一種用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法，以及涉及相應(yīng)的用于監(jiān)測血管重 構(gòu)現(xiàn)象的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠脈血管架橋是將病人自體靜脈移植到冠狀動(dòng)脈替代原有病變的動(dòng)脈血管的一 種常見外科手術(shù)方法，是目前臨床治療因冠脈粥樣硬化導(dǎo)致心肌梗死最重要手段之一。由 于移植血管在一年內(nèi)有15%、3~5年內(nèi)有30%、5~10年內(nèi)有50%的移植血管出現(xiàn)重阻 塞，導(dǎo)致移植手術(shù)最終失敗，給家庭、給社會以及經(jīng)濟(jì)造成很到損失。人們對于如何防止移 植后血管重阻塞的機(jī)制迄今仍不清楚。
[0003] 目前，人們普遍認(rèn)為，移植血管組織重構(gòu)主要是由于血管平滑肌細(xì)胞的增殖過多、 死亡過少而形成，因而人們對移植血管的病理生理變化的干預(yù)研宄要么只是監(jiān)視細(xì)胞增殖 及相應(yīng)機(jī)制，要么只是觀察血管組織的細(xì)胞死亡及機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明突破了傳統(tǒng)上對于血管重構(gòu)現(xiàn)象只監(jiān)視細(xì)胞增殖或者只監(jiān)視細(xì)胞凋亡的 方法，首次提出了一種新的用于監(jiān)控血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法，同時(shí)對細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡進(jìn) 行觀察，能夠更有效地對移植血管的病理生理變化進(jìn)行干預(yù)研宄。
[0005] 本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法是基于發(fā)明人的最新研宄成果，即血 管重構(gòu)（包括移植靜脈動(dòng)脈化以及移植靜脈粥樣硬化過程）并不只是過去人們認(rèn)識的細(xì)胞 過度增生而細(xì)胞凋亡抑制，而是細(xì)胞大量增生的同時(shí)，細(xì)胞凋亡也大量出現(xiàn)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明：一部分細(xì)胞（原來存在于血管壁上的干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞）接受外來刺激后立 馬開始分化和增生，繼而開始合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，分布到細(xì)胞外的血管膜上，使得血管 壁快速增加變厚，以快速抗衡和適應(yīng)外來壓力對管壁的傷害。與此同時(shí)，原有的血管壁上的 成熟的平滑肌細(xì)胞在突發(fā)外來傷害因素（如高血壓產(chǎn)生的機(jī)械牽張力以及糖尿病高血糖 產(chǎn)生的AGEs等）作用下，細(xì)胞出現(xiàn)損傷進(jìn)而通過凋亡的形式而被清除。在通過凋亡清理完 第一批受損傷細(xì)胞后，新生的細(xì)胞在經(jīng)歷了大量細(xì)胞外基質(zhì)合成后亦會變得衰老，最終也 會通過凋亡的形式而被清除。只要外來傷害因子持續(xù)存在，血管的細(xì)胞（干細(xì)胞等）會不 斷被激活而出現(xiàn)細(xì)胞的增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)，血管也隨之變厚，同時(shí)完成了功能的細(xì)胞 亦會衰老并經(jīng)由凋亡途徑而被清除。如此出現(xiàn)了血管中既可見有細(xì)胞大量增殖，亦可見其 它細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。因而，細(xì)胞增殖越多，細(xì)胞調(diào)亡也就越多，最終血管重構(gòu)速度也就越 快。由此建立本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法，通過對細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)原 位三重檢測（增殖細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和靜息細(xì)胞）來更有效和更準(zhǔn)確的監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法，包括以下 步驟：
[0007] A.體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行因素處理而制備成細(xì)胞爬片；
[0008] B.用清洗液清洗，加入固定液覆蓋染色標(biāo)本，置于_20°C固定10分鐘；
[0009] C.用清洗液清洗，加入脫膜液覆蓋染色標(biāo)本，20_25°C孵育10分鐘；
