利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和抗生素效價變化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于近紅外光譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用近紅外光譜同時測定微生物 發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中的多種營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的檢測發(fā)酵液中多種營養(yǎng)成分含量變化和抗生素效價變化的方法需要根據(jù) 不同的成分進(jìn)行不同的預(yù)處理，使用不同的儀器進(jìn)行檢測，如檢測pH值需要pH測定儀，檢測 總糖需要測糖儀，檢測氨基氮需要使用甲醛進(jìn)行反應(yīng)并用氫氧化鈉進(jìn)行滴定，檢測抗生素 效價需要經(jīng)過濾、加酸、煮沸、定容等再用分光光度計測定等等。現(xiàn)有的檢測方法處理繁瑣， 耗費(fèi)大量人力、物力和時間，而且使用大量化學(xué)試劑，對環(huán)境造成一定的污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用近紅外光譜同時測定微生物發(fā) 酵產(chǎn)抗生素過程中的多種營養(yǎng)成分和抗生素效價變化的方法。該方法可以快速反饋和了解 發(fā)酵情況，及時進(jìn)行營養(yǎng)補(bǔ)充和工藝控制，并對抗生素效價的變化情況進(jìn)行監(jiān)控，且整個 檢測過程高效、節(jié)約、無污染。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和抗生素效價變 化的方法，其包括如下步驟： 1) 在微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中的不同時間點(diǎn)進(jìn)行取樣； 2) 采用漫反射方式獲取每個樣品的近紅外光譜，同時測定每個樣品的理化指標(biāo)，獲得 理化檢測數(shù)據(jù);所述理化指標(biāo)包括各營養(yǎng)成分的含量和抗生素效價； 3) 對采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘 法計算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型，利用該發(fā)酵 液模型實現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的測定。
[0005] 具體的，步驟2)中的營養(yǎng)成分包括總糖、氨基氮和氨基酸。
[0006] 進(jìn)一步，步驟3)具體為:利用計算機(jī)軟件和化學(xué)計量學(xué)方法對采集到的近紅外光 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理(MSC)、一級導(dǎo)數(shù)預(yù)處理、平滑預(yù)處理或矢量歸一預(yù)處理， 并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS)計算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測數(shù) 據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后通過交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR)、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差 (SECV)兩個指標(biāo)的評價，選擇交叉驗證相關(guān)系數(shù)相對較大、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差相對較小的 模型確定為最終發(fā)酵液模型，利用該最終發(fā)酵液模型實現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中營養(yǎng) 成分含量和抗生素效價變化的測定。在實際生產(chǎn)過程中，最終發(fā)酵液模型可預(yù)先經(jīng)理化指 標(biāo)在線檢測進(jìn)行驗證后，即可投入使用。
[0007] 主成分分析法(PCA)利用降維的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)，將光譜 中的有效信息提取出來。不同周期抗生素發(fā)酵液由于原輔料的使用會有一些顆粒物，而MSC 對光譜的處理能消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對近紅外漫反射光的影響，使 光譜的差異更能代表樣品含量變化的差異。
[0008] 本發(fā)明利用光柵型近紅外光譜技術(shù)對不同發(fā)酵周期的抗生素（包含有金霉素、土 霉素、新霉素等發(fā)酵型抗生素)發(fā)酵液進(jìn)行采集光譜，同時對每一個采集的樣品進(jìn)行化學(xué)方 法檢測，得到不同營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的理化數(shù)據(jù)，將采集的近紅外光譜和理 化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合建立模型。經(jīng)過驗證，模型適用于不同周期抗生素發(fā)酵液中營養(yǎng)成分含量 和抗生素效價變化的檢測，短時間內(nèi)可同時檢測多種指標(biāo)的含量，并可進(jìn)行在線控制。
