生成速率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種原位檢測(cè)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中c〇2生成速率的方法，屬于生物 巧光標(biāo)記與細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞作為所有生物體內(nèi)最小的功能和結(jié)構(gòu)單元，其內(nèi)部不停地進(jìn)行著新陳代謝過(guò) 程，而該一過(guò)程又與二氧化碳的循環(huán)密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)二氧化碳的含量在呼吸作用、核酸堿 基對(duì)的形成、血液抑值的平衡、基因復(fù)制、細(xì)胞增殖及癌變等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。 細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器起著獨(dú)一無(wú)二的生理作用，如線粒體行使著呼吸作用、提供能量的中轉(zhuǎn)站， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)運(yùn)輸和貶藏蛋白質(zhì)，高爾基體與細(xì)胞的分泌過(guò)程密切相關(guān)，而溶酶體則作為"消 化車間"分解衰老損傷的細(xì)胞器、吞瞻并殺死侵入細(xì)胞的病毒和病菌等。因此，原位檢測(cè)細(xì) 胞內(nèi)各細(xì)胞器中二氧化碳的生成速率對(duì)細(xì)胞器功能的深入研究、疾病的早期診斷和物種的 進(jìn)化有著十分重要的意義。
[0003] 目前，大多數(shù)文獻(xiàn)已報(bào)道，在氣體混合物中檢測(cè)二氧化碳的含量，如大氣、海洋生 態(tài)系統(tǒng)、天然氣的燃燒等。其中，電化學(xué)和紅外分析方法是兩種探測(cè)二氧化碳的最常見(jiàn)方 法，然而該兩種方法由于對(duì)水較敏感而不適用于潮濕的環(huán)境下，因而更不能用于生物體系 中二氧化碳的檢測(cè)。另外，巧光蛋白、無(wú)機(jī)量子點(diǎn)等作為一種新型的巧光探針近年來(lái)被廣 泛用于活細(xì)胞成像，但由于對(duì)細(xì)胞的高毒性及對(duì)二氧化碳的無(wú)明顯響應(yīng)等問(wèn)題而無(wú)法用于 原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器新陳代謝的過(guò)程。（Cummins, E.P. ;Selfridge，A.C. ;Sporn，P. 比Sznajder, J. I. ;Taylor, C. T. Cell Mol. Life Sci.，2014, 71，831-845. Liu, Y. ;Tang, Y. H. ;Barashkov, N. N. ; Irgibaeva, I. S. ;Lam, J. W. Y. ;Hu,民.民.；Birimzhanova, D. ;Yu, Y.; Tang, B. Z. J. Am. Chem. Soc.，2010，132，13951-13953. Carballal, S. ;Bartesaghi, S.; 民adi，R.Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1840, 768-780. Ali，R. ;Lang，T.; Saleh, S. M. ;Meier, R. J". ;Wolfbeis, 0. S. Anal. Chem.，2011, 83, 2846-2851.加o, C. X.; Ng，S.R. ;Khoo，S.Y. ;Zheng，X.T. ;Chen，P. ;Li，C.M. Acs Nano. ,2012,6, 6944-6951. Waldrop, G. L. ;Holden, H. M. ;Maurice,M. S. Protein Science, 2012, 21，1597-1619. Guais, A. ;Brand, G. ; Jacquot, L. ;Karrer，M. ;Dukan, S. ;Grevillot, G. ;Molina，T. J.; Bonte, J. ;Regnier, M. ;Schwartz, L Qiem. Res. Toxicol.，2011，24, 2061-2070)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種原位檢測(cè)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中c〇2生成 速率的方法，所述方法采用一種含有4, 4'，化咯-1，2, 5-S基）S苯甲酸（2-二甲 氨基）己醋（TPP-TMA巧的巧光探針對(duì)活細(xì)胞各細(xì)胞器的新陳代謝過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，所述巧光 探針用于活細(xì)胞巧光成像的同時(shí)可原位定量檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器二氧化碳的生成速 率，并能有效甄別癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
