在兩液體間的薄固態(tài)界面上成像的方法
【專利摘要】在此描述了一種用于光學(xué)顯微工具的流體室，其具有固態(tài)膜，該固態(tài)膜具有第一側(cè)和相對的第二側(cè)；位于所述膜第一側(cè)的第一流體腔，包括具有第一折射率的第一液體；以及位于所述膜第二側(cè)的第二流體腔，包括具有第二折射率的第二液體，其中，第二折射率與第一折射率不同。在此還描述了把單個的生物分子成像的方法，該方法包括在具有不同折射率的第一液體和第二液體之間的固態(tài)膜處產(chǎn)生隱失照明場；以及探測位于所述固態(tài)膜處的單個的生物分子所連接的光學(xué)探測標(biāo)記所發(fā)射的光。
【專利說明】在兩液體間的薄固態(tài)界面上成像的方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2009年3月26日遞交的第61/211，260號美國臨時(shí)專利申請的所有權(quán)益。通過參考引用，該專利申請的全部內(nèi)容被并入本申請。
[0003]政府支持
[0004]本發(fā)明是在第HG-004128號合同下，在國家衛(wèi)生研究院撥款的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明是有關(guān)光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明利用兩液體間的薄固態(tài)界面改進(jìn)了生物分子的成像。
【背景技術(shù)】
[0006]第一個參照人基因組序列的完成標(biāo)志著一個時(shí)代的到來，基因體變異直接影響了藥物發(fā)現(xiàn)和醫(yī)療。這個新的范式產(chǎn)生了對便宜和超快的DNA測序方法的急迫需求。在不久的將來，醫(yī)療從業(yè)者將能夠在臨床場合，在開處方之前常規(guī)地分析患者的DNA，并且與記載有和任何藥品相關(guān)的基因信息的在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核對。此外，負(fù)擔(dān)得起的測序技術(shù)將改變比較基因組學(xué)和分子生物學(xué)的研究，允許科學(xué)家快速測序來自細(xì)胞變異體的整個基因組。為了實(shí)現(xiàn)超快和便宜的DNA測序，需要新技術(shù)來代替基于Sanger雙脫氧鏈終止協(xié)議的經(jīng)典方法。這些新技術(shù)應(yīng)該解決兩個主要的瓶頸:(I)樣本尺寸應(yīng)該被降到最低，使得可以從單個的DNA分子或少量的拷貝讀出序列；以及(2)與當(dāng)前的現(xiàn)有技術(shù)相比，讀出速度應(yīng)該提高幾個數(shù)量級。
[0007]固態(tài)表面，如氮化硅、氧化硅及其他，已經(jīng)被很多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用所采用，包括組織工程、可植入裝置以及基本研究。薄固態(tài)表面已經(jīng)被用于不同的微米級和納米級結(jié)構(gòu)裝置，如生物傳感和DNA測序應(yīng)用中所采用的納米縫隙和納米孔陣列。最近有資料顯示氮化硅膜適于作為襯底，以為例如生物分子探測和DNA測序這些應(yīng)用產(chǎn)生固態(tài)納米孔。涉及DNA易位的單分子光學(xué)探測的，以及通過固態(tài)納米孔解鏈的固態(tài)裝置已經(jīng)被認(rèn)為對生物傳感和基因組測序非常關(guān)鍵。對于通過這些裝置進(jìn)行單分子的體外光學(xué)信號測量，采用顯微鏡的隱失模式非常有用。
[0008]在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療裝置領(lǐng)域，希望能夠利用目標(biāo)材料通過成像來研究分子、細(xì)胞和組織。全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM或TIRF)就是一項(xiàng)這樣的成像技術(shù)。固態(tài)材料已經(jīng)被用于那些情況，然而它們與最新的光學(xué)顯微方法不兼容，如TIRF。在現(xiàn)有的技術(shù)中，很難把這些固態(tài)材料表面帶入另一表面，如蓋玻片的隱失場，并且構(gòu)造把氮化硅膜和生物樣本帶入TIRF隱失場環(huán)境所要求的納米流體通道非常繁瑣。此外，由于微粒所固有的密度(即使在干凈的房間環(huán)境里)、在處理這些氮化硅晶圓的過程中所產(chǎn)生的顆粒物以及這些氮化硅膜芯片的溫度約束限制，用氮化硅表面密封這些納米孔非常困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的實(shí)施例通過橫亙這些固態(tài)膜的兩介質(zhì)之間的折射率匹配的TIRFM(全內(nèi)反射熒光顯微鏡)，在這些固態(tài)膜(攜帶納米孔裝置和其他生物樣本)處實(shí)現(xiàn)了隱失模式激發(fā)。這使得可以獲得膜上的一個或者更多生物分子的高分辨率、高對比度以及高感光度圖像。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，披露了光學(xué)顯微工具的流體室，其包括具有第一側(cè)和相對的第二側(cè)的固態(tài)膜，位于膜第一側(cè)的第一流體腔，該第一流體腔包括具有第一折射率的第一流體，以及位于膜第二側(cè)的第二流體腔，該第二流體腔包括具有第二折射率的第二流體，其中，第一折射率高于第二折射率。
[0011]固態(tài)膜可以是氮化硅、氧化硅、氧化鋁、氧化鈦或其他介電材料。
[00?2 ]固態(tài)膜可以包括沉積在娃晶圓上的氮化娃層。該氮化娃層可以是5?50nm厚。該娃晶圓可包括一窗口，所述氮化硅層覆蓋或延伸跨越該窗口。
[0013]第一液體可以是水性緩沖溶液或水。第二液體可以是細(xì)胞液、細(xì)胞膜或甘油。第一液體可以是濃縮的尿素溶液或CsCl溶液。
[0014]可以在所述膜的第二側(cè)提供連接到光學(xué)生物標(biāo)記的生物分子。該生物分子可以是DNA分子。該生物分子可以是RNA分子。該生物分子可以是蛋白分子。該光學(xué)生物標(biāo)記可以是易激發(fā)的熒光團(tuán)。
[0015]第一液體腔可以是微通道。
[0016]固態(tài)膜可以包括至少一個納米孔，在一些實(shí)施方式中，其包括多個納米孔。這些納米孔可以排布成圓形或多邊形陣列。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，披露了用于把單個的DNA分子成像的光學(xué)顯微工具，其包括流體室，該流體室包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態(tài)膜，位于該固態(tài)膜一側(cè)的第一液體腔，該第一液體腔內(nèi)的具有第一折射率的第一液體，位于該固態(tài)膜另一側(cè)的第二液體腔，該第二液體腔內(nèi)的具有第二折射率的第二液體，其中，第二折射率低于第一折射率;蓋玻片，流體室安置在蓋玻片上，使得蓋玻片形成所述第一液體腔的底面;物鏡;物鏡和蓋玻片之間的浸鏡油;光源，被設(shè)置成把光導(dǎo)向所述物鏡，所述物鏡被設(shè)置成把所述光聚焦，使得產(chǎn)生小于所述固態(tài)膜覆蓋的窗口的隱失照明場；以及圖像探測器，探測所述固態(tài)膜處的單個的DNA分子發(fā)出的光。