[0009] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明檢測方法的有益效果： 本發(fā)明提供了一種利用近紅外光譜技術(shù)同時測定微生物發(fā)酵液中多種營養(yǎng)成分和抗 生素含量變化的方法，以通過監(jiān)控發(fā)酵過程中的營養(yǎng)成分變化和抗生素含量變化來及時補(bǔ) 充營養(yǎng)成分和控制發(fā)酵工藝。使用該測定方法時不需要對發(fā)酵液進(jìn)行任何處理，不需使用 任何化學(xué)試劑，不對環(huán)境造成任何污染，且能夠減少人力勞動，節(jié)約時間和成本。
【附圖說明】
[0010]圖1為不同周期金霉素發(fā)酵液的近紅外光譜數(shù)據(jù)； 圖2為品管部對金霉素發(fā)酵液進(jìn)行理化檢測的部分?jǐn)?shù)據(jù)，圖中TotalSuger為總糖，AN 為氨基氮，CTC為抗生素效價； 圖3為圖1采用MSC預(yù)處理后的近紅外光譜數(shù)據(jù)； 圖4為采用最終金霉素發(fā)酵液模型進(jìn)行檢測的數(shù)據(jù)和品管部理化檢測數(shù)據(jù)的對比驗 證，圖中，QC代表品管檢測數(shù)據(jù)，NIR為模型檢測數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于此。
[0012] 實施例1 一種利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和抗生素效價變 化的方法，其包括如下步驟： 1) 在微生物(包括金霉素、新霉素、土霉素等)發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中的不同時間點(diǎn)進(jìn)行 取樣； 2) 利用F0SS公司光柵型近紅外分析儀采用漫反射方式獲取每個樣品的近紅外光譜(見 圖1)，同時通過本公司品管部(QC)測定每一個樣品的理化指標(biāo)，獲得理化檢測數(shù)據(jù)(見圖 2);所述理化指標(biāo)包括各營養(yǎng)成分(如總糖、氨基氮和氨基酸)的含量和抗生素效價;得到不 同營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化數(shù)據(jù)。近紅外光譜的波長范圍選自400-2500nm。
[0013] 品管部理化檢測方法如下： 總糖測定：用碘量法。取樣品lml，置于250mL碘量瓶中，加蒸餾水30mL使之溶解。加入 0.05 mol/1 KI溶液25.00mL，在不斷搖動下緩慢滴加0.1mol/l NaOH溶液40ml至溶液呈淡 黃色。密塞、暗置10分鐘。加0.5 mol/1 H2S〇4溶液6mL，搖勻，用Na2S2〇3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mol/l) 滴定。接近終點(diǎn)時加入2ml淀粉指示液，繼續(xù)滴定到溶液藍(lán)色消失，即達(dá)終點(diǎn)。同時做空白試 驗。
[0014] 氨基氮測定：取2ml樣品于三角瓶內(nèi)，用蒸餾水定至10ml。然后向瓶中加入甲基紅 指示劑2滴，lmol/1 H2S〇4加1-2滴，調(diào)節(jié)溶液至紅色，靜置5分鐘，再用0 · 5mol/l的NaOH標(biāo)準(zhǔn) 溶液調(diào)節(jié)溶液至橙色，加12 %中性甲醛10 m 1，搖勻靜置10 m i η，加1 %酚酞指示劑5滴，用 0. lmol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液顯微紅色為終點(diǎn)。
[0015] 氨基氮(呢/1001111)=0\￥\14.01\100/2.5((：:恥0田農(nóng)度，￥:恥0!1滴定體積）。
[0016] 氨基酸測定:采用氨基酸分析儀進(jìn)行測定，具體略。
[0017] 抗生素效價測定:采用分光光度計法進(jìn)行測定，具體略。
[0018] 3)建立發(fā)酵液模型：具體為:利用計算機(jī)軟件和化學(xué)計量學(xué)方法對采集到的近紅 外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理(MSC，見圖3)，并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二 乘法(PLS)計算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后 通過交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR)、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差（SECV)兩個指標(biāo)的評價，選擇交叉驗證 相關(guān)系數(shù)相對較大、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差相對較小的模型確定為最終發(fā)酵液模型(見表1 )，利 用該最終發(fā)酵液模型實現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的 測定。
[0019] 表1 =種牛物發(fā)酵液的沂紅外樽型評價指標(biāo)
