一種氨基脲衍生化試劑及其快速檢測卡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種氨基脲（SEM）的衍生化試劑和快速檢測卡。所述衍生化試劑為帶有帶有特異性小分子標(biāo)記的醛基苯甲酸，所述醛基苯甲酸能通過醛基與代謝產(chǎn)物的氨基反應(yīng)，形成帶有特異性分子標(biāo)記的代謝產(chǎn)物?醛基苯甲酸衍生物，該特異性分子標(biāo)記分子能與磁珠上的配體結(jié)合，通過磁珠分離得到氨基脲衍生化產(chǎn)物標(biāo)記的磁珠，該磁珠直接滴加在快速層析卡上進(jìn)行檢測。本發(fā)利用側(cè)向?qū)游龅膬?yōu)勢，簡化了呋喃類特征代謝產(chǎn)物衍生物的分離和純化步驟，減少檢測時間和操作誤差。
【專利說明】
一種氨基脲衍生化試劑及其快速檢測卡
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種氨基脲衍生化試劑及快速檢測卡。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基脲(semicarbazide，SEM)是呋喃西林的特征代謝產(chǎn)物。呋喃西林屬于硝基呋喃類抗生素，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌均有作用，被廣泛作治療藥物和飼料添加劑用于禽、畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制疾病或疫情。由于呋喃西林存在一定的致癌性，歐盟、澳大利亞、美國和中國相繼臺了相關(guān)法律，限制呋喃西林在養(yǎng)殖業(yè)的使用。
[0003]呋喃西林在動物體內(nèi)極易降解為氨基脲，但氨基脲易與蛋白質(zhì)結(jié)合，且結(jié)合產(chǎn)物穩(wěn)定不易分解，可在動物體內(nèi)存留數(shù)周，常用的食品烹飪方法如蒸煮、煎炸、烘烤和微波加熱等均無法使代謝物完全降解。因此氨基脲常被用作檢測呋喃西林原藥的標(biāo)記物，世界上大多數(shù)國家都以監(jiān)測氨基脲來達(dá)到對呋喃西林原藥監(jiān)控的目的。
[0004]目前對檢測呋喃西林殘留物氨基脲的方法主要采用液液萃取高效液相色譜(HPLC)法、固相萃取高效液相色譜法，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)法，酶聯(lián)免疫法，毛細(xì)管色譜分析方法等。這些方法主要存在需要大型儀器，衍生物萃取純化過程復(fù)雜，檢測時間長等不足。而對于基于免疫學(xué)的檢測方法如酶聯(lián)免疫和快速膠體金檢測卡則存在衍生物萃取、回收效率低、有機萃取試劑破壞抗體活性等問題，這些對于檢測的穩(wěn)定性和精度造成較大影響，極易產(chǎn)生較大的批間差，降低產(chǎn)品穩(wěn)定性。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種快速、簡便、穩(wěn)定的氨基脲夾心檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述問題，發(fā)明人提供了一種硝基呋喃特征代謝產(chǎn)物SEM衍生化試劑及基于磁珠分離的快速層析檢測卡。具體為:
本發(fā)明提供一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，所述SEM衍生化試劑為帶有特異性分子標(biāo)記的醛基苯甲酸，所述醛基苯甲酸能通過醛基與代謝產(chǎn)物的氨基反應(yīng)，形成帶有特異分子標(biāo)記的代謝產(chǎn)物-醛基苯甲酸衍生物(SEM-醛基苯甲酸-標(biāo)記分子)。
[0006]所述的特異性分子標(biāo)記能夠與磁珠微球上包被的受體結(jié)合，形成SEM-醛基苯甲酸-標(biāo)記分子-磁珠復(fù)合體。
[0007]所述的特異分子標(biāo)記直接連接或通過一段直鏈分子連接在醛基苯甲酸的羧基上，該直鏈分子長度為10-20個原子，
所述特異分子標(biāo)記為萊克多巴胺、生物素、各種熒光分子及具有特異性配體(或抗體)的受體小分子等。
[0008]所述的磁珠表面包被能與特異分子結(jié)合的受體(或抗體)，所述磁珠直徑在20nm-1OOum0
[0009]以上氨基脲(SEM)的衍生化試劑用于呋喃西林原藥監(jiān)控。
[0010]本發(fā)明還提供一種呋喃類代謝物的檢測卡，由底板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組裝而成:
(1)底板具有粘性，樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙均粘貼在底板上；
(2)所述樣品墊為經(jīng)含PH7-8的緩沖液處理并干燥后的玻璃纖維，緩沖液包括磷酸緩沖液，或硼酸緩沖液，或HEPES緩沖液，或Tris緩沖液，所述樣品墊與所述硝酸纖維素膜之間有2_3mm的重疊；
(3)所述硝酸纖維素膜上固定了識別代謝物-醛基苯甲酸的抗體作為檢測線，固定了抗鼠的二抗為質(zhì)控線；
(4)吸水紙粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一端，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2_3mm的重疊。
[0011 ]本發(fā)明的氨基脲衍生化試劑基于磁珠分離法，能簡化氨基脲衍生物的分離和純化步驟，極大地簡化了檢測步驟、降低檢測時間和操作誤差。