[0018]所述光源可以包括至少一個激勵激光器，在一些實(shí)施方式中，包括多個產(chǎn)生不同波長激光束的激光器。所述圖像探測器可以包括電子倍增電荷耦合器件(CCD)攝像機(jī)或光探測器。
[0019]生物素-鏈霉親和素化學(xué)法可被用于把單個的DNA分子固定在所述固態(tài)膜上。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，披露了用于成像單個的生物分子的光學(xué)顯微工具，其包括用于產(chǎn)生位于固態(tài)膜的隱失照明場的裝置，該固態(tài)膜位于具有不同折射率的第一液體和第二液體之間；以及用于探測位于所述固態(tài)膜上的單個的生物分子所連接的光學(xué)標(biāo)記發(fā)射出的光的裝置。
[0021]所述用于產(chǎn)生位于固態(tài)膜的隱失照明場的裝置可以包括激勵激光器和聚焦透鏡。所述用于探測由光學(xué)標(biāo)記發(fā)射的光的裝置可以包括光探測器或電子倍增CCD攝像機(jī)。
[0022]所述光學(xué)顯微工具還可以包括用于把所述單個的生物分子固定于所述固態(tài)膜的
目.0
[0023]所述隱失照明場可以小于所述固態(tài)膜的尺寸。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，披露了成像單個的生物分子的方法，其包括在固態(tài)膜處產(chǎn)生隱失照明場，該固態(tài)膜位于具有不同折射率的第一液體和第二液體之間；以及探測位于所述固態(tài)膜的單個的生物分子所連接的光學(xué)標(biāo)記發(fā)射的光。
[0025]所述方法還包括把所述單個的生物分子固定于所述固態(tài)膜。
[0026]從所述探測到的光產(chǎn)生圖像。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，披露了成像單個的DNA分子的方法，其包括把光導(dǎo)向光學(xué)顯微工具的物鏡；引導(dǎo)光穿過第一液體;在氮化硅膜處反射該光以在第二液體內(nèi)產(chǎn)生隱失照明場；以及把所述隱失照明場激發(fā)的并連接至所述單個的DNA分子的光學(xué)標(biāo)記所發(fā)射的光導(dǎo)向成像探測器。
[0028]所述隱失照明場可以在所述第二液體內(nèi)產(chǎn)生。所述單個的DNA分子可以被固定在所述第二液體內(nèi)氮化硅膜上。
【附圖說明】
[0029]圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的流體室的示意圖。
[0030]圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的流體室的界面的透視圖。
[0031 ]圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的界面處TIR的示意圖。
[0032]圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的光學(xué)顯微工具的示意圖。
[0033]圖5是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的在TIRF下成像的單個的DNA分子的熒光圖像。
[0034]圖6是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的DNA測序方法的示意圖。
[0035]圖7是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的利用一比特(a)和兩比特(b)DNA讀出的同時(shí)進(jìn)行電子光學(xué)探測的示意圖。
[0036]圖8是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的多色光學(xué)顯微工具設(shè)置的示意圖。
[0037]圖9是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的孔定位計(jì)數(shù)的直方圖。
[0038]圖1OA和1B根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例展示了多孔探測中的額外步驟，包括從多個孔同時(shí)讀出(圖10A)和多個比特的同時(shí)讀出(圖10B)。
[0039]圖11是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的流體室的示意圖。
[0040]圖1IA是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的圖11所示的流體室的詳細(xì)示意圖。
[0041]圖1IB是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的圖11所示的界面的詳細(xì)示意圖。
[0042]圖12是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的在TIRF下成像的單個的DNA分子的熒光圖像。
[0043]圖13是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的分析硬件的方塊圖。
[0044]圖14A?C根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例展不了電和光信號的同步。
[0045]圖15A?15B根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例展示了DNA分子穿過納米孔的過程。
[0046]圖16A?16B展示了在如圖15A?15B所示的穿過事件過程中，電和光信號的同步。
[0047]圖17是根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的界面處TIR的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明的實(shí)施例是有關(guān)通過厚度為納米級的固態(tài)膜成像單個的分子和生物材料的方法。該方法具有優(yōu)勢，因?yàn)槌丝梢詫蝹€的分子和生物材料進(jìn)行傳統(tǒng)的電測量外，還可以進(jìn)行光學(xué)(如熒光)測量。在一個實(shí)施例中，通過兩易混的/不相混的液體間的薄固態(tài)界面，在隱失模式下成像單個的分子或生物材料。流體室提供了具有不同折射率的兩易混液體間的固態(tài)界面。該固態(tài)界面的厚度可以是幾納米或幾十納米，并可以用氮化硅、氧化硅和/或類似物制成。
