卡那霉素、紅霉素、林可霉素三合一金標(biāo)微孔試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品（如牛奶等） 中卡那霉素、紅霉素、林可霉素含量的卡那霉素、紅霉素、林可霉素二啟金標(biāo)微孔試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素（Kanamycin)屬于氨基糖式類抗生素，對(duì)各種革蘭氏陰性細(xì)菌及革蘭氏 陽性細(xì)菌均有良好的抗菌作用，適用于治療細(xì)菌性痢疾或其他細(xì)菌性腸道感染，是我國(guó)畜 牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中常用的獸藥之一，也常被添加到飼料中促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。雖然卡那 霉素具有良好的藥理作用，但是其耳毒性和腎毒性作用也較為嚴(yán)重，因此其在動(dòng)物性產(chǎn)品 中的殘留問題也日益引起人們的關(guān)注。為嚴(yán)格控制卡那霉素在動(dòng)物源食品中的殘留，保 證人類的身體健康，歐盟和日本均對(duì)牛奶中卡那霉素的最高殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，分別為 150 μ g/kg 和 400 μ g/kg。
[0003] 紅霉素（Erythromycin)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,抗菌譜與青霉素近似,臨床上主 要用于耐青霉素及對(duì)青霉素過敏的金黃色葡萄球菌感染，也用于溶血性鏈球菌及肺炎球菌 所致的呼吸道肺炎、軍團(tuán)菌肺炎、支原體肺炎、皮膚軟組織感染等，此外紅霉素與白喉抗毒 素聯(lián)用對(duì)白喉療效顯著。紅霉素臨床濫用可導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)、肝臟損害、過敏反應(yīng)、心血管 反應(yīng)等副作用，并可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，其在動(dòng)物性食品中的殘留會(huì)嚴(yán)重影響人類健康。 歐盟和我國(guó)對(duì)紅霉素的殘留限量均有規(guī)定，其中我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中規(guī)定紅霉素在奶 中最大殘留限量為40 μ g/kg。
[0004] 林可霉素（Lincomycin)為一般系抑菌劑，在高濃度下對(duì)高度敏感細(xì)菌具有殺菌作 用。林可霉素口服適用于葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎球菌及厭氧菌所致的呼吸道感染、 皮膚軟組織感染和厭氧菌所致的腹腔感染等。臨床廣泛應(yīng)用可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。因此 有必要對(duì)動(dòng)物性食品中的林可霉素的殘留進(jìn)行檢測(cè)。歐盟和我國(guó)均規(guī)定林可霉素在牛奶中 的最大殘留限量為150 μ g/kg。
[0005] 現(xiàn)有的卡那霉素、紅霉素和林可霉素檢測(cè)方法多為儀器方法，如HPLC、HPLC-MS/ MS、GC-MS/MS等，這些儀器方法靈敏度高，可以提供定量及確證分析，但是前處理復(fù)雜，需要 昂貴的儀器，且對(duì)操作人員有專業(yè)的要求，不適合基層檢測(cè)分析。此外，在實(shí)際養(yǎng)殖過程中， 動(dòng)物可能同時(shí)使用了多種抗生素，現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)一般僅能檢測(cè)一種或一類藥物，目前尚無 可同時(shí)檢測(cè)卡那霉素、紅霉素和林可霉素殘留量的產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種卡那霉素、紅霉素、林可霉素三合一金標(biāo)微孔試紙條。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)卡那霉素、紅霉素和林可霉素的試劑盒，包括至少具 有一個(gè)樣品槽的樣品板和至少一個(gè)試紙條；
[0008] 所述樣品槽的底部附著有卡那霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物、紅霉素特異性抗 體的膠體金標(biāo)記物和林可霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物；
[0009] 所述試紙條包括底板1、反應(yīng)膜2、樣品吸收墊3和吸水墊4 ;所述樣品吸收墊、所 述反應(yīng)膜和所述吸水墊依次附著于所述底板上，所述樣品吸收墊的末端與所述反應(yīng)膜的始 端相連，所述反應(yīng)膜的末端與所述吸水墊的始端相連；所述反應(yīng)膜上由始端至末端依次具 有T 3線、T2線、T1線和C線，所述T3線、T2線、T 1線和C線均與所述反應(yīng)膜的軸線垂直；所述 T3線、T2線和T 1線上分別包被如下三種偶聯(lián)物(三種偶聯(lián)物可任意排序）：林可霉素-載體 蛋白偶聯(lián)物、紅霉素-載體蛋白偶聯(lián)物、卡那霉素-載體蛋白偶聯(lián)物；所述C線上包被可與 卡那霉素特異性抗體和/或紅霉素特異性抗體和/或林可霉素特異性抗體結(jié)合的抗抗體。
[0010] 所述卡那霉素特異性抗體可為卡那霉素單克隆抗體或卡那霉素多克隆抗體。所述 紅霉素特異性抗體可為紅霉素單克隆抗體或紅霉素多克隆抗體。所述林可霉素特異性抗體 可為林可霉素單克隆抗體或林可霉素多克隆抗體。所述卡那霉素單克隆抗體具體可為卡那 霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株KANA-2B1ICGMCC No. 8403分泌的單克隆抗體。所述紅霉素單 克隆抗體具體可為紅霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株ERM-3F1CGMCC No. 8402分泌的單克隆 抗體。所述林可霉素單克隆抗體具體可為林可霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株LIN-6D2CGMCC No. 8405分泌的單克隆抗體。
