用于同時檢測或定量多種目標物質的分析方法和分析試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于同時檢測或定量多種目標物質的分析方法和分析試劑盒。
【背景技術】
[0002] 作為用于同時檢測多個分析對象的技術，開發(fā)了 BIST (Beads array In Single Tip)(非專利文獻1)。BIST是指，在圓筒狀的芯片（以下稱為"毛細管"）部分排列封 入有直徑Imm的探針微珠的器件。所述探針微珠固定有與抗原、基因等測定對象物質 結合的抗體、抗原或者DNA片段等生物體分子。該BIST能夠嵌合于Magtration裝置 的噴嘴，因此能夠使用與核酸提取相同的自動化裝置（例如，Magtration(注冊商標） System 6GC，Magtration (注冊商標）System 12GC Plus (Precision system Science 公司 制））來進行雜交反應或抗原抗體反應和清洗操作。產(chǎn)生的信號可以利用掃描儀（例如， BISTnner(Precision system Science 公司制））進行檢測。
[0003] BIST技術的最大特征在于，毛細管中配置有多個用于捕獲不同目標物質的探針微 珠，能夠實現(xiàn)多項目的同時檢測。在應用到甲狀腺刺激激素（TSH:thyroid stimulating hormone)、通過與其同時檢驗而臨床上的有用性高的FT3 (Free Triiodo thyronine)、 FT4(Free thyroxine)的定量檢驗中，實用上所要求的檢測濃度域涉及廣范圍（TSH: 0· 05-50uIu/mL，F(xiàn)T3 :0· 5-20pg/mL，F(xiàn)T4 :0· Ι-lOng/dL，以動態(tài)范圍計為 IO3左右）。因此， 為了實現(xiàn)多項目同時檢驗，必須使來自各探針微珠的信號光（強度與目標物質的濃度成比 例地增加的光）局部化、并抑制與來自其他探針微珠的信號光的干渉。但是，至今為止，信 號光的局部化還不能說是充分達到的。
[0004] 現(xiàn)有技術文獻
[0005] 非專利文獻
[0006] 非專利文獻1 :遺伝子多型簡易測定法CMC出版刊"月刊八彳才彳y夂只卜y - 2008年9月號"

【發(fā)明內容】

[0007] 發(fā)明要解決的課題
[0008] 為了同時檢測或定量多種目標物質，本發(fā)明的目的在于使來自探針微珠的信號光 局部化。
[0009] 解決課題的方法
[0010] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入的努力，結果發(fā)現(xiàn)，通過在BIST中隔著濾光器來測定來自 探針微珠的發(fā)光，能夠選擇性地接受來自所需的探針微珠的發(fā)光，并完成了本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明的要旨如下所述。
[0012] (1) -種分析方法，其通過收容在單一容器內的、分別固定有用于捕獲多種目標物 質的物質的多個載體發(fā)光，并從容器外部測定該發(fā)光，來同時檢測或定量多種目標物質，其 中，通過隔著濾光器來測定源自載體的發(fā)光，由此選擇性地接受源自所需的載體的發(fā)光。
[0013] (2)如⑴所述的方法，其中，濾光器設置于容器表面，或者容器本身為濾光器。
[0014] (3)如⑴或⑵所述的方法，其中，容器本身為濾光器。
[0015] (4)如⑴~⑶中任一項所述的方法，其中，使用測定對象的發(fā)光的波長區(qū)域中 的光線透射率為70 %以下的濾光器。
[0016] (5)如⑴~⑷中任一項所述的方法，其中，載體呈球狀。
[0017] (6)如⑴~（5)中任一項所述的方法，其中，1維或2維地配置載體。
[0018] (7)如⑴~（6)中任一項所述的方法，其中，發(fā)光為化學發(fā)光或焚光，發(fā)光的波長 區(qū)域在340-900nm的范圍內。
