一步放大法熒光檢測(cè)汞離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一步放大法熒光檢測(cè)汞離子的方法，屬于檢測(cè)用熒光技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 汞及其化合物對(duì)人體健康存在多種危害，若存在于天然水體中，則會(huì)對(duì)大范圍的 人群造成威脅。它能夠在生物體中積累，通過(guò)生物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，人體內(nèi)積累的微量汞， 人體內(nèi)積累的微量汞無(wú)法通過(guò)自身代謝進(jìn)行排泄，將直接導(dǎo)致心臟、肝、甲狀腺疾病，引起 神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，慢性汞中毒，甚至引發(fā)惡性腫瘤的形成。
[0003] 溶解態(tài)的汞離子往往具有較高的化學(xué)活性，是排入天然水體中汞污染物的主要存 在形式，其化合物具有較高的水溶性，也是各種汞形態(tài)轉(zhuǎn)化的樞紐。因此，確立一個(gè)靈敏的 高選擇性的方法診斷和在水樣分析中檢測(cè)汞離子的含量是至關(guān)重要的。檢測(cè)汞離子的方法 主要有分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法等，然后這些方法存在儀器昂貴、分 析周期長(zhǎng)、樣品預(yù)處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，難以適應(yīng)汞離子檢測(cè)的方便、快捷、靈敏度等方面的需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決以上問(wèn)題，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為汞離子的特異性檢測(cè)提供了有利條 件。本發(fā)明基于汞離子可以穩(wěn)定DNA中T-T錯(cuò)配的原理實(shí)現(xiàn)汞離子的檢測(cè)，基本原理是：汞 離子的存在可以穩(wěn)定ss-DNA序列中的T-T錯(cuò)配，使ss-DNA形成相對(duì)穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。而 汞離子不存在則無(wú)法形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的： 本發(fā)明中一共用到三條鏈：兩條probe鏈：probel和probe2, 一條發(fā)夾鏈：HAP。兩條 probe鏈的一端分別修飾有poly-T結(jié)構(gòu)，用來(lái)與目標(biāo)物汞離子結(jié)合；發(fā)夾上設(shè)置一個(gè)酶切 位點(diǎn)，發(fā)夾兩端修飾有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。
[0006] Probel :5, -CTT CTT CTT CTT CTTGAT GTT GA-3'（SEQ ID NO:1); Probe2 :5' - GCT GAG GA TTG TTG TTG TTG TTG-3' (SEQ ID NO:2); HAP :5' -GGG CCT CAT TTT TTT TTC AAC ATC CCT CAG CGC TGA GGC CC-3' （SEQ ID N0:3)〇
[0007] 其中Probel與HAPl中畫(huà)橫線(xiàn)部分的T之間可特異性結(jié)合汞離子，從而形成 " T-Hg2 +-T "結(jié)構(gòu)。HAP的3 '端修飾FAM發(fā)光基團(tuán)，5 '端修飾Dabcy 1猝滅基團(tuán)，沒(méi)有目標(biāo)物 汞離子時(shí)，發(fā)夾未被打開(kāi)，猝滅基團(tuán)Dabcyl將發(fā)光基團(tuán)FAM猝滅；目標(biāo)物存在時(shí)，發(fā)夾被打 開(kāi)，發(fā)光基團(tuán)FAM發(fā)光，可用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。本文中用到了一種酶：Nt. BbvCI。這是 一種限制性?xún)?nèi)切酶，它識(shí)別雙鏈，但只在一條鏈上進(jìn)行切割。對(duì)單鏈沒(méi)有切割。
[0008] 本發(fā)明中汞離子的檢測(cè)是用熒光儀實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)一步循環(huán)的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放 大，從而實(shí)現(xiàn)汞離子的高靈敏快速檢測(cè)，并具有良好的特異性。
[0009] 均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：在有目標(biāo)物存在的情況下，Probel與Probe2中T堿 基之間會(huì)由目標(biāo)物連接形成"T-Hg2+-T"結(jié)構(gòu)，從而使Probel與Probe2的poly-T部分固 定到一起，剩余的部分序列由于拉近了距離，可以與HAP作用形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。此時(shí)在內(nèi)切 酶Nt. BbvCI的作用下，將鏈按照酶切位點(diǎn)切開(kāi)掉下，發(fā)夾打開(kāi)，猝滅基團(tuán)與發(fā)光基團(tuán)分離， 產(chǎn)生熒光。同時(shí)釋放游離態(tài)的目標(biāo)物，可再次被利用，從而實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大，即目標(biāo)物誘導(dǎo)的 Probel循環(huán)放大。
