干燥。
3、乙酸酯基聚乙二醇800間隔臂高效疏水色譜填料的制備10克上述產(chǎn)物，加入60ml吡啶，滴加2～5ml乙酰氯，滴完后，超聲二分鐘。在室溫下放置1～3小時(shí)，過(guò)濾，依次用甲醇、水、甲醇洗，抽干溶劑，真空干燥，得產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料，其特征是該填料為硅膠上鍵合了一個(gè)端基為酯基的有機(jī)配體作為高效疏水色譜填料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為
其中R=烷基，苯基，-[CH2(CH2)mO]n-，-(CH2CHO)n-，(m=1，2，3，n=1～40)；R1=苯基，烷基，取代苯基。
2.端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的合成方法，其特征是一個(gè)含端羥基有機(jī)基團(tuán)的硅膠基質(zhì)化合物與有機(jī)酸酐或酰氯反應(yīng)得到端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料，其特征還有含端基為環(huán)氧基的有機(jī)基團(tuán)的硅膠與含端羥基的二元醇的酯類(lèi)化合物
反應(yīng)得到端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的合成方法，其特征是酰氯為反應(yīng)試劑時(shí)在三級(jí)胺吡啶等無(wú)活潑氫的堿性有機(jī)物存在下，常溫下反應(yīng)，而酸酐為反應(yīng)試劑時(shí)要加熱到60～120℃反應(yīng)0.5～2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的合成方法，其特征是含環(huán)氧基的硅膠與二元醇的酯類(lèi)化合物的反應(yīng)，需在三氟化硼催化下，在無(wú)活潑氫的溶劑中80～120℃反應(yīng)0.5～2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的端酯基硅膠基質(zhì)高效疏水色譜填料的合成方法，其特征是各步反應(yīng)中的反應(yīng)物用抽真空和超聲處理1～5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一類(lèi)硅膠基質(zhì)有機(jī)化合物及其合成方法，特別是一類(lèi)端酯基高效疏水色譜填料及其合成方法。本發(fā)明的高效疏水色譜填料的結(jié)構(gòu)為硅膠
文檔編號(hào)G07F7/08GK1092426SQ93103028
公開(kāi)日1994年9月21日 申請(qǐng)日期1993年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者常建華, 耿信篤 申請(qǐng)人:西北大學(xué)