[0010] D.用清洗液清洗，加入封閉液覆蓋染色標(biāo)本，置于濕盒中孵育30分鐘；
[0011] E.用含1 % BSA的PBS緩沖液稀釋細(xì)胞核增殖抗原Ki67,稀釋濃度為1 :200,將稀 釋好的液體覆蓋染色標(biāo)本，置于濕盒中4°C孵育過夜；
[0012] F.用清洗液清洗，加入Cy3標(biāo)記熒光二抗，參考稀釋濃度為1 :200,置于濕盒內(nèi)室 溫孵育2小時(shí)；
[0013] G.用清洗液清洗，加入預(yù)先配制的體積比為1 :9的凋亡酶試劑和凋亡標(biāo)記試劑， 20-25 °C保持1小時(shí)；
[0014] H.用稀釋濃度為I :200的細(xì)胞核復(fù)染試劑進(jìn)行復(fù)染，20-25°C染色10分鐘，用清 洗液清洗；
[0015] I.甘油封片，焚光顯微鏡觀察。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法，包括以 下步驟：
[0017] A.將血管組織制備成石蠟切片；
[0018] B.石蠟切片于60°C烤片2小時(shí)，依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、75%乙 醇、50%乙醇和去離子水中各3分鐘；
[0019] C.用清洗液清洗，加入固定液覆蓋染色標(biāo)本，置于濕盒內(nèi)孵育30分鐘；
[0020] D.用清洗液清洗，加入封閉液覆蓋染色標(biāo)本，置于濕盒中孵育2小時(shí)；
[0021] E.使用含1 % BSA的TBS緩沖液稀釋細(xì)胞核增殖抗原Ki67,稀釋濃度為1 :200,將 稀釋好的液體覆蓋染色標(biāo)本，置于濕盒中4°C孵育過夜；
[0022] F.用清洗液清洗，加入Cy3標(biāo)記熒光二抗，參考稀釋濃度為1 :200,置于濕盒內(nèi) 20-25°C孵育2小時(shí)；
[0023] G.用清洗液清洗，加入預(yù)先配制的體積比為1 :9的凋亡酶試劑和凋亡標(biāo)記試劑， 20-25 °C保持1小時(shí)；
[0024] H.用稀釋濃度為I :200的細(xì)胞核復(fù)染試劑進(jìn)行復(fù)染，20-25°C染色10分鐘，用清 洗液清洗；
[0025] I.甘油封片，焚光顯微鏡觀察。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述清洗液是 PBS緩沖液。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，在各步驟中用清 洗液清洗時(shí)，至少清洗3次，每次清洗5分鐘。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述固定液是甲 醇，在使用前置于-20 °C預(yù)冷。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述脫膜液是含 有 0· 25% Triton X-100 的 PBS 緩沖液。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述封閉液是 5% BSA0
[0031] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述凋亡酶試劑 是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，所述凋亡標(biāo)記試劑是核苷酸混合物。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的方法的進(jìn)一步特征，所述細(xì)胞核復(fù)染 試劑為 DAPI，即 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4'，6-diamidino_2-phenylindole)。
[0033] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的試劑盒。
[0034] 本發(fā)明所述的用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的試劑盒，包括：清洗液，為PBS緩沖液；固 定液，為甲醇；脫膜液，為含有〇. 25% Triton X-100的PBS緩沖液；封閉液，為5% BSA ;抗 體：Ki67 -抗，Cy3標(biāo)記熒光二抗；抗體稀釋液：含1 % BSA的PBS緩沖液；含1 % BSA的TBS 緩沖液；凋亡酶試劑，為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶；凋亡標(biāo)記試劑，為核苷酸混合物；細(xì)胞核 復(fù)染試劑，為DAPI。
[0035] 目前用于監(jiān)測血管重構(gòu)現(xiàn)象的試劑盒只有以下兩種：（1)檢測細(xì)胞增殖的；（2)檢 測細(xì)胞凋亡的。本發(fā)明所述的試劑盒不同于現(xiàn)有的兩種試劑盒，它能同時(shí)檢測細(xì)胞增殖、細(xì) 胞凋亡以及靜息狀態(tài)細(xì)胞，對增殖細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和靜息細(xì)胞進(jìn)行原位三重檢測。