[0005] 本發(fā)明的目的由W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 一種原位檢測(cè)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中c〇2生成速率的方法，所述方法具體步驟如 下：
[0007] (1)將TPP-TMAE溶解于二甲基亞諷值MSO)中，得到濃度為lXl〇-2mol/L的溶液 a;向溶液a中加入高糖DMEM培養(yǎng)基，得到濃度為1X10可1〇1/1的溶液b;
[0008]所述TPP-TMAE為 4, 4'，化咯-1，2, 5-S基）S苯甲酸（2-二甲氨基）己 醋的簡(jiǎn)寫(xiě)，TPP-TME的結(jié)構(gòu)式如下；
[0009]
[0010] 似將細(xì)胞器染料溶解于；蒸水中，得到濃度為lXl(T5mol/L的溶液C;
[0011] (3)將細(xì)胞傳代至兩組培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)達(dá) 5X105±0. 05X105個(gè)，移除培養(yǎng)基，洗漆；向其中一組培養(yǎng)皿中加入體積為V1的溶液C，并 將所述培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15~30min，移除溶液C，洗漆，加入體積為V2的高糖DMEM 培養(yǎng)基，得到待測(cè)樣品1 ;向另外一組培養(yǎng)皿中加入體積為Vi的溶液C，并將所述培養(yǎng)皿置 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15~30min，移除溶液C，洗漆，加入體積為vi的溶液b，5秒后移除溶液b， 洗漆，加入體積為V2的質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醒溶液，靜置lOmin，洗漆，加入ImL抑= 7. 4的磯酸鹽緩沖液，得到含有失活細(xì)胞的待測(cè)樣品2;
[0012] 其中，所述培養(yǎng)皿為激光共聚焦顯微鏡專用底部帶玻片培養(yǎng)皿，外徑為20mm
[0013] 所述培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境；溫度為37°C、CA的體積分?jǐn)?shù)為5%;-組培養(yǎng)皿為3~5 個(gè)；
[0014] 所述洗漆采用抑=7. 4的磯酸鹽緩沖液，洗漆次數(shù)為2~3次；所述PBS溶液為 pH= 7. 4的磯酸鹽緩沖液的簡(jiǎn)稱；所述Vi:V2為！ ： 10 ;
[0015] (4)向待測(cè)樣品1中加入體積為Vi的溶液b，每間隔Ih測(cè)試一次待測(cè)樣品1中細(xì) 胞內(nèi)各細(xì)胞器的巧光強(qiáng)度，共測(cè)試6~10次；并根據(jù)測(cè)試結(jié)果繪制單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)巧光 強(qiáng)度變化率隨時(shí)間t的變化曲線，得到曲線一；
[0016] 其中，加入溶液b時(shí)，需保持待測(cè)樣品1位置不變；
[0017] 待測(cè)樣品1中單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)巧光強(qiáng)度變化率=(li-IoVl。，I。表示單個(gè)細(xì)胞 細(xì)胞器內(nèi)的初始巧光強(qiáng)度，li表示第i次檢測(cè)時(shí)單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)的巧光強(qiáng)度，i為！~5 的正整數(shù)；
[001引 （5)先測(cè)試出待測(cè)樣品1中細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的初始巧光強(qiáng)度；再分次向待測(cè)樣品2 中注入氣體，測(cè)試每次注入氣體后待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的巧光強(qiáng)度；其中，每 次每個(gè)待測(cè)樣品2中注入氣體的體積為1yL氣體的注入總量為20yL;根據(jù)測(cè)試結(jié)果繪制 待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞通入氣體后單個(gè)細(xì)胞器的巧光強(qiáng)度變化率隨通入氣體體積的變化 曲線，得到曲線二；