[0049]可以在所述兩液體上施加電勢，使得生物分子(如DNA、RNA或蛋白)穿過所述固態(tài)界面中的納米孔或納米孔陣列。在DNA易位中，單鏈DNA分子被電泳驅(qū)動，以單列形式穿過納米孔。在該實(shí)施例中，通過生物化學(xué)轉(zhuǎn)化，目標(biāo)DNA序列的每一堿基首先被映射至2或4單元代碼，2 10-20bp核苷酸序列。接著，這些2-單元或4-單元代碼被雜交成互補(bǔ)的，熒光標(biāo)記的，以及自我猝滅的分子信標(biāo)。因?yàn)樵诖┻^納米孔的易位過程中，分子信標(biāo)是連續(xù)地解鏈，它們的熒光標(biāo)記沒有滅失，并且由單色或多色(如兩種或更多顏色)全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)讀取。接著，把獲得的單色或多色光學(xué)信號關(guān)聯(lián)至所述目標(biāo)DNA序列。
[0050]本發(fā)明的實(shí)施例有優(yōu)勢，因?yàn)槠淇梢垣@得高分辨率和高感光度的單個的生物分子或生物材料的圖像，這些生物分子或生物材料被固定在所述固態(tài)界面上，位于“厚”的水性液體層(即高折射率液體)之上。更具體地，通過在所述“厚”的水性液體層內(nèi)的深處實(shí)現(xiàn)隱失場，在該薄固態(tài)界面處的分子或生物材料的高光學(xué)對比度探測可被用于成像所述單個的生物分子或生物材料。
[0051 ]圖1展示了本發(fā)明一個實(shí)施例的流體室。如圖1所示，流體室100包括第一腔104和第二腔108。第一液體112在第一腔104內(nèi)，而第二液體116在第二腔108內(nèi)。如此選擇該兩液體112和116，使得它們具有不同的折射率。第一液體112的折射率比第二液體116的高。這樣選擇兩液體112和116的折射率，以在界面120處達(dá)成全內(nèi)反射(TIR)。例如，第一液體112可以是細(xì)胞質(zhì)U= 1.36)或細(xì)胞膜(η = 1.47)，而第二液體116可以是水性緩沖溶液(η =1.33)。在又一實(shí)施例中，第一液體112含有鹽。兩液體112和116均為水性溶液。
[0052]流體室100還包括界面120。界面120包括固態(tài)膜124。界面120位于第一腔104和第二腔108之間，以把兩液體112和116隔離。兩液體112和116之間的界面120使得可以發(fā)生全內(nèi)反射(TIR)。更具體地，TIR照明在固態(tài)膜124(如SiN膜)處發(fā)生，并且在第一腔104內(nèi)產(chǎn)生隱失波。界面120，尤其是膜124形成了生物分子互動的基底。
[0053]圖2詳細(xì)展示了界面120。如圖2所示，界面220包括具有窗口224的芯片228。芯片228作為框架支持覆蓋窗口 224的固態(tài)膜。該芯片的尺寸的例子可以是5mm*5mm*300ym，而該膜的尺寸的例子可以是50μηι*50μηι*5?50nm。界面220可以用任何合適的固態(tài)材料(如娃基材料)，以傳統(tǒng)的技術(shù)制成，包括化學(xué)氣相沉積(CVD)、濕蝕刻以及光刻法。
[0054]在一個實(shí)施例中，芯片228是硅，并且覆蓋有氮化硅膜。可以理解，該膜可以是任何能形成薄膜的介電材料。膜的材料的其他例子包括氧化硅、氧化鋁、氧化鈦等。芯片材料的其他例子包括玻璃、熔融硅石、石英等。
[0055]在此描述的固態(tài)膜的厚度可以是大約5?60nm。例如，固態(tài)膜可以是大約1nm厚。然而，可以理解，可以根據(jù)兩易混液體間由TIR照明產(chǎn)生的隱失波的期望的尺寸和衰減，來選擇所述膜的厚度，其可以小于5nm或大于60nm。膜的納米級厚度幫助界定了兩液體間界面的清晰的邊界，TIR就在該界面處發(fā)生。
[0056]可以理解，在一些實(shí)施例中，固態(tài)膜可以包括納米孔、納米縫隙或納米孔陣列。這些納米孔(I?10nm)或納米孔陣列跨越界面連接了這些液體。固態(tài)納米孔具有可調(diào)的尺寸，并且可以承受較大范圍的溫度、PH以及化學(xué)變化?？梢杂美鏏r離子束或電子束雕刻，或反應(yīng)性離子蝕刻等方法來制作納米孔。
[0057]圖3展示了設(shè)于普通顯微鏡蓋玻片240上的流體室100，用于和光學(xué)顯微工具一起進(jìn)行基于TIR的測量。蓋玻片240設(shè)于物鏡236上，蓋玻片240和物鏡236之間有浸鏡油238。一種或更多連接至光學(xué)標(biāo)記，例如熒光團(tuán)，的生物分子或生物材料被固定在膜224上，以進(jìn)行成像。
[0058]光學(xué)標(biāo)記可以是任何暴露于隱失波時(shí)照明或者發(fā)射輻射的材料。光學(xué)生物標(biāo)記的例子包括熒光丙烷或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)標(biāo)記(如熒光團(tuán))、量子點(diǎn)或有機(jī)化合物。如業(yè)界一般技術(shù)人員所能理解的，可以利用已知的技術(shù)把光學(xué)生物標(biāo)記和目標(biāo)生物分子締合，例如共價(jià)或非共價(jià)締合。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，光學(xué)標(biāo)記可以是化學(xué)綴合的。在本發(fā)明的一個替代實(shí)施例中，可以通過融合把生物分子和光學(xué)標(biāo)記締合，如綠熒光蛋白融合至細(xì)胞受體或信號分子。
[0059]激光束242被聚焦于物鏡236的后焦面。由于浸鏡油238和蓋玻片240之間的折射率匹配，光反射進(jìn)入介質(zhì)I 216。在膜224處，由于兩液體212和216的折射率不匹配，光全內(nèi)反射246。當(dāng)光從更高折射率介質(zhì)(更稠)到更低折射率(更稀)介質(zhì)，其反射離開表面的法線。當(dāng)該兩介質(zhì)的界面處的入射角大于臨界角時(shí)，光全內(nèi)反射回較稠的介質(zhì)內(nèi)。在較稀的介質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生隱失波246，其具有指數(shù)衰減強(qiáng)度，可激發(fā)膜224表面的熒光團(tuán)(激發(fā)光的“趨膚”深度的數(shù)量級一般為幾十納米)。由激發(fā)熒光團(tuán)250產(chǎn)生的光可被位于蓋玻片240下方的物鏡236聚焦，被成像裝置測量，如CCD攝像機(jī)或光探測器。
[0060]在一個實(shí)施例中，這樣產(chǎn)生光，使得隱失波246的面積小于膜224的面積。在又一實(shí)施例中，這樣產(chǎn)生光，使得隱失波246的面積等于膜224的面積。
[0061]可以理解，在一些實(shí)施例中，可利用各種刺激劑，用膜上的納米孔、納米縫隙或納米孔陣列來局部刺激活細(xì)胞表面。利用在此描述的隱失模式成像，在細(xì)胞膜的末端位置，可以測量對這些刺激的響應(yīng)。
