一種檢測(cè)橡膠植物中的小橡膠粒子蛋白含量的方法以及使用該方法篩選橡膠植物品系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種使用表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)橡膠植物乳液中的小橡膠粒子蛋 白的方法W及利用該方法進(jìn)行橡膠植物品系篩選的技術(shù)。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種基于表 面等離子共振技術(shù)檢測(cè)橡膠植物乳液中的小橡膠粒子蛋白的傳感器巧片。
【背景技術(shù)】
[0002] 世界上約有2000種不同的植物可生產(chǎn)類似天然橡膠的聚合物，人們已從其中500 種橡膠植物中得到了不同種類的橡膠。不同的橡膠植物中含膠量有很大差異。天然橡 膠在橡膠粒子上合成，很多蛋白、酶等與橡膠的合成有關(guān)。其中，小橡膠粒子蛋白（small rubberparticleprotein(簡(jiǎn)稱為SRP巧）是一種關(guān)鍵蛋白，與橡膠的合成緊密相關(guān)。橡 膠植物的含膠量取決于植物中的小橡膠粒子蛋白含量（參見(jiàn)化，S.K. ;Kang，H. ;Shin，D. H. ；Yang,J. ；Chow,K.S. ；Yeang,H.Y. ；Wagner,B. ；Breiteneder,H. ；Han,K.H.J.Biol. 化em. 1999, 274, 17132 - 17138.)。通過(guò)檢測(cè)一種橡膠植物中的SRPP含量，可W推測(cè)該橡膠 植物的產(chǎn)膠量。
[0003] 另外，目前市場(chǎng)上的天然橡膠來(lái)自從橡膠樹上采集的天然橡膠乳液。但傳統(tǒng)的天 然橡膠產(chǎn)量低。橡膠樹生長(zhǎng)在亞熱帶、熱帶地區(qū)。中國(guó)亞熱帶地區(qū)面積較小，自產(chǎn)天然橡膠 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)需求量。再者，天然橡膠主要被東南亞國(guó)家所壟斷。在復(fù)雜的國(guó)際 形勢(shì)下，天然橡膠依賴于從東南亞國(guó)家進(jìn)口嚴(yán)重影響了我國(guó)的橡膠安全。
[0004] 橡膠草是多年生草本植物，包括菊科蒲公英等。橡膠草含有天然橡膠乳液，能制造 天然橡膠。我國(guó)面積廣大，從溫帶到亞熱帶種都可種植橡膠草。因此，中國(guó)研究機(jī)構(gòu)已開(kāi)始 研究從橡膠草上采集天然膠乳，W制備天然橡膠。
[0005] 但是，橡膠草中含膠量普遍較低。需要從野生的橡膠草中篩選出天然乳膠含量高 的橡膠草品系和植株，進(jìn)行人工培育，W大規(guī)模推廣種植。天然乳膠含量取決于SRPP的含 量。通過(guò)檢測(cè)一種品系的橡膠草中的SRPP含量便可知其產(chǎn)膠潛力，便可篩選出高產(chǎn)膠量的 橡膠草品系。因此，急需一種低成本、可定量、靈敏、快速、能夠在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)的橡膠草品 中的SRPP的檢測(cè)方法。
[0006] 但是，在本發(fā)明之前，尚沒(méi)有公開(kāi)一種能夠檢測(cè)SRPP含量的技術(shù)手段，特別是沒(méi) 有人報(bào)道過(guò)一種同時(shí)滿足低成本、特異性、可定量、快速、靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)等要求的檢 測(cè)植物乳液中的SRPP的技術(shù)手段。
[0007]表面等離子共振技術(shù)（SurfacePlasmonResonancetechnology,簡(jiǎn)稱為SPR)發(fā) 展于20世紀(jì)90年代，是基于檢測(cè)生物傳感巧片上配位體（ligand)與分析物相互作用的先 進(jìn)技術(shù)，可快捷簡(jiǎn)便地檢測(cè)蛋白質(zhì)分子間及藥物與蛋白質(zhì)、抗原與抗體、核酸與核酸等生物 分子間的相互作用，在醫(yī)療檢測(cè)、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。
