免疫膠體金滲濾法定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的方法和試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】免疫膠體金滲濾法定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的方法 和試劑盒
[0001] 本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)和光電檢測(cè)領(lǐng)域，更特別地涉及一種利用免疫膠體金滲濾法 定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的方法及試劑盒。
[0003] 本發(fā)明的【背景技術(shù)】
[0004] 膠體金免疫層析技術(shù)和膠體金免疫滲濾技術(shù)是近代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)史上革命性技術(shù)，基 于這兩種技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品如早孕檢測(cè)試紙條，各種病毒檢測(cè)試紙條，毒品檢測(cè)試紙條等，已 廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。這些試紙條具有快速、簡(jiǎn)易、方便等優(yōu)勢(shì)，使得床邊醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)成 為可能。但這些試紙條最大的缺陷就是只能進(jìn)行定性檢測(cè)而不能定量，因此，這些產(chǎn)品只能 起到初篩的作用。如果能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，則這些產(chǎn)品不僅可以幫助診斷，而且還可以幫助療 效的確定和預(yù)后的判斷（曹丹如，陳悅，劉德琮等，快速檢測(cè)血清HCG的半定量金免疫滲濾 法的建立.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008, 23(1) :8-10 ;邵強(qiáng)，王俊華，雙抗體夾心ELISA法測(cè)定殘余漢遜 酵母菌體蛋白含量的研究.四川動(dòng)物，2008, 27(5) :945-946)。
[0005] C-反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein)是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1、腫瘤壞 死因子刺激肝臟上皮細(xì)胞合成的。由各種原因引起的組織損傷都會(huì)導(dǎo)致血清中C-反應(yīng)蛋 白濃度的升高，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)一系列的全身性反應(yīng)，包括發(fā)熱、免疫反應(yīng)增強(qiáng)等急性時(shí)相反 應(yīng)。C-反應(yīng)蛋白水平的高低與炎癥的出現(xiàn)及其嚴(yán)重程度具有線性相關(guān)性，因而被公認(rèn)為是 最有價(jià)值的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，且它的升高可以提示許多炎癥性疾病的發(fā)生。
[0006] 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的方法有金標(biāo)層析法、金標(biāo)滲濾法、免疫濁度法。參 見(jiàn)例如，張曉慧、李光韜和張卓莉，C-反應(yīng)蛋白與超敏C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)及其臨床意義，中 華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志.2011，01:80-85;楊世峰，尹愛(ài)萍.(：-反應(yīng)蛋白與糖尿病腎病 的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述.2008,03 :118-120 ;韓鋒產(chǎn)，閻小君，侯瑜等.膠體金免疫層析法 檢測(cè)抗幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A抗體.世界華人消化雜志.1999,9(7);鄧艷琴，嚴(yán) 延生，何似等.應(yīng)用快速免疫層析法檢測(cè)恙蟲病特異性IgM、IgG及總抗體.中國(guó)人獸共患 病雜，2003,06 :53-55 ;趙海峰，甘一如.膠體金免疫層析法檢測(cè)小分子物質(zhì).農(nóng)藥，2007， 46(7) :439-446;朱明東，徐衛(wèi)民，洪林娣等.斑點(diǎn)金免疫滲濾法快速診斷布魯桿菌病的研 究.中國(guó)地方病學(xué)雜志，2006, 25(3) :326-327;楊溢，陳其云，楊揚(yáng).免疫比濁法測(cè)定血清 C-反應(yīng)蛋白（C-反應(yīng)蛋白）的評(píng)價(jià).四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2003,03:9-10。
