本發(fā)明涉及一種基于區(qū)間估計(jì)的顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取方法，該方法是數(shù)字共焦顯微技術(shù)中三維生物顯微圖像復(fù)原處理的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，屬于數(shù)字圖像復(fù)原處理技術(shù)領(lǐng)域。該方法的應(yīng)用，可按照快速瀏覽、正常查看和精細(xì)計(jì)算的不同需要，綜合權(quán)衡考慮，對(duì)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行選取。

背景技術(shù)：

數(shù)字共焦顯微技術(shù)以普通生物光學(xué)顯微鏡為基礎(chǔ)，配置圖像探測(cè)器、精密移動(dòng)控制機(jī)構(gòu)和電腦，采用數(shù)字圖像處理技術(shù)，對(duì)采集的生物樣本顯微圖像進(jìn)行復(fù)原處理，消除焦面以外的散焦的影響，以提高細(xì)胞圖像的分辨率。

數(shù)字共焦顯微技術(shù)中的復(fù)原處理，采用的是三維顯微圖像去卷積復(fù)原方法。表征顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，直接決定著去卷積復(fù)原處理的效果。三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)越準(zhǔn)確地反映顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的能量分布，復(fù)原效果越好。在此基礎(chǔ)上，三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的空間大小選取越大，包含能量越大，復(fù)原效果越好，同時(shí)處理時(shí)間越長(zhǎng)。三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)為對(duì)頂雙漏斗結(jié)構(gòu)，絕大部分能量集中在中部的雙漏斗對(duì)頂處的微小區(qū)域。因此，在進(jìn)行圖像復(fù)原處理時(shí)，合理的選取是以該處為原點(diǎn)選取微小區(qū)域的一定空間大小的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行圖像復(fù)原處理，但是隨著空間大小的逐漸增大，復(fù)原效果提升逐步趨緩，而處理時(shí)間卻迅速增加。因此，如何根據(jù)不同的復(fù)原要求，綜合和權(quán)衡考慮復(fù)原效果和處理時(shí)間，選取適當(dāng)?shù)娜S點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行復(fù)原處理，是數(shù)字共焦技術(shù)中三維顯微圖像去卷積復(fù)原處理需要解決的重要問(wèn)題。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于區(qū)間估計(jì)的顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取方法，該方法能夠根據(jù)不同的復(fù)原要求，建立相應(yīng)的區(qū)間估計(jì)公式，選取適當(dāng)?shù)娜S點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，對(duì)采集的序列顯微切片圖像進(jìn)行復(fù)原處理。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的：基于區(qū)間估計(jì)的顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取方法，包括：1)根據(jù)顯微成像系統(tǒng)的參數(shù)，保持光學(xué)切片層距不變，確定放大倍數(shù)，制作表征顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的大空間三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)h，對(duì)h以其中心進(jìn)截取，得到用于復(fù)原的一系列三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)h_{M_r_z}，其中M表示放大倍數(shù)，r表示徑向大小，z表示層數(shù)；2)計(jì)算h和h_{M_r_z}的能量值，并以h的能量值為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，同時(shí)計(jì)算出h_{M_r_z}空間大小；3)用一幅清晰細(xì)胞圖像作為初始二維樣本，制作相互關(guān)聯(lián)的序列二維圖像，并用這些序列二維圖像構(gòu)建一個(gè)清晰仿真樣本三維圖像f，用h與f卷積得到模糊仿真三維成像圖像g；4)用步驟(1)中一系列不同徑向大小、不同層數(shù)即相應(yīng)不同能量大小、不同空間的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)分別對(duì)三維圖像g進(jìn)行去卷積復(fù)原處理，復(fù)原算法采用最大似然法，同時(shí)記錄復(fù)原后的改善信噪比ISNR；

還包括如下步驟：

5)統(tǒng)計(jì)計(jì)算歸一化后的改善信噪比ISNR的均值μ與標(biāo)準(zhǔn)差σ，并按區(qū)間計(jì)算式(1)確定不同復(fù)原要求下對(duì)應(yīng)的區(qū)間，

式中，H表示改善信噪比ISNR；a_i、b_i和c_i分別表示三個(gè)區(qū)間的區(qū)間端點(diǎn)值；ε為系數(shù)；

6)將改善信噪比ISNR代入?yún)^(qū)間計(jì)算式(1)，得到不同復(fù)原要求下的可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，再利用排序的方法確定顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取。

所述的統(tǒng)計(jì)計(jì)算歸一化后的改善信噪比ISNR的均值μ與標(biāo)準(zhǔn)差σ是在某個(gè)放大倍數(shù)下的一系列三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)分別對(duì)三維圖像g進(jìn)行去卷積復(fù)原處理得到各個(gè)不同的改善信噪比ISNR，對(duì)其以最大值進(jìn)行歸一化，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