[0019] (8) -種分析試劑盒，其包括：分別固定有用于捕獲多種目標物質的物質的多個 載體，和用于選擇性地接受源自所需的載體的發(fā)光的濾光器，所述分析試劑盒用于通過收 容在單一容器內的、分別固定有用于捕獲多種目標物質的物質的多個載體發(fā)光，并從容器 外部測定該發(fā)光，來同時檢測或定量多種目標物質。
[0020] (9)如（8)所述的分析試劑盒，其中，容器本身為濾光器。
[0021] (10)如⑶或（9)所述的分析試劑盒，其中，發(fā)光為化學發(fā)光或焚光，發(fā)光的波長 區(qū)域在340-900nm的范圍內。
[0022] 發(fā)明效果
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，在同時檢測或定量多種目標物質的體系中，能夠使源自固定有用于 捕獲目標物質的物質的探針微珠的信號光局部化，并抑制與源自其他探針微珠的信號光的 干渉。
[0024] 本說明書包括作為本申請優(yōu)先權基礎的日本專利申請日本特愿2012 - 232488的 說明書和/或附圖中記載的內容。
【附圖說明】
[0025] 圖1示出BIST毛細管內構成。
[0026] 圖2-1(左上）示出基于BIST的TSH(0. 5uIU/mL)測定中源自位于毛細管中央部 的探針微珠的發(fā)光峰。圖2-2 (右上）示出基于BIST的TSH (25uIU/mL)測定中源自位于毛 細管中央部的探針微珠的發(fā)光峰。圖2-3(下）示出毛細管材料的吸光度與信號光峰的值 的關系。
[0027] 圖3-1 (左上）是以峰值將圖2-2的數(shù)據(jù)歸一化并用log尺度顯示縱軸的圖表。 圖3-2 (右上）示出毛細管材料的吸光度與峰寬度（縱軸為1/3, 000的寬度）的關系。圖 3-3 (下）示出毛細管材料的吸光度和峰值與峰寬度之比（P/W比）的關系（將Abs = 0. 0 時的P/W比設為1，以相對P/W比進行繪圖）。
【具體實施方式】
[0028] 以下對本發(fā)明的實施方式進行更詳細的說明。
[0029] 本發(fā)明提供一種分析方法，其通過收容在單一容器內的、分別固定有用于捕獲多 種目標物質的物質的多個載體發(fā)光，并從容器外部測定該發(fā)光，來同時檢測或定量多種目 標物質，其中，通過隔著濾光器來測定源自載體的發(fā)光，由此選擇性地接受源自所需的載體 的發(fā)光。
[0030] 對于容器而言，只要能夠從容器外部測定發(fā)光，則可以為任意容器，但適合具有透 光性，優(yōu)選樹脂、玻璃等透射光的材質。另外，容器的形狀沒有特別限制，可以為細管、移液 管狀等形狀。例如，在BIST的情況下，容器為能夠進行收容在內部的液體的吸引、吐出的圓 筒狀芯片。
[0031] 本發(fā)明的方法中，通過提高容器的透明度，能夠降低信號光的擴散。容器的厚度 Imm的霧度值適合為20 %以下，優(yōu)選為10 %以下，更優(yōu)選為1 %以下。作為厚度Imm的霧度 值為20%以下的容器的材質，可例示：聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán) 狀聚烯烴、聚甲基戊烯等。
[0032] 霧度值為表示透明性的程度的值，JIS K7136中定義為擴散透射率與總光線透射 率之比。
[0033] 另外，發(fā)光或放射的波長區(qū)域中的容器的折射率適合為1.6以下，優(yōu)選為1.55以 下，更優(yōu)選為1. 50以下。作為折射率為1. 6以下的容器的材質，可以例示：聚丙烯、聚碳酸 酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán)狀聚烯烴、聚甲基戊烯等。
[0034] 目標物質可以為血液、血清、尿、淋巴液、口腔內粘膜、指甲、喀痰等生物體試樣、河 水、湖水、海水、土壌等試樣中含有的作為分析對象的物質。作為目標物質，可以例示：核酸、 蛋白質、抗原、抗體、酶、糖等生物體物質，沙門氏菌、大腸桿菌等細菌類，鈷、鐵、鉬、銅、鋅、 神、錦、I凡等金屬等。