【附圖說明】
[0012]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0013]圖1為本發(fā)明所述檢測方法的靈敏度實驗結(jié)果圖，即不同SEM濃度檢測結(jié)果。
[0014]圖2為本發(fā)明所述檢測方法的特異性實驗結(jié)果圖，即同呋喃類代謝產(chǎn)物Α0Ζ、ΑΜ0Ζ、AHD與SEM檢測結(jié)果對比。
【具體實施方式】
[0015]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0016]實施例1
以萊克多巴胺修飾的對醛基苯甲酸為例進(jìn)行說明:
(I)磁珠制備
移取0.5mL (1mg)的羧基磁珠至15mL離心管內(nèi)，并放置在磁分離架上直到上清液變完全透徹后，用吸管小心移棄上清。加5mL of MES緩沖液充分混勻洗滌。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗三次。最后一次洗滌后，重懸磁珠于5mL的MES緩沖液中。將EDAC從冷藏處取出置于室溫30分鐘。稱取16mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)加入裝有磁珠的離心管內(nèi)，劇烈振蕩搖勻。室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上活化反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)過程中，注意不讓磁珠沉淀聚積在一起。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗四次。取200mg萊克多巴胺抗體加入到該溶液中，反應(yīng)Ih后清洗3次，隨后用含1%BSA的PBS封閉保存。
[0017](2)檢測線和質(zhì)控線檢測線和質(zhì)控線用針對氨基脲衍生化的鼠單抗及抗萊克多巴胺抗體分別以lmg/mL以5cm/s速度畫線制備。
[0018](3)樣品墊制備
以PH為8.5的50mM的硼酸緩沖液浸泡玻璃纖維，烘干后備用。
[0019](4)試紙條組裝
樣品墊、硝酸纖維膜、吸水紙按照2-3mm重疊依次黏貼在底襯上，并用切條機切為3mm條子，包裝后干燥室溫保存。
[0020](5)動物組織樣品前處理
將經(jīng)質(zhì)譜檢測無呋喃類藥物殘留的魚肉組織破碎，用組織勻漿器勻漿，分別加入不同濃度的SEM和I Oyg/!不同呋喃藥物類代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、AHD均質(zhì)混勻。準(zhǔn)確稱取I g均質(zhì)后的組織樣本，用8mL超純水稀釋，混勻后加入1yL IM的HCl，混勻后加入10yL萊克多巴胺修飾的對醛基苯甲酸的水溶液(20 g/L)混勻后37°C震蕩1-2小時。其后5000rpm離心后取上清100-150yL加到10yL磁珠的I3BS溶液中，混合20min后用磁架分離磁珠，清洗3次后用100μLPBS重選并滴加到檢測卡的樣品墊上進(jìn)行檢測。上樣后5分鐘觀察結(jié)果。
[0021]實施例2
以地高辛修飾的對醛基苯甲酸為例進(jìn)行說明:
(I)磁珠制備
移取0.5mL (1mg)的羧基磁珠至15mL離心管內(nèi)，并放置在磁分離架上直到上清液變完全透徹后，用吸管小心移棄上清。加5mL of MES緩沖液充分混勻洗滌。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗三次。最后一次洗滌后，重懸磁珠于5mL的MES緩沖液中。將EDAC從冷藏處取出置于室溫30分鐘。稱取16mg EDAC加入裝有磁珠的離心管內(nèi)，劇烈振蕩搖勻。室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上活化反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)過程中，注意不讓磁珠沉淀聚積在一起。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗四次。取200mg地高辛抗體加入到該溶液中，反應(yīng)Ih后清洗3次，隨后用含1%BSA的PBS封閉保存。
[0022](2)檢測線和質(zhì)控線
檢測線和質(zhì)控線用針對氨基脲衍生化的鼠單抗及抗地高辛抗體分別以lmg/mL以5cm/s速度畫線制備。
[0023](3)樣品墊制備
以PH為8.5的50mM的硼酸緩沖液浸泡玻璃纖維，烘干后備用。
[0024](4)試紙條組裝
樣品墊、硝酸纖維膜、吸水紙按照2-3mm重疊依次黏貼在底襯上，并用切條機切為3mm條子，包裝后干燥室溫保存。
[0025](5)動物組織樣品前處理
將經(jīng)質(zhì)譜檢測無呋喃類藥物殘留的魚肉組織破碎，用組織勻漿器勻漿，分別加入不同濃度的SEM和I Oyg/!不同呋喃藥物類代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、AHD均質(zhì)混勻。準(zhǔn)確稱取I g均質(zhì)后的組織樣本，用8mL超純水稀釋，混勻后加入1yL IM的HCl，混勻后加入10yL地高辛修飾的對醛基苯甲酸的水溶液(20 g/L)混勻后37°C震蕩1-2小時。其后5000rpm離心后取上清100-150yL加到10yL磁珠的PBS溶液中，混合20min后用磁架分離磁珠，清洗3次后用10yLPBS重選并滴加到檢測卡的樣品墊上進(jìn)行檢測。上樣后5分鐘觀察結(jié)果。