[0036] 本發(fā)明所述的試劑盒的應(yīng)用范圍包括：血管重構(gòu)的調(diào)控，包括冠脈架橋后移植血 管的病理生理變化以及誘導(dǎo)向動(dòng)脈化的檢測與觀察。靜脈移植到冠狀動(dòng)脈后在動(dòng)脈壓力作 用下發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的變化，在此過程中，血管壁的細(xì)胞會出現(xiàn)細(xì)胞大量增殖，并合成細(xì)胞 外基質(zhì)大量積存于管壁，于此同時(shí)，施行功能后的細(xì)胞繼而大量凋亡。并且細(xì)胞增殖得越 多，凋亡也就越多，結(jié)果是移植血管粥樣硬化越快。本試劑盒可以檢測到上述管壁細(xì)胞的變 化，可同時(shí)顯示增殖細(xì)胞、凋亡細(xì)胞以及靜息細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明所述的方法與試劑盒的檢測原理是：細(xì)胞或組織在體內(nèi)代謝產(chǎn)物的刺激作 用下，會同時(shí)發(fā)生細(xì)胞增殖和凋亡，如果增殖信號強(qiáng)于凋亡信號，細(xì)胞向增殖通路發(fā)展，相 反，則細(xì)胞凋亡，組織內(nèi)的細(xì)胞增殖和凋亡最終將導(dǎo)致組織的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而影響功能。本 試劑盒首先通過細(xì)胞周期內(nèi)Ki67抗體和細(xì)胞反應(yīng)，標(biāo)記增殖細(xì)胞，其次使用末端脫氧核苷 酸轉(zhuǎn)移酶和凋亡細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，從而標(biāo)記凋亡細(xì)胞，所有細(xì)胞核都可與DAPI結(jié)合，因而除 了 Ki67和凋亡陽性細(xì)胞外其余均為靜息細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞核標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及各 種細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占比分，進(jìn)而做到同時(shí)觀察細(xì)胞和組織內(nèi)增殖、凋亡以及靜息細(xì)胞 數(shù)量和分布情況。
[0038] 適用范圍：基礎(chǔ)與臨床研宄中體外培養(yǎng)細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片和各類組織切片中的 組織細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞增殖、凋亡以及靜息情況研宄。
[0039] 特異性：本試劑盒主要標(biāo)記細(xì)胞增殖周期中Ki67和凋亡過程中DNA雙鏈片段，從 而可以和細(xì)胞壞死以及由細(xì)胞毒性藥物或輻射導(dǎo)致的DNA單鏈片段相鑒別，因此特異性較 尚。
[0040] 檢測時(shí)間：培養(yǎng)細(xì)胞因素處理后或血管移植后15~30小時(shí)，不包括細(xì)胞培養(yǎng)、刺 激、動(dòng)物模型制備、切片時(shí)間。
【附圖說明】
[0041] 圖1是細(xì)胞爬片標(biāo)本，圖中紅色箭頭所指為Ki67陽性細(xì)胞（細(xì)胞增殖，紅色），綠 色箭頭為TUNEL陽性細(xì)胞（細(xì)胞凋亡，綠色）以及藍(lán)色箭頭所指靜息細(xì)胞。
[0042] 圖2是移植靜脈石蠟切片標(biāo)本，圖中紅色箭頭所指為Ki67陽性細(xì)胞（細(xì)胞增殖， 紅色），綠色箭頭為TUNEL陽性細(xì)胞（細(xì)胞凋亡，綠色）以及藍(lán)色箭頭所指靜息細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 實(shí)施例1 :小鼠頸總動(dòng)脈壓誘導(dǎo)的靜脈移植模型實(shí)驗(yàn)
[0044] 1.材料：
[0045] 顯微止血鉗、血管夾、聚乙烯套管、眼科鑷、眼科剪。
[0046] 2.方法：
[0047] 手術(shù)器械消毒后，麻醉小鼠（10g/L戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射），同時(shí)給予硫 酸阿托品1.7mg/kg肌注（3.4yL/g)以保持呼吸道順暢。整個(gè)手術(shù)過程在體視顯微鏡下操 作。取仰臥位，暴露頸部并固定于手術(shù)臺上。從小鼠頸中部自下頒骨水平至胸骨頂端的縱 行切口，剪除右側(cè)胸骨乳突肌，盡可能長地分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，8 - 0絲線在其中點(diǎn)兩端結(jié) 扎后，從中點(diǎn)處剪開。斷端穿過聚乙烯套管，用顯微止血夾鉗夾血管和套管，去掉血管斷端 的結(jié)扎線，將部分血管外翻套于套管上，8 - 0絲線結(jié)