[0035] 目標物質可以進行能夠測定的標記，作為能夠測定的標記，可以例示：熒光標記、 化學發(fā)光標記、電化學發(fā)光標記、酶標記、放射性標記、磁標記等。作為標記物質，可以例 示：海軍藍（Marine Blue)、級聯(lián)藍（Cascade Blue)、級聯(lián)黃（Cascade Yellow)、焚光黃 (Fluorescein)、羅丹明（Rhodamine)、藻紅蛋白（Phycoerythrin)、CyChrome、PerCP、德州 紅（Texas Red)、別藻藍蛋白（Allophycocyanin)、PharRed、俄勒閃綠（Oregon Green)_488、 Cy 系色素（例如Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7等）、Alexa系色素（例如，Alexa-488、Alexa_532、 Alexa-546、Alexa-633、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750 等）、BODIPY 系色素（例如， BODIPY FL、BODIPY TR-等）等熒光物質，魯米諾（luminol)、吖啶、金剛烷基環(huán)二氧乙烷、 草酸酯、洛芬、光澤精、異氨基苯二酰肼衍生物等化學發(fā)光物質，三聯(lián)吡啶-(4-甲基砜）NHS 醋釕（Π )絡合物、二苯基蒽、四苯基蒽等電化學發(fā)光物質，P0D(Hydrogen peroxidase，過氧 化氫酶）、AP (alkaline phosphatase，堿性磷酸酶）、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖 氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等酶等。另外，也可使用放射性同位元素（例如， 3H、14C、32P、 33P、35S、 125I等）等放射性物質等標記物質。
[0036] 目標物質可以被直接標記，也可以被間接標記。例如，后述的實施例中，使用了三 明治ELISA法。具體地，在固定于載體的一次抗體上結合作為抗原的目標物質后，使作為二 次抗體的生物素標記抗體與目標物質結合。然后，在該二次抗體上結合催化化學發(fā)光的鏈 霉素抗生物素蛋白化的HRP，標記目標物質。
[0037] 關于用于捕獲目標物質的物質，只要為與目標物質結合的物質，則可以例示：抗 體、抗原、DNA片段、金屬絡合物、其他低分子化合物等，但并不限定于這些。
[0038] 載體可以為無定形粒子、球（微珠）、絲（線）、磁性微珠等任意形狀，但優(yōu)選為球 狀。在載體采取球（微珠）或磁性微珠的形狀的情況下，可以在各球（微珠）或磁性微珠上 固定用于捕獲不同目標物質的物質。在載體采取絲的形狀的情況下，可以在絲的各不同位 置處固定用于捕獲不同目標物質的物質。在BIST的情況下，載體采取球（微珠）的形狀。
[0039] 球（微珠）的大小為1mm左右，可以為塑料、陶瓷等材質的物體，這樣的球（微珠） 記載于日本特開2000-346842號公報、日本特表平14-534657號公報等。
[0040] 磁性微珠的大小為幾十μ m，可以通過使鐵粉等與塑料、陶瓷等混合進行磁化而 成。這樣的磁性微珠記載于日本特開平8-62224號公報（專利第3115501號說明書）、國際 公開W096/29602小冊子、國際公開W097/44671小冊子等。
[0041] 絲（線）的大小為直徑0.1 mm左右，可以為樹脂系的材質，這樣的絲記載于日本特 開2006-214759號公報、國際公開W001/53831小冊子、國際公開W02003/7901小冊子等。
[0042] 載體適合1維或2維地配置。載體1維地配置是指，用于確定觀測到的發(fā)光信號源 自哪個載體所需要的位置信息是1維的狀態(tài)，例如，BIST中，可以說載體（微珠）是1維地 配置的。載體2維地配置是指，用于確定觀測到的發(fā)光信號源自哪個載體所需要的位置信 息是2維的狀態(tài)，例如，在板上以單層鋪滿載體的測定試劑盒可以說載體是2維地配置的。
[0043] 用于捕獲目標物質的物質可以通過共價鍵、化學吸附、物理吸附、電相互作用