[0008] 對(duì)SPR技術(shù)的原理說(shuō)明如下：當(dāng)光線在棱鏡與金膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，一 部分光會(huì)被光疏介質(zhì)吸收，從而在金屬膜中產(chǎn)生消逝波。而若把金屬的價(jià)電子看成在均勻 正電荷之下不斷運(yùn)動(dòng)的電子氣體，那么它實(shí)際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬被電磁干擾時(shí)， 金屬中將產(chǎn)生不均勻分布的電子密度。此時(shí)消逝波與金膜表面的等離子波將發(fā)生共振，若 檢測(cè)反射光，將發(fā)現(xiàn)較大程度的減弱現(xiàn)象。因能量已從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，表面等離子 波吸收了入射光的大部分能量，該樣就造成反射光的能量加劇減少。因此，在反射光強(qiáng)的響 應(yīng)曲線可W看到一個(gè)最小的尖峰，該時(shí)所對(duì)應(yīng)的入射光波長(zhǎng)稱為共振波長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的入射角 稱為共振角，即SH?角。SH?角因金表面折射率變化而變化，又因折射率的變化與金表面結(jié) 合的分子質(zhì)量是成正比關(guān)系。通過(guò)該種對(duì)應(yīng)關(guān)系便可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的快速檢測(cè)。
[0009] 本發(fā)明的基于SPR的檢測(cè)方法和免疫傳感器解決了上述技術(shù)難題，首次為橡膠草 品系的篩選和進(jìn)一步培育提供科學(xué)依據(jù)，無(wú)論從經(jīng)濟(jì)意義還是我國(guó)的橡膠安全的角度來(lái)說(shuō) 具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 【發(fā)明所要解決的課題】
[0011] 本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種橡膠植物中的SRPP含量檢測(cè)方法，該檢 測(cè)方法利用表面等離子共振技術(shù)，特異性地識(shí)別橡膠草膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白 SRPP(小橡膠粒子蛋白），并通過(guò)收集SRPP與其抗體的結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)，得到SRPP的含 量。
[0012] 本發(fā)明還提供一種高SRPP含量橡膠草品系的篩選技術(shù)，該篩選技術(shù)利用表面等 離子共振技術(shù)，特異性地識(shí)別橡膠草膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡膠粒子蛋 白），并通過(guò)收集SRPP與其抗體的結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)，得到SRPP的含量。
[0013] 本發(fā)明的目的之一即利用SPR檢測(cè)SRPP含量，借此篩選出SRPP含量接近或超過(guò) 己西橡膠樹的橡膠草品系。
[0014] 本發(fā)明還提供一種SPR免疫傳感器，其包括巧片和固定于巧片上的SRPP抗體，所 述抗體優(yōu)選為SRPP單克隆抗體。所述巧片上具有金膜和駿甲基葡聚糖。
[0015]【發(fā)明的效果】
[0016] 本發(fā)明利用表面等離子共振技術(shù)，借助抗原與抗體的特異性結(jié)合技術(shù)來(lái)識(shí)別橡膠 樹、橡膠草等橡膠植物膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡膠粒子蛋白），并通過(guò)收集 SRPP與其抗體的結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)，得到SRPP的含量，解決了W往無(wú)法檢測(cè)橡膠植物中 SRPP含量的問(wèn)題，同時(shí)解決了產(chǎn)膠橡膠草品系篩查的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題。同時(shí)本發(fā)明具有快 速、準(zhǔn)確、靈敏、低成本、簡(jiǎn)便、可現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施、不破壞植物等顯著優(yōu)點(diǎn)。
[0017]具體地說(shuō)，本發(fā)明的檢測(cè)方法和篩選方法的優(yōu)點(diǎn)包括：
[001引1)快速，抗體固定好后每個(gè)樣品的檢測(cè)只需要幾分鐘；
[0019] 2)前處理簡(jiǎn)便，樣品不需要復(fù)雜的前處理，只需要過(guò)膜或離屯、即可。
[0020] 3)特異性強(qiáng)，利用抗SRPP抗體尤其是單克隆抗體作為識(shí)別分子，可特異性識(shí)別 SRPP。