[0062]生物分子或生物材料(如細(xì)胞)可被直接放置于將被成像的膜224上。作為替代方案，可以在膜224和將被成像的生物分子或生物材料之間提供薄的緩沖或中間層。例如，有機(jī)聚合物薄層可被用作該中間層。
[0063]圖4展示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的光學(xué)顯微工具400的一個例子。可以理解，顯微工具400的元件和元件的設(shè)置可以與如圖4所示的不同。顯微工具400包括激光源402、x軸位移臺406、透鏡414、透鏡418、白光源422、偏振分光鏡(PBS)426、透鏡430、物鏡436、雙色鏡(DM) 468、濾鏡472、反光鏡476、透鏡480以及探測器484，如CXD。流體室被置于蓋玻片440上，該流體室包括第一液體412，折射率不同于第一液體412的第二液體416，以及固態(tài)膜424。在蓋玻片440和物鏡436之間提供浸鏡油。
[0064]在所展示的顯微工具400中，激光或白光可被用于進(jìn)行全內(nèi)反射熒光顯微。在一個實(shí)施例中，激光410由激光源402產(chǎn)生，并且由透鏡414和418導(dǎo)向和整形。透鏡430被配置成降低激光束的光斑大小?？梢岳斫?，透鏡414和418也可以降低激光束的光斑大小。利用X軸位移臺406沿X軸移動光纖親合器，可以使光偏移光軸。在又一實(shí)施例中，白光由白光源422產(chǎn)生。在又一實(shí)施例中，白光和激光均可被用于進(jìn)行全內(nèi)反射熒光顯微。分光器426被配置成把由激光源和/或白光源422產(chǎn)生的光導(dǎo)向第一液體412內(nèi)的樣本(如生物分子)。在又一實(shí)施例中，可以同時(shí)使用多個激光波長，或者一次使用一個波長，來激勵單色或多色熒光團(tuán)。
[0065]經(jīng)過透鏡430和雙色鏡468后，所產(chǎn)生的光被物鏡436所限制，從而足夠?qū)е氯珒?nèi)反射的光被導(dǎo)向樣本?？梢岳斫?，物鏡436可以進(jìn)一步降低激光束的光斑大小?？梢岳斫猓す馐墓獍叱叽缈梢允侵睆酱蠹s為0.5?1臟。透鏡414、418、430和/或436收斂光束，使得光束在硅膜處產(chǎn)生的光點(diǎn)的尺寸為直徑大約為5μπι至大約與膜424的面積相當(dāng)。例如，如果膜424的尺寸為50*50μπι2，那么可以產(chǎn)生尺寸為5?50μπι的光點(diǎn)。
[0066]光442在固態(tài)膜424處全內(nèi)反射至蓋玻片440，從而在第二液體416內(nèi)產(chǎn)生隱失場。位于固態(tài)膜424附近的熒光團(tuán)被隱失波激發(fā)，其使得熒光團(tuán)發(fā)射熒光。接著，熒光和反射光452被雙色鏡468導(dǎo)向?yàn)V光鏡472。雙色鏡468和濾光鏡472過濾光，使得只有熒光發(fā)射通過。反射鏡476引導(dǎo)熒光通過透鏡480到達(dá)探測器484。
[0067]探測器484可以是EMCCD攝像機(jī)，比如可以從北愛爾蘭貝爾法斯特的AndοrTechnology pic.(Andor)處購買的iXon BV887。探測器484的其他例子包括雪崩光電二極管(APD)和光電倍增管(PMT)。探測器484可以連接至合適的成像系統(tǒng)，比如基于微軟Windows的個人計(jì)算機(jī)和成像軟件，比如Solis軟件(也來自Andor)，用于處理由探測器484產(chǎn)生的數(shù)據(jù)信號，以產(chǎn)生圖像或一系列圖像。定制的軟件可用于分析這些數(shù)據(jù)信號，探測熒光發(fā)射，并確定受檢測的生物分子或生物材料的序列或其他特征。
[0068]可以理解，界面處TIR激發(fā)的面積取決于激發(fā)光束的性質(zhì)。利用已知的光束整形技術(shù)可以把激光束整形，以控制TIR模式下的激光照明場。這樣，就可以根據(jù)需要提高或降低光束的直徑，或?qū)⑵淅L。
[0069]圖5展不了用顯微工具，如顯微工具400，產(chǎn)生的圖像的例子。在圖5中，展不了一個示例性樣本的TIRF照明504的視野。圖5還展示了用具有兩個代表性液體的顯微工具成像的單個的熒光DNA分子508，具體而言，這兩種液體是7M CsCl (η = 1.416)和8M尿素(η =1.416)。然而，可以理解，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用其他液體來成像單個的生物分子。在圖5中，單個的DNA分子在氮化硅膜上被成像，信號背景比約為2.5，圖像獲取為5幀每秒。
[0070]圖6?1B展示了本發(fā)明的一個實(shí)施例，其中膜124包括納米孔600。如圖6所示，包括具有納米孔610的膜124尤其適用于利用DNA易位進(jìn)行DNA測序?？梢岳斫?，包括具有納米孔600的膜124的實(shí)施例并不限于利用DNA易位進(jìn)行DNA測序。例如，該實(shí)施例可以適用于基因型鑒定應(yīng)用、生物分子成像以及生物分子篩選。在又一例子中，可以通過納米孔600把蛋白成像。
[0071]在DNA易位中，單鏈DNA分子被電泳驅(qū)動以單列的方式穿過納米孔600?？梢岳斫?，在這些實(shí)施方式中，流體室100還進(jìn)一步包括與電源連接的電極，其被配置成產(chǎn)生施加于液體112和116的電勢，以電泳驅(qū)動DNA分子穿過納米孔600。
[0072]在圖6中，待探測的連接至光學(xué)標(biāo)記的單個的生物分子是與代表核苷酸A、T、U、C或G的序列代碼雜交的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，光學(xué)標(biāo)記是特異性報(bào)告所述DNA序列的熒光標(biāo)記。在標(biāo)記操作的一個例子中，原始的DNA是核苷酸基團(tuán)取代的(每一堿基型由3?16個核苷酸的唯一序列取代)。這樣，在納米孔測序的過程中，當(dāng)雜交寡核苷酸從待測序的編碼的核酸解鏈時(shí)，可以探測到連接至光學(xué)標(biāo)記的寡核苷酸。
