一種病葉的切片棉蘭染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)及防治技術(shù)的領(lǐng)域，具體涉及一種病葉的切片棉蘭染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，由植物病原真菌引起的病害約占植物病害的70?80%。一種作物上可發(fā)現(xiàn)幾種甚至幾十種真菌病害。往往很多真菌病害的癥狀表現(xiàn)相似，而且病原菌在不同階段表現(xiàn)不同，許多真菌病害在環(huán)境條件不適宜時(shí)完全不表現(xiàn)病征，一般在寄主生育后期才產(chǎn)生病征，甚至在落葉上形成小黑點(diǎn)。
[0003]因此，要在寄主某一特定部位觀察形成的定的菌核或孢子，需要建立一種快速、直接觀察到葉片中各真菌的形態(tài)觀察方法，但傳統(tǒng)的切片觀察往往由于切片要求高，難以得到超薄而且完整的切片，而且容易使真菌與葉片組織混淆。而采用棉蘭染色法，菌絲細(xì)胞容易收縮變形，孢子容易飛揚(yáng)，用乳酸石炭酸溶液作為介質(zhì)，具有不使細(xì)胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。但是棉蘭染色往往因?yàn)榍衅^(guò)厚或者是葉片過(guò)于粗老而使得效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供病葉的切片棉蘭染色方法，該方法通過(guò)深層脫色，使葉片脫色干凈徹底，并調(diào)制好切片染色的時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)葉片中真菌觀察背景純凈單一、菌結(jié)構(gòu)清晰。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案為:一種病葉的切片棉蘭染色方法，其包括以下步驟:
(1)切片，將葉片進(jìn)行切片；
(2)初級(jí)脫色，采用脫色液對(duì)切片浸泡；
(3)深層脫色，將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入乙醇浸泡，然后對(duì)試管加執(zhí).^ ，
(4)染色，將深層脫色的切片置于棉蘭染色液中進(jìn)行染色，然后清洗切片；
(5)制片，將染色清洗后的切片制片。
[0006]作為優(yōu)選，所述切片過(guò)程是在一長(zhǎng)條玻璃上固定兩條短塊玻璃，調(diào)節(jié)兩短玻璃之間的縫隙，再用刀片在縫隙中進(jìn)行切片。
[0007]作為優(yōu)選，所述切片厚度為20-50 μ m。
[0008]作為優(yōu)選，采用脫色液浸泡3_5h進(jìn)行初級(jí)脫色。
[0009]作為優(yōu)選，向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中。
[0010]作為優(yōu)選，將裝有切片的試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，其中無(wú)水乙醇占試管的1/3，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴2-4次，待切片透明為止。
[0011]作為優(yōu)選，所述棉蘭染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸餾水和苯胺藍(lán)組成，乳酸(mL):苯酚(g):甘油(mL):蒸餾水(mL):甲基蘭(mg) =10: 10: 20: 10: 25。
作為優(yōu)選，將深層脫色的葉片放置于所述棉蘭染色液中20-30S后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗。
[0012]作為優(yōu)選，采用50%的甘油進(jìn)行制片。
[0013]本發(fā)明采用徒手切片及98%無(wú)水乙醇進(jìn)行加熱脫色，該染色方法可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中葉片中真菌的顯微觀察，同時(shí)可用于田間病害的早期診斷和病葉的監(jiān)測(cè)和鑒定；該染色方法即不引起細(xì)胞變形，又具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間，還能防止孢子飛散；加之染液的藍(lán)色能增強(qiáng)反差，使物象更清楚，為葉片病害的防治及病害玻片標(biāo)本的制作提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是茶白星病菌切片染色觀察病菌的子囊繁殖體(10X40)圖。
[0015]圖2是茶白星病菌切片染色觀察病菌的分生孢子(10X40)圖。
[0016]圖3是茶白星病菌切片染色觀察病菌的子囊孢子(10X40)圖。
[0017]圖4是茶白星病病癥圖。
[0018]圖5是茶白星病菌回接顯癥棉蘭染色病癥顯微成像(10 X 20)圖。
[0019]圖6是茶白星病菌回接顯癥棉蘭染色病癥顯微成像(10 X 40)圖。
[0020]圖7是茶炭疽病分生孢子圖。
[0021]圖8是茶炭疽病菌回接顯癥棉蘭染色病癥顯微成像(10 X 20)圖。
[0022]圖9是茶炭疽病菌回接顯癥棉蘭染色病癥顯微成像(10 X 40)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明的切片染色的方法，其包括以下步驟:
切片，切片過(guò)程是在一長(zhǎng)條玻璃上固定兩條短塊玻璃，調(diào)節(jié)兩短玻璃之間的縫隙，再用刀片在縫隙中進(jìn)行切片，相對(duì)徒手切片，葉片更為固定，切片的厚度可以較薄，而且勻稱(chēng)，同時(shí)其預(yù)留縫隙可控，也有利于樣品在玻片之間的轉(zhuǎn)移；所述切片厚度為20-50 μ m，不僅可以實(shí)現(xiàn)切片呈單層細(xì)胞或少數(shù)幾層細(xì)胞，觀察到葉片中較為完整的真菌形態(tài)特征，而且所做的切片更加完整。
[0024]初級(jí)脫色，采用脫色液浸泡3_5h進(jìn)行初級(jí)脫色，是為了降低茶葉的綠色，獲得淺綠色的切片；脫色液由乳酸、苯酚、甘油和蒸餾水組成，乳酸(mL):苯酚(g):甘油(mL):蒸餾水(mL)=15: 15: 15: 15。
[0025]深層脫色，將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中；將裝有切片的試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，其中無(wú)水乙醇占試管的1/3，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴2-4次，待切片透明為止。酒精是一種良好的有機(jī)溶劑，根據(jù)相似相融的原理，可以將物質(zhì)上的有機(jī)分子溶解除去，在高溫下實(shí)現(xiàn)快速脫色。
[0026]染色，將深層脫色的葉片放置于所述棉蘭染色液中20-30S后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗，其中棉蘭染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸餾水和甲基蘭組成，乳酸(mL):苯酚(g):甘油(mL):蒸餾水(mL):甲基蘭(mg) =20: 20: 40: 20: 50。其中苯酚可以起到殺菌的作用，乳酸甘油是用來(lái)保水的，棉蘭可以使得真菌得以染成藍(lán)色。從而在顯微鏡中觀察到真菌菌絲、孢子或產(chǎn)孢器染色后為深藍(lán)色，，寄主組織脫色徹底，而且?guī)缀醪恢?，菌體與背景反差大，便于區(qū)分其周?chē)嗨频闹参锝M織，輕松進(jìn)行葉片中原本病菌或回接后菌體的觀察。
[0027]制片，將染色清洗后的切片采用50%的甘油進(jìn)行制片，并采用保鮮膜進(jìn)行載玻片及蓋玻片的清洗。
[0028]實(shí)施例1 1、樣品采集2014年3月22日，湖南省石門(mén)采集茶白星病葉，去離子水沖洗葉片，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> 2、切片觀察
將葉片進(jìn)行切片，切片厚度約20 μ m，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸餾水組成的脫色液對(duì)切片浸泡；然后將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇占試管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中；再將試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴2次，待切片透明為止；接著將切片置于由20 mL乳酸、20g苯酸、40 mL甘油、20 mL蒸飽水和50mg甲基蘭組成的棉蘭染色液中進(jìn)行染色，20s后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗，再切片；最后將染色清洗后的切片制片，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)了病原菌的產(chǎn)孢器及其中的孢子。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。
[0029]實(shí)施例2 1、樣品采集2014年6月10日。將茶白星病菌回接葉片發(fā)病顯癥，取病癥部位的葉片。
[0030]2、切片觀察
將葉片進(jìn)行切片，切片厚度約30 μ m，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸餾水組成的脫色液對(duì)切片浸泡；然后將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇占試管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中；再將試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴3次，待切片透明為止；接著將切片置于由20 mL乳酸、20g苯酸、40 mL甘油、20 mL蒸飽水和50mg甲基蘭組成的棉蘭染色液中進(jìn)行染色，25s后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗，再切片；最后將染色清洗后的切片制片，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)了葉片中藍(lán)色的炭疽病菌絲及孢子。見(jiàn)圖4、圖5、圖6。