[002。 4)可實(shí)現(xiàn)SRPP含量的定量，例如，W某種常見(jiàn)天然橡膠植物的乳液中SRPP的SPR 信號(hào)值為基準(zhǔn)，再通過(guò)SPR測(cè)其他樣品中的SRPP的SPR信號(hào)值，計(jì)算出其他樣品的信號(hào)值 與基準(zhǔn)的比值，W該比值定量其他樣品中的SRPP含量。
[0022] 5)成本低，巧片可W再生后反復(fù)使用。
[0023] 6)采集乳液后可W現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。
[0024] 7)靈敏，即使將橡膠乳液稀釋到0. 5體積％，也能獲得明確的信號(hào)。
[00巧]最重要的是，目前尚未有檢測(cè)天然橡膠乳液中的SRPP技術(shù)。
[0026] 本發(fā)明可W實(shí)現(xiàn)特異性橡膠粒子膜蛋白識(shí)別，并快速判斷橡膠粒子膜蛋白的相對(duì) 含量，為有產(chǎn)膠潛力的橡膠草品系的篩選和進(jìn)一步培育提供科學(xué)依據(jù)，故依據(jù)本發(fā)明，將有 望建立己西橡膠樹產(chǎn)膠替代方案W良好解決當(dāng)前天然橡膠產(chǎn)量嚴(yán)重不足問(wèn)題，因此，本發(fā) 明具有極為可觀的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效果，同時(shí)是解決國(guó)家天然橡膠戰(zhàn)略安全的關(guān)鍵技術(shù)之一。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為SPR免疫傳感器示意圖。
[002引圖2A示出不同抑值下的SPR響應(yīng)值；圖2B示出不同抗體濃度下的SPR響應(yīng)值。
[0029] 圖3示出不同純化橡膠乳液濃度（體積％ )下的SPR響應(yīng)值。
[0030] 圖4示出由不同純化橡膠乳液濃度（體積％)與sra響應(yīng)值得到回歸方程的一例。
【具體實(shí)施方式】
[0031]W下將更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
[0032] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用SPR檢測(cè)植物橡膠乳液內(nèi)的橡膠粒子表面蛋白 SRPP的方法，該檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0033] 1)對(duì)植物橡膠乳液進(jìn)行預(yù)處理W除去植物橡膠乳液中的雜質(zhì)；
[0034] 2)將SRPP抗體固定化于巧片表面；
[0035] 3)利用SPR技術(shù)檢測(cè)植物橡膠乳液中的SRPP。
[0036] <植物橡膠乳液的預(yù)處理〉
[0037] 植物橡膠乳液的預(yù)處理包括：自植物采集植物橡膠乳液后對(duì)天然橡膠粒子進(jìn)行純 化來(lái)去除雜質(zhì)，W獲得包含橡膠粒子的純化橡膠乳液，W及任選地對(duì)純化橡膠乳液進(jìn)行水 洗。
[0038] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，植物橡膠乳液采集自含有能夠制備橡膠的膠質(zhì)乳液的 植物，例如，橡膠樹、橡膠草等產(chǎn)膠植物。
[0039] 本發(fā)明的橡膠樹包括己西橡膠樹等。
[0040] 本發(fā)明的橡膠草包括各種蒲公英屬植物等，例如俄羅斯品系蒲公英、海南品系蒲 公英、新疆品系蒲公英等。優(yōu)選溫帶地區(qū)生長(zhǎng)的蒲公英。
[0041] 在此需要說(shuō)明的是，除去雜質(zhì)的預(yù)處理是SPR檢測(cè)儀使用時(shí)所需要的。因?yàn)镾PR 檢測(cè)儀運(yùn)行時(shí)的通路很細(xì)，而且巧片上的各個(gè)反應(yīng)區(qū)域也是微米級(jí)的反應(yīng)池等，所W需要 物理上的預(yù)處理，將大粒度的物質(zhì)除去。
[0042] <植物橡膠乳液的采集〉
[0043] 橡膠草的乳液可W自橡膠草的任意部位，優(yōu)選采集自根部。對(duì)于橡膠樹而言，植物 橡膠乳液的采集可W采用天然橡膠乳液一般的采集方法。也可W采用下述的毛細(xì)管吸取 法。
[0044] 對(duì)于橡膠草而言優(yōu)選的是，優(yōu)選毛細(xì)管吸取法，在不破壞橡膠草的情況下現(xiàn)場(chǎng)提 取。毛細(xì)管吸取法具體地說(shuō)，W蒲公英為例，蒲公英植物橡膠乳液的提取可W切開(kāi)根部，然 后用毛細(xì)管吸取后，再用注射器打入離屯、管等收集容器里或過(guò)膜過(guò)濾。該個(gè)步驟的主要優(yōu) 點(diǎn)是對(duì)于很少的樣品也能最大程度的取出，比破碎之類的方法效率高，而且相比于破碎法， 該步驟還能使橡膠草受到的傷害減少到最小的程度，并且可實(shí)現(xiàn)多次提取。
[004