[0007] 南京普朗醫(yī)療使用金標(biāo)層析法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白，其通過(guò)使用配套儀器免疫定量 分析儀FIA8000,可以達(dá)到定量或非定量檢測(cè)人血液中高敏C-反應(yīng)蛋白的目的。該系統(tǒng)的 使用不需要抗凝劑，可以檢測(cè)濃度在〇. 5~64mg/L范圍內(nèi)的血清或者血漿樣品，但是無(wú)法 檢測(cè)全血。另外，其可以儲(chǔ)存10000個(gè)血清樣本的檢測(cè)值。檢測(cè)一個(gè)血清樣本操作過(guò)程需 要的時(shí)間是7分鐘，并且待檢時(shí)間嚴(yán)格控制在7分鐘。當(dāng)濃度< 20mg/L時(shí)CV< 15%，而當(dāng) 濃度 > 20mg/L時(shí)CV彡 20%。
[0008] 芬蘭Orion公司使用免疫比濁法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白。其通過(guò)使用配套儀器 QuikRead/第二代P0CT產(chǎn)品，可以定量測(cè)試血液中的C-反應(yīng)蛋白，但是不能用于低濃度 C-反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)，例如新生兒診斷或心血管疾病危險(xiǎn)分級(jí)。該系統(tǒng)使用EDTA或肝素 作為抗凝劑，可以檢測(cè)濃度在8-160mg/L范圍內(nèi)的全血，但無(wú)法儲(chǔ)存檢測(cè)值。檢測(cè)一個(gè)全血 樣本的操作過(guò)程需要的時(shí)間是4分鐘，并且待檢時(shí)間嚴(yán)格控制在4分鐘。在檢測(cè)8mg/L濃 度時(shí)，CV< 15% (李亞，李忠，何曉明.超敏C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)的臨床應(yīng)用.熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2007,08 :85-86 ;王偉，何瑩，韓起等.超敏C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體制備及其ELISA體系的 初步建立?免疫學(xué)雜志，2013,08:59-63)。
[0009] 挪威Axis-Shield公司使用金標(biāo)滲濾法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白。其通過(guò)使用配套儀器 Nycocard/第二代P0CT產(chǎn)品，可以定量測(cè)試血液中的C-反應(yīng)蛋白，但是不能用于低濃度 C-反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)，例如新生兒診斷或心血管疾病危險(xiǎn)分級(jí)。該系統(tǒng)使用EDTA、肝素 或枸櫞酸鹽作為抗凝劑，可以檢測(cè)濃度在8-250mg/L范圍內(nèi)的全血樣品，但無(wú)法儲(chǔ)存檢測(cè) 值。檢測(cè)一個(gè)全血樣本操作過(guò)程需要的時(shí)間是4分鐘，并且待檢時(shí)間需要嚴(yán)格控制在5分 鐘內(nèi)，其量程范圍內(nèi)的CV< 5% (龍建國(guó)，張會(huì)峰，鄭運(yùn)周等.D-二聚體異常結(jié)果臨床疾病 的調(diào)查分析?醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2010,07 :104-105)。
[0010] 在臨床上，經(jīng)常需要在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)對(duì)大批量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，但免疫膠體金方 法的檢測(cè)時(shí)間上的限制影響了其在臨床環(huán)境中的應(yīng)用，特別是在檢測(cè)人員和設(shè)備都相對(duì)較 少的基層臨床醫(yī)院，這一問(wèn)題顯得更為突出。因此，就需要一種能夠具有滿足臨床檢驗(yàn)需要 的更長(zhǎng)待檢時(shí)間范圍的用于檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的方法。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供了一種利用免疫膠體金滲濾法定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的方 法，其中包括，將待測(cè)樣品、結(jié)合有對(duì)所述抗原性物質(zhì)特異性的第一抗體的膠體金與固定有 對(duì)所述抗原性物質(zhì)特異性的第二抗體的檢測(cè)板反應(yīng)區(qū)相接觸，緊接著將蛋白質(zhì)固定劑與反 應(yīng)區(qū)接觸，隨后通過(guò)光電檢測(cè)裝置檢測(cè)反應(yīng)區(qū)的光信號(hào)來(lái)確定樣品中所述抗原性物質(zhì)的存 在，并將所述抗原性物質(zhì)以量化表達(dá)。
