一種霧霾污染物毒性評價方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境毒理學領(lǐng)域，涉及一種霧霾污染物毒性評價方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，中國霧霾事件頻發(fā)。研究表明，霧霾與呼吸道疾病呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢，上海PM2.5每升高10ug/m3，當天和滯后Id (IagO?I)呼吸系統(tǒng)疾病死亡率升高0.95%。霧霾的主要組成為二氧化硫、氮氧化物和可吸入顆粒物。其中可吸入顆粒物是粒徑介于2.5和10微米的顆粒物，這些顆粒物可以進入上呼吸道，尤其是粒徑小于或等于2.5微米的顆粒物大部分可通過人體支氣管，直達肺部，甚至進入人體血液循環(huán)，從而導致呼吸道疾病的發(fā)生。因此嚴重的霧霾天氣條件下，霧霾中的細顆粒物會導致嚴重的呼吸道疾病，甚至誘發(fā)肺炎及人體死亡。
[0003]然而目前對于霧霾中顆粒物的毒性研究缺少基礎(chǔ)試驗研究及理論支持。其主要原因霧霾成分復雜，尤其是細顆粒物難提取，目前顆粒物的提取主要采用無菌水超聲法，該方法存在以下三個缺陷:1.排除了 PM2.5中可溶性顆粒物；2.顆粒物提取過程中可能存在凝結(jié)，造成粒徑改變；3.暴露過程為一次性暴露，與實際蓄積性暴露存在較大區(qū)別。上述缺陷造成目前對細顆粒物的毒性評價尚不全面，亟待完善的大氣顆粒物毒性評價方法。
[0004]經(jīng)查閱，與大氣顆粒物毒性評價方法相似的專利只有“一種卷煙煙氣總粒相物生物學評價的MTT細胞毒性試驗方法”(專利號:201310013300.9)，該評價主要涉及MTT法，該方法雖然是傳統(tǒng)經(jīng)典毒性檢測方法，但仍存在以下缺陷:1.進行MTT試驗前，要確定生長曲線以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿；2.MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞絕對數(shù)，數(shù)據(jù)含義較單一。相比之下，本發(fā)明所采用的ECIS技術(shù)的靈活性更大，而且獲得的細胞動態(tài)行為的實時變化，數(shù)據(jù)含義更為豐富。
[0005]本發(fā)明根據(jù)目前霧霾污染物毒性評價的方法所存在的缺陷進行改進。采用細胞培養(yǎng)基中大氣顆粒物采集裝置對細胞進行模擬人體暴露試驗，避免大氣顆粒物提取過程中導致的污染物缺失，確保評價結(jié)果的真實性。采用ECIS技術(shù)，對細胞活性變化進行實時監(jiān)測，獲得更全面的數(shù)據(jù)信息，確保全面評價霧霾顆粒物的毒效應。此外，本方法可排除個體差異對實驗的影響，且不涉及倫理問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有大氣顆粒物細胞毒性評價方法的不足，提出一種霧霾污染物毒性評價方法，該方法可彌補現(xiàn)有評價方法操作難度大，大氣細顆粒物提取過程存在損失，評價內(nèi)容單一，準確度低等缺點。該方法具有操作簡單，暴露方式跟接近實際，暴露污染物無缺失，檢測內(nèi)容豐富，能更準確反映大氣中細顆粒物對細胞的毒效應。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明方法包括以下步驟:
步驟(I).將RTE大鼠氣管上皮細胞系接種到含胎牛血清的F12培養(yǎng)液中，置于37°C、無菌細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4天；將培養(yǎng)好的細胞接種至培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種5 X 16?8X10 6個大鼠氣管上皮細胞；
所述的含胎牛血清的F12培養(yǎng)液中含有體積含量為3?7 %的胎牛血清，優(yōu)選為體積含量為5 % ；
所述的培養(yǎng)皿直徑為5cm，高度為1cm，使用前需進行滅菌；
步驟(2).然后步驟(I)細胞培養(yǎng)皿置于放置在霧霾區(qū)域的細胞培養(yǎng)基中大氣顆粒物采集裝置中，在細胞正常生長所需的溫度下對細胞進行染毒；
所述的染毒方式(即暴露方式)采用模擬人體呼吸，空氣流量可根據(jù)試驗所需的肺活量進行設(shè)定；染毒時間即為細胞在裝置中的暴露時間，可根據(jù)試驗要求進行設(shè)定；細胞正常生長所需的溫度為35?37°C ;
步驟(3).在步驟(2)進行的同時對該霧霾區(qū)域進行顆粒物收集，采用寬范圍粒子譜法檢測顆粒物粒徑、采用原子吸收法檢測重金屬濃度、采用氣相質(zhì)譜法有機污染物濃度、采用紫外光度法檢測O3、離子色譜法檢測硫化物，并采用國標重量法檢測空氣中PMlO和PM2.5濃度，即為霧霾顆粒物檢測結(jié)果；