所述的不同復(fù)原要求包括“快速瀏覽”、“正常查看”和“精細(xì)分析”，“快速瀏覽”指圖像分辨率已經(jīng)滿足一般瀏覽的要求，輪廓大致清晰；“正常查看”指圖像細(xì)節(jié)比較豐富，分辨率較高，輪廓清晰，“精細(xì)分析”指圖像細(xì)節(jié)更為豐富，分辨率更高，輪廓清晰可見(jiàn)大量細(xì)微部分。

所述的確定不同復(fù)原要求下對(duì)應(yīng)的區(qū)間，即確定式(1)中的三個(gè)區(qū)間的端點(diǎn)值a_i、b_i、c_i以及系數(shù)ε，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)選取確定的經(jīng)驗(yàn)值，并在不同放大倍數(shù)、不同復(fù)原要求下都進(jìn)行了確定。

所述的得到不同復(fù)原要求下的可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，是指復(fù)原要求不同時(shí)，對(duì)應(yīng)的改善信噪比ISNR在一定的區(qū)間內(nèi)波動(dòng)，即只要改善信噪比ISNR滿足某個(gè)復(fù)原要求的區(qū)間時(shí)，該改善信噪比ISNR對(duì)應(yīng)的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)就是一個(gè)可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

所述的利用排序的方法確定顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取，是在確定放大倍數(shù)下和復(fù)原要求下，從可選結(jié)果中選擇復(fù)原效果相對(duì)較好、空間較小、能量較高的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

所述的利用排序的方法確定顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取方法為：先選出空間大小最小的三個(gè)可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，然后將三個(gè)可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在空間大小、改善信噪比、能量三方面按照大小排序，最后，對(duì)排序情況，空間大小選擇較小的兩個(gè)可選結(jié)果，改善信噪比、能量選擇較大的兩個(gè)可選結(jié)果，所有要求都滿足或者滿足最多的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)即是最終結(jié)果。

本發(fā)明的突出效果在于：

在不同復(fù)原要求下三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取，直接決定著數(shù)字共焦顯微技術(shù)中三維顯微圖像去卷積復(fù)原效果和處理時(shí)間。如何選取，一直是數(shù)字共焦顯微技術(shù)待解決的問(wèn)題。本發(fā)明基于三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的相關(guān)理論，發(fā)現(xiàn)了體現(xiàn)復(fù)原效果的改善信噪比ISNR近似服從正態(tài)分布，從而提出了通過(guò)區(qū)間估計(jì)的方法選取確定三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，根據(jù)不同的放大倍數(shù)、不同的復(fù)原要求建立相應(yīng)的區(qū)間估計(jì)公式，并利用排序方法，選取適當(dāng)?shù)娜S點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。該方法的提出，為數(shù)字共焦顯微技術(shù)的三維顯微圖像去卷積復(fù)原處理提供了一種有效的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)選取方法。

四、附圖說(shuō)明

圖1是改善信噪比ISNR頻率分布圖。

圖2是二維原始清晰圖像作為初始樣本。

圖3是g₄₀取中心層的二維圖像。

圖4是采用h_{7_7}復(fù)原處理后的結(jié)果圖。

圖5是采用h_{9_9}復(fù)原處理后的結(jié)果圖。

圖6是采用h_{13_13}復(fù)原處理后的結(jié)果圖。

五、具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述的基于區(qū)間估計(jì)的顯微成像系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的選取方法，包括如下步驟：

1.三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)制作

設(shè)置參數(shù)：顯微鏡機(jī)械鏡筒長(zhǎng)度為160mm；光源波長(zhǎng)為550nm；CCD參數(shù)：1/3英寸，像素值640×480。

顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)放大倍數(shù)M和數(shù)字孔徑NA取以下設(shè)置：

放大倍數(shù)M＝40倍；數(shù)值孔徑NA＝0.6；

三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距L取0.1μm，制作空間大小為21×21×21的3D-PSF，其徑向大小為21×21，軸向大小為21，以h_{40_21_21}表示。

以h_{40_21_21}的空間中心點(diǎn)(11,11,11)為中心，分別向四周依次截取空間大小為3×3×3、3×3×5、3×3×7、…、3×3×21、5×5×5、5×5×7、…、21×21×21，共100個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，命名為h_{3_3}、h_{3_5}、h_{3_7}…、h_{21_21}。

2.三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)能量計(jì)算

分別計(jì)算步驟1得到的100個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的能量值E。各三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的能量值均以h_{40_21_21}能量值為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理，并計(jì)算相應(yīng)的空間大小。