[0073]例如，在DNA轉(zhuǎn)換操作中，原始DNA序列中的每一堿基由2個二進(jìn)制代碼單元的唯一組合表示(開口圓和實(shí)心圓分別標(biāo)記為O和I)。在該例子中，O和I被定義為10個核苷酸的唯一DNA序列，分別為“S0”和“SI”。被轉(zhuǎn)換的單鏈DNA與兩種分子信標(biāo)雜交，該兩種分子信標(biāo)與所述2個代碼單元互補(bǔ)，并且該被轉(zhuǎn)換的單鏈DNA顯示最小的橫截面。例如，一個信標(biāo)可以在5’端含有紅色熒光團(tuán)并在3’端含有猝光劑Q，而另一信標(biāo)可以在5’端含有綠色熒光團(tuán)并在3’端含有相同的猝光劑分子。廣譜猝光劑Q對兩種熒光團(tuán)都有抑制作用。這兩種不同顏色的熒光團(tuán)使得可以區(qū)分這兩個信標(biāo)。在又一DNA轉(zhuǎn)換操作中，原始DNA序列中的每一堿基由四個獨(dú)特代碼(序列)中的一個來表示，接著，這四個代碼分別與對應(yīng)的4色分子信標(biāo)雜交。在這兩個操作中，經(jīng)轉(zhuǎn)換的DNA序列誘導(dǎo)相鄰的信標(biāo)的排布，使得相鄰信標(biāo)上的猝光劑抑制熒光發(fā)射，從而使DNA保持“暗”，直至各代碼單元被相繼地從DNA去除(除了第一個信標(biāo))?？捎糜诒景l(fā)明的熒光團(tuán)的例子包括TMR和Cy 5?？刹捎玫钠渌愋偷臒晒夥肿影–PM，Invitrogen提供的Alexa系列焚光標(biāo)記，焚光紅家族，以及德克薩斯紅。業(yè)界技術(shù)人員所知的其他信號分子也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？捎糜诒景l(fā)明的多種其他熒光團(tuán)包括美國專利第6，528，258號中所列的那些，通過參考引用，其全部內(nèi)容被并入本申請?？捎糜诒景l(fā)明的猝光分子包括Dabcyl、Dabsyl、甲基紅以及El Ie粹光劑。業(yè)界技術(shù)人員所知的其他粹光分子也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這顯著降低了由相鄰分子和溶液中的自由信標(biāo)所造成的熒光背景，從而獲得較高的信號/背景比。
[0074]請?jiān)賲D6，與經(jīng)轉(zhuǎn)換的DNA互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸與所述DNA雜交，接著，通過電泳將該分子驅(qū)動通過膜124中的納米孔600。當(dāng)探測到由粘附的熒光團(tuán)發(fā)出的不同顏色的閃光時(shí)，納米孔600把寡核苷酸一個一個地從經(jīng)轉(zhuǎn)換的DNA相繼剝離。當(dāng)該分子被引入納米孔，信標(biāo)被一個一個地剝離。每次當(dāng)一個新的信標(biāo)被剝離，就有一個新的熒光團(tuán)被取消抑制并被顯微鏡記錄。被釋放的信標(biāo)被自動關(guān)閉，抑制其自己的熒光，然后其擴(kuò)散離開納米孔的附近。一旦第一信標(biāo)被釋放，來自第二信標(biāo)的新的熒光團(tuán)被點(diǎn)亮。
[0075]DNA易位速度由DNA解鏈動力學(xué)調(diào)節(jié)，通過采用光學(xué)探針(或信標(biāo))獲取堿基之間的對比。DNA進(jìn)入納米孔600把離子電流突然降低到隔斷的水平。當(dāng)DNA從另一側(cè)出來，恢復(fù)開孔電流水平。合適的電壓可被用來調(diào)節(jié)DNA解鏈的時(shí)間(例如I?1ms)。例如，對于10_bp發(fā)夾序列，120mV的電壓所導(dǎo)致的解鏈時(shí)間大約為10ms。用電場強(qiáng)度來調(diào)節(jié)該時(shí)間，以優(yōu)化信號/背景水平。
[0076]在這樣的方式下，可以確定任何核酸的序列。對把被測序的核酸轉(zhuǎn)換為編碼的序列、編碼系統(tǒng)以及納米孔測序的詳細(xì)描述請參Soni和Meller(Soni G.V.and Meller A.，Progress towards ultrafast DNA sequencing using sol id-state nanopores,Clinical Chemistry 53，11 (2007))，Meller等在2009年的發(fā)表(U.S.Patent Applicat1npublicat1n 2009/0029477)，以及Meller和Weng(PCT Applicat1n N0.PCT US 2009/034296)。通過參考引用，這些參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容被并入本申請。可以理解，該方法可用于平行納米穿孔陣列。
[0077]圖7展示了用I比特(如圖7(a))和2比特(如圖7(b))編碼的納米孔測序色彩。如圖7所示，在此描述的裝置和方法使得可以同時(shí)電和光探測I比特和2比特DNA讀出，并且具有較高的信噪比和單個的熒光團(tuán)分辨率。
[0078]可以利用多色光學(xué)顯微工具實(shí)現(xiàn)2比特色彩編碼，比如，如圖8所示的多色TIRF顯微鏡。在如圖8所示的實(shí)施例中，兩個具有不同波長的激光源802a和802b可被單獨(dú)或同時(shí)點(diǎn)亮，以產(chǎn)生具有不同波長的隱失波，從而單獨(dú)或同時(shí)激勵不同光學(xué)標(biāo)記。類似地，對于3個或更多色彩編碼系統(tǒng)，可以單獨(dú)或者同時(shí)點(diǎn)亮三個或四個具有不同波長的激光源，以產(chǎn)生三個或更多具有不同波長的隱失波，從而單獨(dú)或同時(shí)激勵不同光學(xué)標(biāo)記。
[0079]如圖8所示，第一激光源802a產(chǎn)生第一激光束810a，第二激光源802b產(chǎn)生第二激光束810b，第一和第二激光束810a和810b由透鏡L整形并被導(dǎo)向物鏡836。透鏡L被配置成降低由第一和第二激光源802a和802b產(chǎn)生的激光束810a和810b的光斑尺寸。在一個實(shí)施例中，激光源802a和802b是可以照明樣本的藍(lán)色和紅色二極管激光器(488nm和640nm)的組合。如以上結(jié)合圖4所描述的，光802a和802b在膜124處發(fā)生全內(nèi)反射，從而產(chǎn)生隱失場，其激勵連接至在流體室內(nèi)待成像的生物分子的熒光團(tuán)。在如圖8所示的實(shí)施例中，膜124包括納米孔600，其使得可以進(jìn)行如上所述的DNA易位。
[0080]接著，利用物鏡836收集熒光850，由雙色鏡DM和濾鏡F過濾并導(dǎo)向探測器884，比如用于成像的幀轉(zhuǎn)移冷卻式電子倍增電荷耦合器件攝像機(jī)或光探測器。探測器884可以連接至合適的成像系統(tǒng)來處理由探測器884產(chǎn)生的數(shù)據(jù)信號，以產(chǎn)生一幅或一系列圖像，成像系統(tǒng)比如基于微軟Windows的個人計(jì)算機(jī)和成像軟件，例如SoI i s軟件(也是由Andor提供)。定制的軟件也可以用于分析這些數(shù)據(jù)信號，探測熒光發(fā)射，以及測定待測的生物分子(如DNA)的序列或其他特性。
[0081]圖9展示了在DNA解鏈時(shí)，圖8所示的多色光學(xué)顯微工具的孔定位計(jì)數(shù)直方圖的一個例子。
[0082]可以理解，可以利用在此描述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)納米孔陣列的光學(xué)成像。例如，在此描述的光學(xué)成像可被用于從如圖1OA所示的多個孔同時(shí)讀出，和/或如圖1OB所示同時(shí)讀出多比特。
[0083]本發(fā)明的實(shí)施例還可用于成像細(xì)胞或組織粘附，以研究細(xì)胞毒性以及與固態(tài)材料的生物相容性，如SiN膜。
