一種基于局域表面等離體共振的有機磷檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于局域表面等離體共振的有機磷 檢測方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 有機磷化合物一般指化學分子式中含有碳一磷鍵的有機氣體或含有機官能團的 磷酸酯類化合物，一般包括各種有機磷農(nóng)藥和生化戰(zhàn)場上常用的神經(jīng)毒氣。有機磷化合物 對生物體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶（Acetyl-cholinesterase, AChE)具有強烈的抑制作用，能引起 乙酰膽堿(Acetylcholine, ACh)蓄積，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，使生物體喪失機能直至 死亡，是一種高效的生物毒劑。隨著有機磷化合物在當今社會中的廣泛應用，其對環(huán)境、生 物圈乃至人類生命的負面影響也同時受到了世界各國科研工作者的密切關(guān)注。因此，有機 磷化合物的識別與檢測技術(shù)已成為各國研究的重點，對環(huán)境監(jiān)測及國防安全具有重要的意 義。
[0004] 目前有機磷化合物的檢測與識別主要是通過室內(nèi)大型分析檢測儀器進行的，如色 譜分析儀，紅外光譜儀、色一質(zhì)聯(lián)用分析儀等。此類檢測設(shè)備體積大、分析過程復雜、便攜性 差，不適于對有機磷化合物的戶外便攜式在線檢測。
[0005] 近年來，隨著等離子體光學研究的深入，基于金屬納米結(jié)構(gòu)的局域表面等離子體 共振（LSPR)有機磷傳感方法因其易于實現(xiàn)便攜式、快速響應、多功能集成等優(yōu)點得到了應 用。如圖1所示，當金屬納米結(jié)構(gòu)101的尺寸遠小于入射光的波長時，入射光的電場分量使 得金屬納米結(jié)構(gòu)101上的電荷發(fā)生極化，極化產(chǎn)生的正負離子隨著入射電場的變化而發(fā)生 集體振動,形成電子云102,從而產(chǎn)生極化電場103。當這種振蕩頻率與入射光頻率相一致 時，便發(fā)生LSPR，使得激發(fā)頻率的入射光被吸收，獲得LSPR譜。LSPR圖譜與它附近所處的 環(huán)境折射率有關(guān)，因此在生物分子檢測、有機氣體檢測等方面具有重要的應用。
[0006] 目前所采用的LSPR傳感技術(shù)如圖2所示，首先，在潔凈的玻璃基底201上制作金 屬納米結(jié)構(gòu)202 ;其次，在金屬納米結(jié)構(gòu)202表面結(jié)合一層與待測對象對應的敏感材料203， 如化學敏感材料、生物酶、生物抗體等；接著，敏感材料203將吸附環(huán)境中游離的待測分子 204,改變金屬納米結(jié)構(gòu)202周圍的折射率；最后利用圖3所示的裝置對LSPR圖譜進行檢 測。光源301發(fā)出的可見或紅外光，經(jīng)過光纖302和聚焦透鏡303照射到傳感芯片304上， 透射光經(jīng)聚焦透鏡303和光纖302進入紅外-可見光譜儀305,由光譜儀305探測得到的光 譜信息由數(shù)據(jù)線306進入計算機307,獲得LSPR圖譜308。分別檢測吸附待測分子204前 后的LSPR圖譜，可獲得待測對象的存在和濃度信息。