[0011] 任一所述的載體蛋白可為牛血清白蛋白、雞卵白蛋白或人血清白蛋白。
[0012] 所述卡那霉素-載體蛋白偶聯(lián)物中，所述載體蛋白具體可為BSA，卡那霉素與BSA 的摩爾結(jié)合比具體可為9:1。所述紅霉素-載體蛋白偶聯(lián)物中，所述載體蛋白具體可為0VA， 紅霉素與OVA的摩爾結(jié)合比具體可為8:1。所述林可霉素-載體蛋白偶聯(lián)物中，所述載體蛋 白具體可為0VA，林可霉素與OVA的摩爾結(jié)合比具體可為10:1。
[0013] 所述卡那霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法具體如下：
[0014] (1)稱取50mg卡那霉素原料藥，溶于4. Iml碳酸鹽緩沖液（ρΗ9· 5、0· 1M);
[0015] (2)稱取 70mg BSA，溶于 5ml 碳酸鹽緩沖液（ρΗ9· 5、0· 1Μ);
[0016] (3)將步驟（1)得到的卡那霉素溶液加到步驟（2)得到的BSA溶液中并混勻，然后 加入0· 9mll% (體積比）戊二醛水溶液并攪拌I. 5h，然后滴加NaBH4溶液（6mg NaBH4用Iml 純水溶解)并反應(yīng)2h，然后用PBS緩沖液（pH7. 2、0. 01M)進(jìn)行透析，然后4500rpm離心6min 并取上清液(卡那霉素-載體蛋白偶聯(lián)物溶液)。
[0017] 所述紅霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法具體如下：
[0018] (1)稱取IOOmg紅霉素原料藥，溶于6ml無水乙醇，稱為A液；
[0019] (2)稱取羧甲基羥胺半鹽酸鹽44mg，溶于2ml水，用IM碳酸氫鈉水溶液調(diào)pH=5-6， 稱為B液；
[0020] (3)將B液加到A液中，然后50°C恒溫水浴中攪拌反應(yīng)5h，冷卻到室溫，然后加水 淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取2次，合并2次萃取的二氯甲烷層，加入無水硫酸鈉振搖后靜置 過夜，然后過濾并收集濾液，減壓旋蒸，得到干物質(zhì)；
[0021] (4)取88mg步驟（3)得到的干物質(zhì)，溶于6ml DMF中，然后在冰水浴下加入24 μ L 三正丁胺，混勻后再加入24 μ L氯甲酸異丁酯，冰浴下攪拌反應(yīng)3h ;
[0022] (5)稱取30mg 0VA，溶于3ml0.1 M的碳酸鈉水溶液；
[0023] (6)取步驟（4)得到的溶液，在冰水浴環(huán)境下加到步驟（5)得到的OVA溶液中，然 后4°C攪拌3h，然后用PBS緩沖液（pH7. 2、0. 01M)進(jìn)行透析，然后4500rpm離心6min并取 上清液(紅霉素-載體蛋白偶聯(lián)物溶液)。
[0024] 所述林可霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法具體如下：
[0025] (1)取126mg鹽酸林可霉素原料藥，溶于I. 5ml蒸饋水；
[0026] (2 )取53mg高碘酸鈉，溶于0· 5ml蒸餾水；
[0027] (3)將步驟（2)得到的高碘酸鈉溶液加到步驟（1)得到的溶液中并反應(yīng)20min，然 后加入17 μ 1乙二胺并反應(yīng)2h，然后滴加NaBH4溶液（2mg NaBH4用Iml純水溶解）并反應(yīng) IOh ；
[0028] (4)稱取60mg 0VA，溶于6ml的蒸餾水；
[0029] (5)取580 μ 1步驟（3)得到的溶液，加入步驟（4)得到的OVA溶液，然后加入 500 μ 12. 5% (體積比)的戊二醛水溶液并攪拌3. 5h，然后加入NaBH4溶液（4mg NaBH4用2ml 純水溶解)并攪拌24h，然后用PBS緩沖液（pH7. 2、0. 01M)進(jìn)行透析，然后4500rpm離心5min 并取上清液(林可霉素-載體蛋白偶聯(lián)物溶液)。
[0030] 卡那霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物、紅霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物和林可 霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物的制備方法均如下：
[0031] (1)在沸騰的IOOmL的0. 01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%檸檬酸三鈉 水溶液，獲得終濃度為〇. 01%的膠體金溶液(膠體金的直徑為15-20nm);
[0032] (2)用0· lmol/L的K2CO3水溶液調(diào)膠體金溶液的pH至8. 5 ;
[0033] (3)將lyL10mg/mL的特異性抗體溶液(所述卡那霉素特異性抗體溶液、所述 紅霉素特異抗體溶液或所述林可霉素特異抗體溶液）加入ImL步驟（2)得到的膠體金溶 液中并攪拌30分鐘，然后加入lOyl^Og/lOOml的BSA水溶液并攪拌15min，然后加入 10 μ L10g/100ml的PEG8cicici水溶液并攪拌15分鐘，然后4°C、4000g離心15min取上清液，然 后4°C、12000g離心20分鐘取沉淀；
[0034] (4)用PBS緩沖液（pH7. 2、2mM)溶解步驟（3)得到的沉淀，4°C、12000g離心20分 鐘取沉淀，然后用200 μ L含lg/100ml BSA的PBS緩沖液（pH7. 2、20mM)重懸沉淀，得到特 異性抗體的膠體金標(biāo)記物。
[0035] 所述卡那霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物、所述紅霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記 物和所述林可霉素特異性抗體的膠體金標(biāo)記物均可以凍干品的形式附著于于所述樣品槽 底部。這樣做的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)化樣品前處理過程，提高