所述的顆粒物收集時間與染毒過程中的暴露時間一致；
步驟(4).接著把步驟(2)染毒好的細胞放入細胞阻抗測量儀，該儀器采用ECIS技術(shù)，通過微電流傳感器實時、定量、非介入性的測量由于細胞貼壁狀態(tài)、位置、形態(tài)等方面發(fā)生的電流變化，從而檢測其細胞恢復能力，趨化遷移能力和抵御侵潤能力，得到此時霧霾區(qū)域的細胞活性檢測結(jié)果；
步驟(5).根據(jù)步驟(4)得到細胞活性檢測結(jié)果與步驟(3)得到的霧霾顆粒物檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，綜合評價比較不同霧霾區(qū)域下不同種類霧霾顆粒物對大鼠氣管上皮細胞的毒效應。
[0008]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
(1)本發(fā)明避免了大氣顆粒物提取過程中導致的污染物缺失，從而造成評價不全面；
(2)本發(fā)明相比傳統(tǒng)毒性評價方法，本方法中所使用的ECIS技術(shù)具有更大的靈活性，獲得的數(shù)據(jù)是實時變化的，含義更為豐富；
(3)本發(fā)明取材方便，可排除個體差異對實驗的影響，且不涉及倫理問題。
【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明方法的流程圖；
圖2為本發(fā)明提及的細胞培養(yǎng)基中大氣顆粒物采集裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3為本發(fā)明實施例細胞恢復能力分析圖；
圖4為本發(fā)明實施例細胞趨化遷移能力圖；
圖5為本發(fā)明實施例細胞抵御侵潤能力圖。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的分析。
[0011]如圖所示，本發(fā)明方法包括以下步驟:
步驟(I).將RTE大鼠氣管上皮細胞系接種到含胎牛血清的F12培養(yǎng)液中，置于37°C、無菌細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4天；將培養(yǎng)好的細胞接種至培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種5 X 16?8X10 6個大鼠氣管上皮細胞；
所述的含胎牛血清的F12培養(yǎng)液中含有體積含量為3?7 %的胎牛血清，優(yōu)選為體積含量為5 % ；
所述的培養(yǎng)皿直徑為5cm，高度為1cm，使用前需進行滅菌；
步驟(2).然后步驟(I)細胞培養(yǎng)皿置于放置在霧霾區(qū)域的細胞培養(yǎng)基中大氣顆粒物采集裝置中，在細胞正常生長所需的溫度下對細胞進行染毒；
所述的染毒方式(即暴露方式)采用模擬人體呼吸，染毒時間即為細胞在裝置中的暴露時間，可根據(jù)試驗要求進行設(shè)定；
本實施例假設(shè)選取北京作為霧霾區(qū)域，并在北京18個區(qū)各設(shè)置一個細胞染毒點。
[0012]如圖2所示，所述的細胞培養(yǎng)基中大氣顆粒物采集裝置，包括筒體、顆粒物過濾系統(tǒng)、顆粒物除菌系統(tǒng)和細胞暴露系統(tǒng)；所述的筒體為頂部開放、底部封閉的圓筒形，內(nèi)壁用兩塊隔板分隔成上層、中層和下層；所述的顆粒物過濾系統(tǒng)包括膜固定架和濾膜；所述膜固定架的底部封閉，整體嵌套在筒體的內(nèi)壁上層；多張濾膜分層放置在膜固定架上；所述的顆粒物除菌系統(tǒng)包括鐵環(huán)、紫外滅菌燈和導氣軟管；上部隔板的底部和下部隔板的頂部均固定有紫外滅菌燈；所述的導氣軟管設(shè)置在筒體中層，整體沿豎直方向呈螺旋狀，并通過鐵環(huán)固定；導氣軟管的上端穿過上部的隔板并伸入膜固定架底部，下端穿過下部的隔板；導氣軟管的下端設(shè)有流量計和可調(diào)泵；所述的細胞暴露系統(tǒng)包括溫度測定控制系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和U型管；筒體的下層側(cè)壁開設(shè)有細胞培養(yǎng)皿進口，門板蓋住細胞培養(yǎng)皿進口 ；所述的U型管整體設(shè)置在筒體下層，且外端伸出筒體外；導氣軟管的下端及U型管伸出筒體外的一端均設(shè)有單向閥；所述的溫度測定控制系統(tǒng)和加熱系統(tǒng)均設(shè)置在筒體下層，組成控溫系統(tǒng)；所述的溫度測定控制系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、可調(diào)泵和紫外滅菌燈均與定時器串聯(lián)后接入總電路。
[0013]所述的染毒過程如下:<