[0084]本發(fā)明的實(shí)施例還可用于通過納米孔、納米縫隙或納米孔陣列，以穿過界面的介質(zhì)中的刺激劑局部地激勵細(xì)胞，并通過膜，利用光學(xué)顯微鏡測量細(xì)胞的反應(yīng)。細(xì)胞對與新生物材料(比如SiN膜)或刺激劑的接觸的反應(yīng)，可以用細(xì)胞膜上生物標(biāo)記的熒光讀出來測量。
[0085]在熒光標(biāo)記的核酸或其他生物聚合物穿越或暫時(shí)嵌入固態(tài)膜中的納米孔的過程中，本發(fā)明的實(shí)施例可以用于以單分子分辨率成像這些核酸或其他生物聚合物。
[0086]本發(fā)明的實(shí)施例還可用于測量連接至在納米孔中易位或暫時(shí)嵌入納米孔的生物聚合物的熒光標(biāo)記的蛋白的化學(xué)計(jì)量比，生物聚合物比如DNA。
[0087]本發(fā)明的實(shí)施例還可用于多色探測，從而可用于探測連接至DNA的生物獨(dú)特的蛋白的空間定位。
[0088]本發(fā)明的實(shí)施例還可用于通過納米孔進(jìn)行DNA測序，以及高通量藥物篩選。
[0089]可以理解，可以根據(jù)應(yīng)用，通過改變光束直徑和/或入射激光束的形狀來改變TIR照明場的尺寸。
[0090]在一個實(shí)施例中，如圖17所示，物鏡236a可被置于cis腔208之上，而非trans腔204之下。物鏡236a可用于成像。在該設(shè)置中，可利用透鏡236b而非物鏡236a把激光束242聚焦于膜224。如以上結(jié)合圖3的描述，由于浸鏡油238和蓋玻片240的折射率匹配，來自激光器(通過透鏡236b)的光242反射進(jìn)入介質(zhì)I 216。在膜224處，由于兩液體212和216的折射率不匹配，光發(fā)生全內(nèi)反射246。在較稀的介質(zhì)即介質(zhì)I 216內(nèi)產(chǎn)生隱失波246，其具有指數(shù)衰減的強(qiáng)度，可激勵膜224表面的熒光團(tuán)(通常，激發(fā)光的“趨膚”深度為數(shù)十納米)。由被激勵的熒光團(tuán)產(chǎn)生的光可以由置于cis腔208上方的物鏡236a聚焦，并由CCD攝像機(jī)484或光探測器測量。
[0091 ] 例子
[0092]例I
[0093]樣本幾何尺寸
[0094]以標(biāo)準(zhǔn)的光刻法，在通過LPCVD鍍有SiN層的硅晶圓上，制作在中心處具有獨(dú)立的20?50nm厚的氮化硅窗口 [50μπι*50μπι]的硅芯片[5mm*5mm*300ym]。如圖3所示，設(shè)計(jì)了具有兩部分PTEE/CTFE的流體室，以把這些芯片安置于蓋玻片之上，在芯片和蓋玻片之間形成2?ΙΟμπι厚的微通道。微通道即trans腔204充有具有較高折射率的液體(70%甘油[η =1.42])，而cis腔208充有溶于水的樣本溶液緩沖液[η = 1.33]。
[0095]TIRF設(shè)置和光束示意圖
[0096]如圖4所示設(shè)置全內(nèi)反射(TIR)顯微鏡。激光束光斑尺寸被降低至0.7mm，射入市場上可買到的倒置顯微鏡(Olympus IX-71)的定制設(shè)計(jì)的后光埠，并通過外部安裝的200mm焦距透鏡聚焦于60X 1.45NA油浸TIRF物鏡的后焦面。通過沿X軸移動激光光纖耦合器，使得激光點(diǎn)偏離光軸。選擇玻璃的折射率[η= 1.52]、70%甘油的折射率[n = l.42]以及樣本緩沖液的折射率[n=l.33]，使得光反射穿過tans腔內(nèi)的油、蓋玻片以及70%甘油，直至到達(dá)氮化硅膜處的甘油-水界面。在該界面處，TIR模式的臨界角與Snell定律中所描述的玻璃-水界面的相同，
[0097]IlglassS ill ( Qglass ) — IlglyS ill ( Qgly ) — IlwS ill ( 9w)
[0098]其中，n表示玻璃、70%甘油或水的折射率，而Θ表示對應(yīng)界面處的入射角。視野的中心沿光傳播的方向偏移，其取決于高折射率液體層的厚度。在經(jīng)過合適的光學(xué)濾鏡后，用外部透鏡把熒光發(fā)射放大3倍，由同一物鏡收集并成像于可購買獲得的EMCCD攝像機(jī)(AndoriXon BV887)。用供應(yīng)商提供的Andor Solis軟件或定制編寫的軟件來進(jìn)行成像。
[0099]樣本固定
[0100]DNA分子[57bp]購自IDT Tech，在5’端具有生物素共軛，在從5’端起的位置20處具有胺修飾的胸腺嘧啶堿基。用供應(yīng)商的方法，以ATT0647N染料分子[ATTO-tech]標(biāo)記DNA分子。用生物素-鏈霉親和素化學(xué)法把DNA分子固定在氮化硅表面。用新鮮制備的Piranha溶液(在容積比為7: 3的硫磺酸和過氧化氫溶液中清洗15分鐘)清潔表面，再用D1-水充分沖洗。在0.lmg/ml的BSA-生物素中培養(yǎng)表面過夜，用結(jié)合緩沖液[1mM Tris-CL pH8.5 ]沖洗，在
0.lmg/ml的鏈霉親和素中培養(yǎng)30?60分鐘，用結(jié)合緩沖液沖洗，再以生物素標(biāo)記的DNA培養(yǎng)15?30分鐘。接著，表面被安裝在流體室內(nèi)。在蓋玻片和硅芯片之間的trnas微通道內(nèi)充70%甘油，并在cis腔內(nèi)充結(jié)合緩沖液。然后在氮化硅界面處用TIRFM把表面成像。
[0101]結(jié)果
[0102]如圖4所示，氮化硅膜(例如，尺寸為20*40μηι2，厚度為20nm)安裝在蓋玻片上。選擇trans和cis腔內(nèi)的兩種液體分別為甘油70% (ν/ν) (η = 1.42)和水(η = 1.33)。
[0103]如圖5所示，把激勵激光束整形至形成小于膜尺寸的隱失照明場。通過降低光束直徑至0.7_，光斑尺寸小于SiN膜的尺寸。
[0104]進(jìn)入物鏡(η = 1.55)的光傳播經(jīng)過浸鏡油(η = 1.52)、蓋玻片(η = 1.55)、液體2(70%甘油)(η = 1.42)，穿過界面，最終穿過水(η=1.33)。該光束在界面處發(fā)生全內(nèi)反射，該界面把甘油和水分開。
[0105]為了校準(zhǔn)激勵場的幾何尺寸，在膜的cis側(cè)吸收20nm的TMR珠，并在TIRF模式下成像。通過沿X和Y軸移動這些TMR珠，以及利用成像光學(xué)組件的放大因子，計(jì)算獲得隱失照明場大約為10*20μηι2。
[0106]在該例子中，用生物素-鏈霉親和素化學(xué)(即方法和材料)，把在3’生物素化并在5’以ΑΤΤ0647Ν標(biāo)記的單個的DNA分子固定在氮化硅表面的cis側(cè)。
[0107]例2
[0108]TIRF 設(shè)置