[0007] 可見，目前所采用的LSPR傳感技術(shù)需要在結(jié)合敏感材料之前單獨制作高效可控 的金屬納米結(jié)構(gòu)。雖然目前常用的金屬納米結(jié)構(gòu)制作方法如化學合成法、自組裝法以及電 子束/離子束直寫法等已得到廣泛研究，但制作金屬納米結(jié)構(gòu)的步驟仍然非常復雜，且價 格昂貴，不符合目前集成化低成本傳感器的發(fā)展方向。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于局域表面等離子體共振的有機磷檢 測方法，無需在基片結(jié)合敏感材料之前在其上制作一層金屬納米結(jié)構(gòu)，直接利用檢測過程 中的化學反應生成金屬納米顆粒，并利用有機磷的存在和濃度調(diào)控所生成的金屬納米顆粒 的量，簡化了檢測過程，重復性穩(wěn)定，準確率高，便攜帶使用，降低成本。
[0010] 解決以上問題的本發(fā)明中的一種基于局域表面等離子體共振的有機磷檢測方法， 其特征在于：包括以下步驟： (1) 制備酶傳感芯片：清潔玻璃基底，將乙酰膽堿酯酶(AChE)固定在玻璃基底上成酶 傳感芯片； (2) 將有機磷樣品滴涂到酶傳感芯片上，形成AChE活性被部分抑制的有機磷抑制酶 膜； (3) 將步驟（2)中處理后的傳感芯片室溫下浸入到硫代乙酰膽堿（ATCh)和氯金酸 (HAuCl4)混合液中反應，反應時間為0.5 ~2.5h，在傳感芯片上獲得一定量的金納米顆粒。
[0011] (4)以可見光或紅外光照射步驟（3)中處理后的傳感芯片，再用光譜測試儀探測透 射光，得到測量LSPR圖譜； (5)將LSPR圖譜與基準LSPR圖譜進行比較，根據(jù)吸收峰是否有偏移，確定所述有機磷 樣品中是否含有有機磷，并根據(jù)吸收峰的位移量，確定有機磷的濃度，當吸收峰向右有偏移 確定樣品中含有有機磷，偏移量越大，有機磷濃度越高。
[0012] 所述步驟（1)中的玻璃基底為K9玻璃。
[0013] 所述步驟（2)硫代乙酰膽堿和氯金酸混合液中含有摩爾濃度的硫代乙酰膽堿 0. 5~20mM，，質(zhì)量百分比的氯金酸0. 01~0. 5%，其余為磷酸鹽緩沖液（PBS)。
[0014] 優(yōu)化摩爾濃度硫代乙酰膽堿為1~10禮，質(zhì)量百分比氯金酸為0. 05~0. 2%。
[0015] 所述步驟（1)中的固定方法為吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法或交聯(lián)法。
[0016] 所述吸附法包括以下步驟： 將乙酰膽堿酯酶（AChE)的PBS溶液滴到玻璃基底上，4°C下靜置Ih ;再用磷酸鹽緩沖液 沖洗2~4次，室溫晾干或吹干。
[0017] PBS溶液指的是磷酸鹽緩沖液，是生物化學實驗中最常用的一種緩沖液，一般濃度 為（λ 01~(λ 1M，PH 值為 7~8。
[0018] 滴加速度快慢或滴加用量多少根據(jù)玻璃基底面積來定，如玻璃基底面積大些，可 以多滴一些，也可以速度上快些。
[0019] 沖洗可為把傳感芯片浸入到PBS溶液中，再拿出來后再浸入PBS溶液中，反復操作 作即可，目的把沒固定上的酶沖洗掉。室溫晾干或吹干是干燥傳感芯片，使其上沒有水分了 為止。
[0020] 所述交聯(lián)法為戊二醛交聯(lián)法或SUlfo-LC-SPDP交聯(lián)法。（SUlfo-LC-SPDP是產(chǎn)品名 稱，沒有中文譯文，sulfo-LC-SPDP是由美國pierce公司生產(chǎn)。） 所述戊二醛交聯(lián)法包括以下步驟： 將乙酰膽堿酯酶、質(zhì)量百分比的戊二醛0. 1~1〇%和牛血清蛋白0. 1~1〇%的混合溶液滴 到玻璃基底上，4°C下靜置8~12h ;再用質(zhì)量百分比的甘氨酸1%的磷酸鹽緩沖液沖洗2~4 次，室溫晾干或吹干。
[0021] 優(yōu)化方案中質(zhì)量百分比的戊二醛為1~1〇%和牛血清蛋白為1~1〇%。
[0022] 滴加到芯片表面后經(jīng)過一些時間，一部分的酶被固定到芯片上，再用甘氨酸溶液 將多余的物質(zhì)，如未固定的酶，沒有參加反應的戊二醛和牛血清蛋白等洗掉