[0026]實施例3
以花氰染料5修飾的對醛基苯甲酸為例進(jìn)行說明:
(I)磁珠制備
移取0.5mL (1mg)的羧基磁珠至15mL離心管內(nèi)，并放置在磁分離架上直到上清液變完全透徹后，用吸管小心移棄上清。加5mL of MES緩沖液充分混勻洗滌。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗三次。最后一次洗滌后，重懸磁珠于5mL的MES緩沖液中。將EDAC從冷藏處取出置于室溫30分鐘。稱取16mg EDAC加入裝有磁珠的離心管內(nèi)，劇烈振蕩搖勻。室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上活化反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)過程中，注意不讓磁珠沉淀聚積在一起。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后用吸管小心移棄上清。重復(fù)清洗四次。取200mg花氰染料5抗體加入到該溶液中，反應(yīng)Ih后清洗3次，隨后用含1%BSA的PBS封閉保存。
[0027](2)檢測線和質(zhì)控線
檢測線和質(zhì)控線用針對氨基脲衍生化的鼠單抗及抗花氰染料5抗體分別以lmg/mL以5cm/s速度畫線制備。
[0028](3)樣品墊制備
以PH為8.5的50mM的硼酸緩沖液浸泡玻璃纖維，烘干后備用。
[0029](4)試紙條組裝
樣品墊、硝酸纖維膜、吸水紙按照2-3mm重疊依次黏貼在底襯上，并用切條機切為3mm條子，包裝后干燥室溫保存。
[0030](5)動物組織樣品前處理
將經(jīng)質(zhì)譜檢測無呋喃類藥物殘留的魚肉組織破碎，用組織勻漿器勻漿，分別加入不同濃度的SEM和I Oyg/!不同呋喃藥物類代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、AHD均質(zhì)混勻。準(zhǔn)確稱取I g均質(zhì)后的組織樣本，用8mL超純水稀釋，混勻后加入1yL IM的HCl，混勻后加入10yL地高辛修飾的對醛基苯甲酸的水溶液(20 g/L)混勻后37°C震蕩1-2小時。其后5000rpm離心后取上清100-150yL加到10yL磁珠的PBS溶液中，混合20min后用磁架分離磁珠，清洗3次后用10yLPBS重選并滴加到檢測卡的樣品墊上進(jìn)行檢測。上樣后5分鐘觀察結(jié)果。
[0031]以上三個實施例的檢測結(jié)果均見圖1和圖2。
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，其特征在于，所述SEM衍生化試劑為帶有特異性分子標(biāo)記的醛基苯甲酸，所述醛基苯甲酸能通過醛基與代謝產(chǎn)物的氨基反應(yīng)，形成帶有特異分子標(biāo)記的代謝產(chǎn)物-醛基苯甲酸衍生物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，其特征在于，所述的特異性分子標(biāo)記能夠與磁珠微球上包被的受體結(jié)合，形成SEM-醛基苯甲酸-標(biāo)記分子-磁珠復(fù)合體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，其特征在于，所述磁珠微球直徑為 20nm-100um。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，其特征在于，所述特異分子標(biāo)記為萊克多巴胺、生物素、各種熒光分子及具有特異性配體或抗體的受體小分子。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種氨基脲(SEM)的衍生化試劑，其特征在于，所述的特異分子標(biāo)記直接連接或通過一段直鏈分子連接在醛基苯甲酸的羧基上，該直鏈分子長度為10-20個原子。6.權(quán)利要求1所述的氨基脲(SEM)的衍生化試劑用于呋喃西林原藥監(jiān)控。7.—種氨基脲(SEM)的快速檢測卡，由底板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組裝而成，其特征在于: (1)底板具有粘性，樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙均粘貼在底板上； (2)所述樣品墊為經(jīng)含PH7-8的緩沖液處理并干燥后的玻璃纖維，緩沖液包括磷酸緩沖液，或硼酸緩沖液，或HEPES緩沖液，或Tris緩沖液，所述樣品墊與所述硝酸纖維素膜之間有2_3mm的重疊； (3)所述硝酸纖維素膜上固定了識別代謝物-醛基苯甲酸的抗體作為檢測線，固定了抗鼠的二抗為質(zhì)控線； (4)吸水紙粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一端，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2_3mm的重疊。
【文檔編號】G01N33/558GK106093379SQ201610408174
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】曾令文, 魯學(xué)文, 方志遠(yuǎn)
【申請人】中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院