[0109]在實(shí)驗(yàn)中，包括獨(dú)立的SiN膜(20*20μπι2)1124的硅芯片1128被用作界面，其中，該SiN膜具有納米孔600。該硅芯片1128被安放在蓋玻片1140上，而該蓋玻片1140被安放在定制的三氟氯乙烯(CTFE聚合物)流體室1138上，以產(chǎn)生如圖11所示的微流體trans腔1100。該流體室1138包括保持硅芯片1128的嵌入件1138a和外細(xì)胞1138b，以形成所述流體腔。快速硬化的聚二甲硅氧烷(PDMS)薄層被用于把硅芯片1128和CTFE嵌入件1138a粘合，以及把蓋玻片1140和外細(xì)胞1138b粘合。具有嵌入件1138a的流體腔是cis腔，而硅芯片1128和蓋玻片1140之間的空間是trans腔。利用輸入-輸出流通道在trans腔內(nèi)充折射率緩沖液1112。為了進(jìn)行電測量，在流通道的側(cè)開口內(nèi)提供trans電極1140a，cis電極1140b被浸入嵌入件(均為Ag/AgCl) 1116內(nèi)的緩沖液。如圖1IA所示，納米孔600用于把流體室1100與倒置顯微鏡1136對齊，以進(jìn)行光學(xué)成像和測量。
[0110]Cis腔內(nèi)使用的緩沖液nw?1.33(水緩沖液，IM KCl和1mM tris，pH 8.5)和trans腔內(nèi)使用的緩沖液(具有較高折射率nCs的水性緩沖液)的折射率小于玻璃的折射率ng= 1.5(1^〈1^〈?)。更具體的，含有71 CsCl和1mM tris的pH 8.5的鹽緩沖液(“Cs7M”，n= I.4)被用作cis腔內(nèi)的緩沖液。
[0111]如圖1lB所示，以小于玻璃/trans腔界面的臨界反射角但稍大于trans/cis臨界角的角度Gg從蓋玻片側(cè)引入平行光束，以在SiN膜處產(chǎn)生TIR激勵。用大數(shù)值孔徑(NA)的物鏡(Olympus 60X/1.45)來實(shí)現(xiàn)TIR，通過把入射激光束聚焦在其后焦面(d)上的軸外點(diǎn)上，從而控制入射角Qg JIR激勵區(qū)域的平面位置被位移距離d = h*tan(0Cs)，其中，h是trans腔的高度。
[0112]用長焦距的消色差雙合透鏡(200mm)整形入射激光束的寬度，使得SiN膜上被照明的面積大約為10*2(^1112。通過單模保偏光纖把64011111激光器(20111￥)(丨？1612000，？0丨1^-Source，英國)耦合至系統(tǒng)，產(chǎn)生直徑為0.7_的準(zhǔn)直高斯激光束。這樣的高質(zhì)量光束保證了物鏡入口處的緊聚焦點(diǎn)，從而降低不希望的散射。用普通工藝在膜表面的cis側(cè)用鏈霉親和素涂層。每一個均標(biāo)記有單個的ATT0647N熒光團(tuán)的短的生物素化的DNA寡核苷酸被固定在膜表面，并通過把熒光投射在工作在最大EM增益和1ms積分下的電子倍增CCD攝像機(jī)上進(jìn)行成像。電子倍增電荷親合器件(EMCCD)攝像機(jī)(Andor，iXon DU-860)被用于記錄來自膜表面的熒光圖像。圖12展示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的，在TIRF下成像的，固定在膜表面的單個的分子的三個典型的圖像。如圖12所示，以高對比度分辨了單個的熒光團(tuán)，從而無需進(jìn)一步的圖像處理。
[0113]隨著入射角的提高，TIR的臨界角導(dǎo)致(I)在膜的cis側(cè)觀察到的激光的突然消失，
(2)出現(xiàn)移位的TIR激光束，用顯微鏡的目鏡在物鏡的后焦面上成像，以及(3)背景強(qiáng)度的突然降低，這為單個的分子成像提高了信號/背景比。在落射光照明下(從樣本的一側(cè)照明和探測)，實(shí)現(xiàn)了固定在SiN膜上的單個的熒光團(tuán)的圖像的信號/背景比的多2倍的提高。
[0114]光和電信號的同時(shí)探測
[0115]為同時(shí)探測光和電信號設(shè)計(jì)了硬件(如兼容微軟Windows或Linux的個人計(jì)算機(jī))和LABVIEW軟件的組合。圖13示意性地展示了獲取硬件。Axopath 2008放大器1386(Molecular Devices公司，Sunnyvale，加利福尼亞州，美國)通過探頭1388連接至Ag/AgCl電極，以放大穿過納米孔的離子電流信號。用外部四極巴特沃斯濾波器1390在50KHz處對離子電流信號進(jìn)行低通濾波，并輸入PC內(nèi)的多功能數(shù)據(jù)采集卡1392，該P(yáng)C通過數(shù)據(jù)采集卡1394(Andor iXon采集卡)從CCD攝像機(jī)接收圖像數(shù)據(jù)。該多功能數(shù)據(jù)采集DAQ卡1392(Nat1nal Instruments，PCI_6154)在16比特模數(shù)轉(zhuǎn)換分辨率下獲取離子電流信號。來自EM-CCD攝像機(jī)1384的“觸發(fā)”脈沖(表示每一曝光開始的TTL脈沖)觸發(fā)離子電流采集，并用于在計(jì)數(shù)卡(Nat1nal Instruments，PCI_6602)上產(chǎn)生精確的時(shí)間戳。利用具有250KHz時(shí)鐘頻率的RTSI總線在內(nèi)部使計(jì)數(shù)卡與DAQ卡同步。因此，組合的數(shù)據(jù)流包括每一 CCD幀開始時(shí)的唯一時(shí)間戳，其與離子電流采樣同步。當(dāng)通過離子電流的下降探測到易位事件，軟件1396在計(jì)數(shù)信息中搜索相應(yīng)的幀號，并存儲對應(yīng)該幀號的實(shí)際圖像。攝像機(jī)的幀速率被設(shè)置為大約IKHz (觸發(fā)脈沖頻率)。
[0116]圖14A?C展示了電和光信號的同步。由信號發(fā)生器產(chǎn)生的毫秒長的電子脈沖被電耦合至所述放大器探頭。這些電流脈沖的形狀和時(shí)間量程與納米孔信號相似。用同樣的信號開/關(guān)調(diào)制激勵激光器，提供同步的光源和電子脈沖。為了進(jìn)行同步測試，熒光珠被固定于所述膜上，并用以上描述的攝像機(jī)成像。
[0117]在DNA通過納米孔易位的過程中，組合這兩種模式來測量同步的光和電信號。首先在所述膜上確定孔的位置。來自孔的熒光信號在位置上是穩(wěn)定的，并且與所述電信號同步點(diǎn)亮。這樣，對應(yīng)孔位置的像素隨時(shí)間累積最高的熒光強(qiáng)度，這些圖像的總和在對應(yīng)該孔在CCD上的位置處展示了一峰值。一旦確定了該孔的位置，來自對應(yīng)該孔的像素的強(qiáng)度被用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
[0118]例3
[0119]實(shí)施光和電信號的同時(shí)測量，以探測穿過4nm孔的以熒光團(tuán)標(biāo)記的dsDNA。在該實(shí)驗(yàn)中，樣本濃度為0.1nM?0.2nM。圖15A?15B示意性地展示了孔的幾何尺寸以及大約為4nm的孔的例子的TEM照片。在與胺基反應(yīng)性染料共軛之前的酶聚合鏈反應(yīng)(PCR)過程中，采用與低濃度胺基修飾的胸腺嘧啶堿基結(jié)合的以Alexa647熒光團(tuán)標(biāo)記的421bp片段(DNA-A1647)。