[0031]實(shí)施例3 1、樣品采集2014年6月22日，將茶炭疽病菌回接葉片發(fā)病顯癥，取病癥部位的葉片。
2、切片觀察
將葉片進(jìn)行切片，切片厚度約50 μ m，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸餾水組成的脫色液對(duì)切片浸泡；然后將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇占試管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中；再將試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴4次，待切片透明為止；接著將切片置于由20 mL乳酸、20g苯酸、40 mL甘油、20 mL蒸飽水和50mg甲基蘭組成的棉蘭染色液中進(jìn)行染色，30s后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗，再切片；最后將染色清洗后的切片制片，在顯微鏡觀察可以看到回接菌落的葉片中出現(xiàn)了茶炭疽病菌的孢子。見(jiàn)圖7、圖8、圖9。
[0032]上述實(shí)施方式僅供說(shuō)明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種病葉的切片棉蘭染色方法，其包括以下步驟: (1)切片，將葉片進(jìn)行切片； (2)初級(jí)脫色，采用脫色液對(duì)切片浸泡； (3)深層脫色，將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入乙醇浸泡，然后對(duì)試管加執(zhí).^ ， (4)染色，將深層脫色的切片置于棉蘭染色液中進(jìn)行染色，然后清洗切片； (5)制片，將染色清洗后的切片制片。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述切片過(guò)程是在一長(zhǎng)條玻璃上固定兩條短塊玻璃，調(diào)節(jié)兩短玻璃之間的縫隙，再用刀片在縫隙中進(jìn)行切片。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于:所述切片厚度為20-50μ mo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:采用脫色液浸泡3-5h進(jìn)行初級(jí)脫色。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:向試管中加入98%的無(wú)水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在無(wú)水乙醇中。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于:將裝有切片的試管置于玻璃燒瓶中水浴加熱，其中無(wú)水乙醇占試管的1/3，在沸騰干燥后繼續(xù)加酒精水浴2-4次，待切片透明為止。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述棉蘭染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸餾水和甲基蘭組成，乳酸(mL):苯酚(g):甘油(mL):蒸餾水(mL):甲基蘭(mg)=10: 10: 20: 10: 25ο8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:將深層脫色的葉片放置于所述棉蘭染色液中20-30s后用無(wú)菌水進(jìn)行清洗。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用50%的甘油進(jìn)行制片。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)及防治技術(shù)的領(lǐng)域，具體涉及一種病葉的切片棉蘭染色方法,其包括將葉片進(jìn)行切片；采用脫色液對(duì)切片浸泡；將浸泡后的切片置于試管中，向試管中加入乙醇浸泡，然后對(duì)試管加熱；將深層脫色的切片置于棉蘭染色液中進(jìn)行染色，然后清洗切片；將染色清洗后的切片制片。本發(fā)明采用徒手切片及98%無(wú)水乙醇進(jìn)行加熱脫色，該染色方法可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中葉片中真菌的顯微觀察，同時(shí)可用于田間病害的早期診斷和病葉的監(jiān)測(cè)和鑒定；該染色方法即不引起細(xì)胞變形，又具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間，還能防止孢子飛散；加之染液的藍(lán)色能增強(qiáng)反差，使物象更清楚。
【IPC分類(lèi)】G01N1/30
【公開(kāi)號(hào)】CN104964865
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510021839
【發(fā)明人】周凌云, 曾振, 王沅江, 黃安平, 李維, 劉紅艷, 包強(qiáng)
【申請(qǐng)人】湖南省茶葉研究所（湖南省茶葉檢測(cè)中心）
【公開(kāi)日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日