3.三維樣本仿真圖像f制作

以圖2中二維原始清晰圖像作為初始樣本，大小為151×151，通過(guò)微量旋轉(zhuǎn)疊加制作含21幅二維圖像的三維仿真樣本圖像f，大小為151×151×21。

4.模糊仿真三維成像圖像g₄₀生成

用h_{40_21_21}與圖像f進(jìn)行卷積運(yùn)算，生成得到三維模糊圖像g₄₀，圖3所示為g₄₀取中心層的二維圖像。

5.三維仿真圖像復(fù)原

分別用步驟1得到的100個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)對(duì)模糊仿真圖像g₄₀進(jìn)行去卷積復(fù)原處理，復(fù)原方法采用最大似然法，迭代次數(shù)為500次。

6.區(qū)間參數(shù)的確定

分別計(jì)算100個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)對(duì)圖像復(fù)原實(shí)驗(yàn)得到的改善信噪比ISNR，對(duì)改善信噪比ISNR歸一化并計(jì)算出均值μ與標(biāo)準(zhǔn)差σ，計(jì)算結(jié)果如表1所示。

表1不同放大倍數(shù)下，歸一化后改善信噪比ISNR的均值和標(biāo)準(zhǔn)差

不同放大倍數(shù)時(shí)，對(duì)區(qū)間的端點(diǎn)值a_i、b_i和c_i進(jìn)行不同的選取確定。根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，區(qū)間的端點(diǎn)值的選取如表2。

表2不同放大倍數(shù)下，區(qū)間的端點(diǎn)值

7.可選三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的確定

40倍時(shí)，從表1和表2可以看出，歸一化后的改善信噪比ISNR均值是0.5513，標(biāo)準(zhǔn)差是0.2826，ε取經(jīng)驗(yàn)值為0.35，區(qū)間的端點(diǎn)值依次是-2.5、-2、-1、-0.5、1.5、2，則區(qū)間估計(jì)公式為式(2)：

將改善信噪比ISNR代入式(2)，當(dāng)改善信噪比ISNR落在某個(gè)復(fù)原要求的區(qū)間內(nèi)，則該改善信噪比ISNR對(duì)應(yīng)的3D-PSF就是一個(gè)可選結(jié)果。將不同復(fù)原要求下的可選結(jié)果列出，并列出相應(yīng)的3D-PSF的能量與空間大小，如表3所示。

表3 40倍時(shí)，不同復(fù)原要求下可選3D-PSF

8.排序方法確定合適的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

為選取出最終的3D-PSF，可利用排序的方法。以表3中復(fù)原要求是“正常查看”為例，方法如下：

首先，選出空間大小最小的三個(gè)可選3D-PSF。從表3中可以看出，“正常查看”要求下，空間大小最小的依次是729、833、845，對(duì)應(yīng)的3D-PSF為h_{9_9}、h_{7_17}、h_{13_5}；

其次，將上一步中得到的三個(gè)可選3D-PSF在空間大小、改善信噪比ISNR、能量三方面按照大小排序。空間大小由小到大依次是729、833、845，對(duì)應(yīng)的3D-PSF順序?yàn)閔_{9_9}、h_{7_17}、h_{13_5}；改善信噪比ISNR由小到大依次是0.4546、0.4590、0.4641，對(duì)應(yīng)的3D-PSF順序?yàn)閔_{7_17}、h_{9_9}、h_{13_5}；能量由小到大依次是0.3813、0.6146、0.8740，對(duì)應(yīng)的3D-PSF順序?yàn)閔_{13_5}、h_{9_9}、h_{7_17}。排序情況如表4所示。

表4復(fù)原要求為“正常查看”，對(duì)可選3D-PSF在空間大小、改善信噪比ISNR、能量三方面排序

最后，對(duì)排序情況，空間大小選擇較小的兩個(gè)可選結(jié)果，改善信噪比ISNR、能量選擇較大的兩個(gè)可選結(jié)果。從表4的排序結(jié)果看，空間大小較小的為h_{9_9}和h_{7_17}，改善信噪比ISNR較大的為h_{9_9}和h_{13_5}，能量較大的為h_{9_9}和h_{7_17}。可以看出，滿足三方面要求的結(jié)果是h_{9_9}，即是最終結(jié)果。

當(dāng)復(fù)原要求為“快速瀏覽”或者“精細(xì)分析”時(shí)，同樣可以用排序的方法。

經(jīng)過(guò)排序，若復(fù)原后用于快速瀏覽，符合要求的3D-PSF是h_{7_7}；若用于正常查看，符合要求的3D-PSF是h_{9_9}；若用于精細(xì)分析，則符合要求的3D-PSF是h_{13_13}。采用h_{7_7}、h_{9_9}、h_{13_13}復(fù)原處理后的結(jié)果如圖4、5、6所示。