[0120]如圖16A?16B所示，展示了當(dāng)在孔的cis側(cè)加了 DNA-A1647分子后，九個有代表性的離子電流及其對應(yīng)的熒光強(qiáng)度(200mV偏壓產(chǎn)生4nA的開孔電流;在最大EM增益下，以Ims積分獲取圖像)。按以上描述的方法確定孔的位置。所展示的熒光強(qiáng)度是從CCD上以納米孔為中心的3*3像素區(qū)域提取獲得?？梢岳斫?，電流和光學(xué)數(shù)據(jù)的同步采集有助于為每一事件定義內(nèi)部背景閾值。電事件之前大約5ms時(shí)，孔位置處的強(qiáng)度被作為該事件的背景值。只有其中孔位置處的強(qiáng)度比對應(yīng)的背景高出至少一個標(biāo)準(zhǔn)偏差的光事件才被包括在分析中，以保證該事件具有有意義的背景閾值，以消除亂真信號。
[0121]可以理解的，以上詳細(xì)描述和后續(xù)的例子只是為了說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。對于業(yè)界的技術(shù)人員而言，在不超出本發(fā)明的精神和范圍的前提下，很容易對所披露的實(shí)施例進(jìn)行各種改動和修改。另外，出于描述和披露的目的，所有指出的專利、專利申請以及發(fā)表的內(nèi)容被明確地并入本申請，比如，這些發(fā)表中所描述的方法學(xué)可以被用于本發(fā)明。這些發(fā)表在本申請的申請日之前被提供。但這不應(yīng)被理解為承認(rèn)由于先發(fā)明或其他原因使得發(fā)明人對這些披露沒有權(quán)利。有關(guān)該日期的聲明以及有關(guān)這些文件的內(nèi)容的描述是基于
【申請人】能夠獲得的信息，并不構(gòu)成對于該日期或這些文件的內(nèi)容的修改的承認(rèn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于把單個的DNA分子成像的光學(xué)顯微工具，包括: 流體室，包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態(tài)膜，位于所述固態(tài)膜一側(cè)的第一流體腔，所述第一流體腔內(nèi)的具有第一折射率的第一液體，位于所述膜的另一側(cè)的第二流體腔，以及所述第二流體腔內(nèi)的具有第二折射率的第二液體，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率； 蓋玻片，所述流體室安置于該蓋玻片上，使得該蓋玻片形成所述第一流體腔的底面； 物鏡； 所述TIRF物鏡和所述蓋玻片之間的浸鏡油； 光源，被配制成把光導(dǎo)向所述物鏡，所述物鏡被配置成把所述光聚焦，使得產(chǎn)生小于所述固態(tài)膜覆蓋的窗口的隱失照明場；以及 成像探測器，探測位于所述固態(tài)膜的單個的DNA分子所發(fā)射的光。2.一種用于把單個的生物分子成像的光學(xué)顯微工具，包括: 在固態(tài)膜處產(chǎn)生隱失照明場的裝置，該固態(tài)膜位于具有不同折射率的第一和第二液體之間；以及探測由光學(xué)探測標(biāo)記發(fā)出的光，該光學(xué)探測標(biāo)記連接至位于固態(tài)膜處的單個的生物分子。3.如權(quán)利要求2所述的光學(xué)顯微工具，其中，所述單個的生物分子包括DNA分子。4.如權(quán)利要求2所述的光學(xué)顯微工具，其中，所述在固態(tài)膜處產(chǎn)生隱失照明場的裝置包括激勵激光器和物鏡。5.如權(quán)利要求2所述的光學(xué)顯微工具，其還包括使至少一個所述單個的生物分子穿過所述固態(tài)膜上的納米孔的裝置。6.一種把單個的生物分子成像的方法，包括: 在固態(tài)膜處產(chǎn)生隱失照明場，該固態(tài)膜位于具有不同折射率的第一和第二液體之間；以及 探測位于所述固態(tài)膜處的所述單個的生物分子所連接的光學(xué)探測標(biāo)記所發(fā)出的光。7.如權(quán)利要求2的光學(xué)顯微工具或權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述硅晶圓包括窗口，而所述氮化硅層覆蓋該窗口。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其還包括把所述單個的生物分子固定在所述固態(tài)膜上。9.如權(quán)利要求6所述的方法，其還包括使至少一個所述單個的生物分子穿過所述固態(tài)膜上的納米孔。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述至少一個單個的生物分子是DNA分子，所述方法還包括: 把所述DNA分子轉(zhuǎn)化成DDP; 把所述DDP與帶有所述光學(xué)探測標(biāo)記的代表核苷酸A、T、U、C或G的序列進(jìn)行雜交； 電泳驅(qū)動至少一個所述生物分子穿過所述納米孔。11.一種光學(xué)顯微工具，包括: 流體室，包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態(tài)膜，位于該固態(tài)膜一側(cè)的第一流體腔，該第一流體腔內(nèi)的具有第一折射率的第一液體，位于所述固態(tài)膜的另一側(cè)的第二流體腔，以及該第二流體腔內(nèi)的具有第二折射率的第二流體，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率； 蓋玻片，所述流體室安置于該蓋玻片上，使得該蓋玻片形成所述第一流體腔的底面； 聚焦透鏡； 光源，被配置成把光導(dǎo)向所述聚焦透鏡，該透鏡被配置成聚焦所述光，使得產(chǎn)生的隱失照明場小于所述固態(tài)膜覆蓋的所述窗口； 物鏡，位于所述第二流體腔上方，并被配置成聚焦由所述固態(tài)膜處的光學(xué)生物標(biāo)記所發(fā)射的光； 以及 成像探測器，探測由所述光學(xué)生物標(biāo)記發(fā)射的光。12.如權(quán)利要求1、2或11所述的光學(xué)顯微工具，其中，所述光源包括激勵激光束。13.如權(quán)利要求1、2或11所述的光學(xué)顯微工具，其中，采用生物素-鏈霉親和素化學(xué)法，把連接至所述光學(xué)生物標(biāo)記的單個的DNA分子固定在所述固態(tài)膜上。14.如權(quán)利要求1、2或11所述的光學(xué)顯微工具，其中，光學(xué)生物標(biāo)記連接至單個的DNA分子。15.如權(quán)利要求1、2或11所述的光學(xué)顯微工具，其中，所述固態(tài)膜包括至少一個納米縫隙。16.如權(quán)利要求11所述的光學(xué)顯微工具，其還包括第一和第二電極，被配置成施加跨越第一液體和第二液體的電勢，以驅(qū)動連接至所述光學(xué)生物標(biāo)記的待成像的生物分子穿過所述納米孔。
【文檔編號】G02B21/16GK105928910SQ201610204864
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2010年3月26日
【發(fā)明人】G·V·索尼, A·梅勒
【申請人】波士頓大學(xué)董事會