[0020] 以金霉素為例，金霉素發(fā)酵液是由本公司保藏的金色鏈霉菌接種于由玉米淀粉等 常規(guī)原料配制成的培養(yǎng)基中，按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)在一定的溫度、濕度、PH、轉(zhuǎn)速等工藝控 制下得到的金霉素發(fā)酵液。
[0021] 圖4為采用最終金霉素發(fā)酵液模型進(jìn)行檢測的數(shù)據(jù)和品管部理化檢測數(shù)據(jù)的對比 驗證。從圖4中可以看出：不同周期金霉素發(fā)酵液效價指標(biāo)利用兩種方法（品管常規(guī)方法QC 和近紅外模型預(yù)測方法NIR)檢測，兩種方法得到的數(shù)據(jù)相當(dāng)一致。經(jīng)過驗證可知:上述建立 的最終發(fā)酵液模型適用于不同周期微生物發(fā)酵液中各營養(yǎng)成分含量和抗生素效價效價的 檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和抗生素效價 變化的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 在微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中的不同時間點(diǎn)進(jìn)行取樣； 2) 采用漫反射方式獲取每個樣品的近紅外光譜，同時測定每個樣品的理化指標(biāo)，獲得 理化檢測數(shù)據(jù);所述理化指標(biāo)包括各營養(yǎng)成分的含量和抗生素效價； 3) 對采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法和偏最小二乘法計算 得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型，利用該發(fā)酵液模型 實現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中營養(yǎng)成分和抗生素效價變化的測定。2. 如權(quán)利要求1所述利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和 抗生素效價變化的方法，其特征在于，步驟2)中的營養(yǎng)成分包括總糖、氨基氮和氨基酸。3. 如權(quán)利要求1所述利用近紅外光譜測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中多種營養(yǎng)成分和 抗生素效價變化的方法，其特征在于，步驟3)具體為:利用計算機(jī)軟件和化學(xué)計量學(xué)方法對 采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理、一級導(dǎo)數(shù)預(yù)處理、平滑預(yù)處理或矢量 歸一預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法和偏最小二乘法計算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測數(shù) 據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后通過交叉驗證相關(guān)系數(shù)、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差兩個指 標(biāo)的評價，選擇交叉驗證相關(guān)系數(shù)相對較大、交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)方差相對較小的模型確定為最 終發(fā)酵液模型，利用該最終發(fā)酵液模型實現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中營養(yǎng)成分和抗生素 效價變化的測定。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用近紅外光譜同時測定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過程中的多種營養(yǎng)成分和抗生素效價變化的方法，具體為：利用近紅外光譜技術(shù)對不同發(fā)酵周期的抗生素（包含有金霉素、土霉素、新霉素等發(fā)酵型抗生素）發(fā)酵液進(jìn)行采集光譜，同時對每一個采集的樣品進(jìn)行化學(xué)方法檢測，得到不同營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的理化數(shù)據(jù)，將采集的近紅外光譜和理化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合建立模型。經(jīng)過驗證，該模型適用于不同周期抗生素發(fā)酵液中營養(yǎng)成分含量和抗生素效價變化的檢測。該方法可以快速反饋和了解發(fā)酵情況，及時進(jìn)行營養(yǎng)補(bǔ)充和工藝控制，并對抗生素效價的變化情況進(jìn)行監(jiān)控，且整個檢測過程高效、節(jié)約、無污染。
【IPC分類】G01N21/3577, G01N21/359
【公開號】CN105548064
【申請?zhí)枴緾N201510928644
【發(fā)明人】高惠姣, 陳浩然, 李書至, 李冰, 常坤, 張歡
【申請人】駐馬店華中正大有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月15日