[0013] 本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)固定劑在制備用于檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì)的試劑盒中 的用途。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種利用免疫膠體金滲濾法定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物 質(zhì)的試劑盒，其包含結(jié)合有對(duì)所述抗原性物質(zhì)特異性的第一抗體的膠體金、固定有對(duì)所述 抗原性物質(zhì)特異性的第二抗體的檢測(cè)板反應(yīng)區(qū)和蛋白質(zhì)固定劑。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明的方法可用于定性和定量地檢測(cè)生物樣品中的各種抗原性物質(zhì)，例如現(xiàn)有 技術(shù)中已經(jīng)利用免疫膠體法進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的那些。以下以C-反應(yīng)蛋白為例對(duì)本發(fā) 明的方法以及其他方面進(jìn)行說(shuō)明。
[0017] 本發(fā)明采用免疫膠體金滲濾法，可用于定量檢測(cè)來(lái)自人或動(dòng)物的樣品中的C-反 應(yīng)蛋白。例如用羊抗人多克隆C-反應(yīng)蛋白抗體分別與硝酸纖維素膜和膠體金結(jié)合，因而 當(dāng)檢測(cè)時(shí)，樣品中的C-反應(yīng)蛋白抗原與硝酸纖維素膜上包被、膠體金標(biāo)定的羊抗人多克隆 c-反應(yīng)蛋白抗體結(jié)合，以形成"固相c-反應(yīng)蛋白抗體-c-反應(yīng)蛋白抗原-金標(biāo)記C-反應(yīng) 蛋白抗體"的雙抗體夾心復(fù)合物而凝聚顯色。由于不同樣本中c-反應(yīng)蛋白抗原濃度不一 樣，最終顯色會(huì)隨著C-反應(yīng)蛋白抗原濃度變大而加深，因此通過(guò)配套檢測(cè)設(shè)備可以測(cè)出具 體的C-反應(yīng)蛋白抗原濃度。通過(guò)這一方法，提高了檢測(cè)樣本的靈敏度和量程。
[0018] 另一方面，本發(fā)明利用蛋白質(zhì)固定劑使蛋白質(zhì)的水化層破壞從而導(dǎo)致其理化性質(zhì) 改變和生物活性的喪失。而且，在檢測(cè)板反應(yīng)區(qū)最后加入蛋白質(zhì)固定劑，使其在特定時(shí)間內(nèi) 起到抗體-抗原蛋白反應(yīng)終止固定的作用，使已結(jié)合的c-反應(yīng)蛋白斑點(diǎn)牢牢固定在NC膜 上，從而極大的延長(zhǎng)了C-反應(yīng)蛋白待檢時(shí)間。
[0019] 因此，本發(fā)明提供了一種利用免疫膠體金滲濾法定量檢測(cè)生物樣品中抗原性物質(zhì) 的方法，其中包括，將待測(cè)樣品和結(jié)合有對(duì)所述抗原性物質(zhì)特異性的第一抗體的膠體金與 固定有對(duì)所述抗原性物質(zhì)特異性的第二抗體的檢測(cè)板反應(yīng)區(qū)相接觸，緊接著將蛋白質(zhì)固定 劑與反應(yīng)區(qū)接觸，隨后通過(guò)光電檢測(cè)裝置檢測(cè)反應(yīng)區(qū)的光信號(hào)來(lái)確定樣品中所述抗原性物 質(zhì)的存在和/或其濃度。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一抗體為單克隆抗體。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第二抗體為多克隆抗體或不同于所述第一抗體的單克隆 抗體。
[0022] 或者，所述第一和第二抗體均為針對(duì)所述抗原性物質(zhì)的多克隆抗體。
[0023] 本發(fā)明涉及的蛋白質(zhì)固定劑可以是任何能夠使得蛋白質(zhì)變性并在膠體金免疫檢 測(cè)用的固體載體上固定的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)固定劑為醇類水溶液，其 可以是乙醇水溶液或其他的醇類（如甲醇、丙醇、丁醇等）水溶液；醇類水溶液的濃度可以 為 10-25 % (v/v)，例如，11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 %、19