[0019] 其中，所述氣體為C〇2與空氣的混合氣體，C〇2與空氣的體積比1:1 ;
[0020] 待測(cè)樣品2中失活單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)巧光強(qiáng)度變化率=(I'k-I'oVi'。，1'。 表示失活單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)的初始巧光強(qiáng)度，I'k表示第k次通入氣體后失活單個(gè)細(xì)胞細(xì) 胞器內(nèi)的巧光強(qiáng)度，k為1~20的正整數(shù)；
[0021] 做根據(jù)步驟（4)、（5)待測(cè)樣品1和待測(cè)樣品2中細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器巧光強(qiáng)度的測(cè) 試結(jié)果計(jì)算單個(gè)細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器新陳代謝過(guò)程中C〇2含量，具體為：
[0022] 當(dāng)曲線一和曲線二中的巧光變化率相同時(shí)，分別得到曲線一中對(duì)應(yīng)的時(shí)間t和曲 線二中對(duì)應(yīng)的通入氣體的體積V;所述體積V中失活細(xì)胞內(nèi)C〇2氣體的含量即為單個(gè)細(xì)胞細(xì) 胞器在時(shí)間t內(nèi)自身新陳代謝產(chǎn)生的0)2的量；
[002引所述失活細(xì)胞內(nèi)含有的C02氣體的體積的測(cè)試方法如下；
[0024] (a)將細(xì)胞傳代至一組培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~20h，洗漆，加入 ImL質(zhì)量百分含量為4%的多聚甲醒溶液，靜置lOmin，洗漆，加入ImLPBS溶液，向各培養(yǎng)皿 中通入0~20yL"C02與空氣的混合氣體，立即用PBS溶液離心洗立次，去除上清液，收集 細(xì)胞，冷凍抽真空干燥，得到含有失活細(xì)胞的待測(cè)樣品3 ;
[0025] 其中，"C化與空氣的體積比為1:1 ;
[0026] 所述培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境；溫度為37°C、C〇2的體積分?jǐn)?shù)為5% ;-組培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)為 21個(gè)；
[0027] 所述離屯、的轉(zhuǎn)數(shù)優(yōu)選1000巧m，離屯、時(shí)間優(yōu)選lOmin;
[002引 化）用同位素法測(cè)定待測(cè)樣品3的失活細(xì)胞中"C的含量，從而得到通入C02后進(jìn) 入失活細(xì)胞內(nèi)的C02氣體的含量；
[0029] 其中，步驟（4)和步驟巧）中所述巧光強(qiáng)度的測(cè)試均采用激光共聚焦顯微鏡；
[0030] 步驟（2)所述細(xì)胞器染料優(yōu)選線粒體染料、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料、高爾基體染料和溶酶體 染料中的一種；
[0031] 步驟（3)所述細(xì)胞優(yōu)選人子宮頸癌細(xì)胞化eLacell)、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 cell)和CD1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFcell)中的一種。
[0032] 有益效果；
[003引 （1)本發(fā)明所述方法采用的TPP-TMAE對(duì)化Lacell、MCF-7cell及正常細(xì)胞模型 MEFcell內(nèi)各細(xì)胞器代謝產(chǎn)生的二氧化碳具有特異性巧光響應(yīng)；可定量檢測(cè)癌細(xì)胞及正常 細(xì)胞細(xì)胞器中新陳代謝產(chǎn)生的二氧化碳的速率；
[0034] 似本發(fā)明所述方法采用TPP-TMAE對(duì)同一個(gè)細(xì)胞中不同細(xì)胞器（線粒體 (mitochon化ia)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreti州lum)、高爾基體（golgiapparatus)、溶酶體 (lysosome))代謝產(chǎn)生的二氧化碳巧光響應(yīng)不同，說(shuō)明同一個(gè)細(xì)胞中不同細(xì)胞器代謝產(chǎn)生 二氧化碳速率不同，可用于比較各細(xì)胞器新陳代謝過(guò)程的快慢，并有效鑒別出新陳代謝過(guò) 程的主要細(xì)胞器；
[0035] (3)本發(fā)明所述方法采用TPP-TMAE對(duì)癌細(xì)胞化eLacell、MCF-7cell)和正常細(xì) 胞（MEFcell)內(nèi)同一細(xì)胞器代謝產(chǎn)生的二氧化碳的速率不同，導(dǎo)致