[0010] 在均相反應(yīng)中，循環(huán)放大的反應(yīng)條件為37°C，反應(yīng)時(shí)間是2h。
[0011] 所述的制備方法：Probel :Probe2 :HAP物質(zhì)量比為1 :1 :50。
[0012] 所述的制備方法均相部分，是通過(guò)以下步驟得到的： (1)在 200ul 離心管中依次放入 8ulH20，Probel 鏈 2ul(0. 5uM)，Probe2 鏈 2ul(0. 5uM)， HAP 鏈 5ul (IOuM)，Nt. BbvCI 的 buffer 2ul，Nt. BbvCI 酶 IOOUml，制成 20ul 均相體系。在 振蕩器上振蕩30s，混合均勻。
[0013] (2)然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h。
[0014] 所述的制備方法檢測(cè)方法，是通過(guò)以下步驟得到的： (1) 向混合液中加入180ulH20溶液，混合均勻，形成200ul體系，將其全部置入熒光杯 中，放入熒光儀； (2) 設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為500nm-630nm，入射狹縫5nm，出射狹縫寬 度為3nm ;開(kāi)始測(cè)試其熒光強(qiáng)度。
[0015] 本發(fā)明的工作原理： 本發(fā)明基于汞離子可以穩(wěn)定DNA中T-T錯(cuò)配的原理實(shí)現(xiàn)汞離子的檢測(cè)，基本原理是：汞 離子的存在可以穩(wěn)定ss-DNA序列中的T-T錯(cuò)配，使ss-DNA形成相對(duì)穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。而 汞離子不存在則無(wú)法形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0016] 本發(fā)明中一共用到三條鏈：兩條probe鏈：probe 1和probe2, 一條發(fā)夾鏈：HAP。 兩條probe鏈的一端分別修飾有poly-T結(jié)構(gòu)，用來(lái)與目標(biāo)物汞離子結(jié)合；發(fā)夾上設(shè)置一 個(gè)酶切位點(diǎn)，發(fā)夾兩端修飾有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，在有汞離子的存在下，兩條probe鏈的 poly-T部分與萊離子形成穩(wěn)定的"T-Hg2+-T"結(jié)構(gòu)，probe鏈的剩余部分可以與HAP鏈互補(bǔ) 配對(duì)，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。此時(shí)，在內(nèi)切酶的作用下，發(fā)夾沿著酶切位點(diǎn)被酶切成兩條鏈，因此 發(fā)夾被打開(kāi)，焚光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生焚光信號(hào)。在沒(méi)有目標(biāo)物的時(shí)候，HAP鏈 呈現(xiàn)發(fā)夾狀，由于猝滅基團(tuán)靠近熒光基團(tuán)，所以不產(chǎn)生熒光。同時(shí)，由于發(fā)夾被切斷，原本穩(wěn) 定的結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，攜帶汞離子的兩條probe鏈游離出來(lái)，再次結(jié)合HAP，因此循環(huán)產(chǎn)生 熒光信號(hào)。目標(biāo)物汞離子越多，則結(jié)合的Probe鏈越多，結(jié)合的HAP也越多，產(chǎn)生的熒光信 號(hào)也就越強(qiáng)，循環(huán)可以放大信號(hào)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果： 1、 利用了核酸適配體的特異型識(shí)別，利用汞離子的適體作為識(shí)別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物 汞離子的高特異性檢測(cè)； 2、 利用內(nèi)切酶的切割作用，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，起到了信號(hào)放大的作用，實(shí)現(xiàn)了 對(duì)目標(biāo)物的尚敏檢測(cè)，提尚了檢測(cè)的靈敏度； 3、 檢測(cè)原理的主要過(guò)程是在均相中實(shí)現(xiàn)的，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快； 4、 使用熒光檢測(cè)方法的提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快 速，簡(jiǎn)單，靈敏的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為HAP濃度的優(yōu)化曲線(xiàn)； 圖2為反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化曲線(xiàn)； 圖3為內(nèi)切酶濃度的優(yōu)化曲線(xiàn)； 圖4為不同濃度汞離子的熒光強(qiáng)度梯度； 圖5為汞離子濃度其對(duì)數(shù)與熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019] 實(shí)施例1 (1)在 200ul 離心管中依次放入 7ulH20，Probe