專利名稱：肺炎衣原體抗原,制備該抗原的方法,利用該抗原測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷肺炎衣原體感染的肺炎衣原體抗原，制備該抗原的方法，用該抗原測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法及試劑。
背景技術(shù)：
衣原體是專性的細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在宿主細(xì)胞內(nèi)生存。它的生長(zhǎng)周期是獨(dú)特的，形態(tài)學(xué)上位于細(xì)胞外面的衣原體原生小體(以后稱作EB)被攝取到細(xì)胞內(nèi)形成空泡包涵體，然后轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)狀小體(以后稱作RB)。RB具有繁殖能力，但缺少感染能力，并且在細(xì)胞內(nèi)繁殖的RB很快轉(zhuǎn)變?yōu)镋B，它穿破包涵體，破壞細(xì)胞壁，到達(dá)細(xì)胞外。EB缺乏繁殖能力但具有感染能力。目前證實(shí)有四種衣原體(沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體，肺炎衣原體和貓心衣原體)，已知其中的肺炎衣原體通過空氣傳播感染人體。
最近幾年，肺炎衣原體作為肺炎、支氣管炎、急性上呼吸道感染等呼吸系統(tǒng)感染的致病微生物而引起廣泛的注意。在世界不同地方所進(jìn)行的血清流行病學(xué)研究表明，抗肺炎衣原體抗體的發(fā)生率，在歐洲和美國為40-50％，在臺(tái)灣、巴拿馬、伊朗等為60％或60％以上，在日本為50-60％。由于肺炎衣原體感染的實(shí)際情況變得更加顯而易見，因此增加了人們對(duì)感染的關(guān)注。
診斷衣原體感染最靈敏的血清學(xué)方法是Wang和Grayston建立的間接微量免疫熒光試驗(yàn)(微量IF試驗(yàn))(衣原體試劑引起的沙眼和相關(guān)疾病，醫(yī)學(xué)摘要，阿姆斯特丹，pp.273-288，1971)。但是由于微量IF試驗(yàn)的步驟復(fù)雜，臨床實(shí)驗(yàn)室中還沒用它作為診斷方法。而且，標(biāo)準(zhǔn)的微量IF試驗(yàn)需要純化的衣原體EB。為了進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，微量IF試驗(yàn)要求所鑒定微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整。因此不能應(yīng)用形態(tài)或結(jié)構(gòu)改變了的EB或破壞了的EB。但是由于EB具有感染能力和毒性，應(yīng)用完整的EB作抗原物質(zhì)需要特殊的處理使機(jī)體能防御感染。因此可應(yīng)用甲醛，丙酮等固定劑處理的EB作抗原。
另一方面，近來建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有這樣的優(yōu)越性，即它可以簡(jiǎn)單、便利地處理大量樣品。有應(yīng)用ELISA測(cè)定抗衣原體抗體的方法的報(bào)道，大多數(shù)的方法應(yīng)用完整的衣原體EB作抗原。因此，由于應(yīng)用了不完全純化的抗原而導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的存在。這大多由衣原體的復(fù)合抗原性引起。關(guān)于衣原體的抗原性，據(jù)信有屬特異性抗原，種特異性抗原和biobar特異性抗原。
衣原體的代表性屬特異性抗原為脂多糖(以后稱為L(zhǎng)PS)，它具有與來源于某些腸細(xì)菌Re突變體LPS共同的抗原。
代表性的種特異性或biobar特異性的抗原為衣原體的主要外膜蛋白(以后稱作MOMP)，該蛋白占衣原體外膜蛋白的60％左右。但是，MOMP也具有屬特異的抗原性(Collett等，美國微生物協(xié)會(huì)年會(huì)，華盛頓特區(qū)，摘要號(hào)D-159，1986)。
除MOMP外的衣原體外膜抗原主要是屬特異性抗原，但也存在一些種特異的抗原性。例如Iijima等報(bào)道，用肺炎衣原體的EB進(jìn)行免疫印跡測(cè)定，結(jié)果顯示肺炎衣原體的分子量(MW)為40K道爾頓的MOMP是屬特異性的，分子量為43K道爾頓、46K道爾頓和53K道爾頓的蛋白質(zhì)是種特異性的，另外分子量為98K道爾頓的蛋白質(zhì)可能是種特異性的(Y.Iijima等，臨床微生物學(xué)雜志，p 583-588(1994))。
如上所述，衣原體的抗原性很復(fù)雜，同屬的衣原體在不同種間其抗原性存在著明顯的差異。因此，盡管已經(jīng)建立測(cè)定抗沙眼衣原體抗體的方法(日本未審查專利出版物Hei4-297871)，但由于肺炎衣原體和沙眼衣原體的抗原性彼此大不相同，該方法不能簡(jiǎn)單地以種特異性的方式測(cè)定肺炎衣原體。感染有肺炎衣原體的個(gè)體攜帶的抗衣原體抗體也表現(xiàn)出與衣原體復(fù)雜的抗原性相一致的多樣性。盡管這種模式隨被感染的個(gè)體而變化，但應(yīng)用EB本身作抗原可產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，因此用它進(jìn)行特異的和高度精確的測(cè)定是困難的。
發(fā)明公開本發(fā)明的第一目的是提供肺炎衣原體抗原，該抗原具有高度的種特異性，很少有困擾臨床的假陰性，假陽性率低，有很好的重現(xiàn)性。
本發(fā)明的第二目的是提供一種制備肺炎衣原體抗原的方法，該抗原具有高度的特異性，很少有困擾臨床的假陰性，假陽性率低，并且有很好的重現(xiàn)性。
本發(fā)明的第三目的是提供一種測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，該方法具有高度的種特異性，很少有困擾臨床的假陰性，假陽性率低，允許簡(jiǎn)單的測(cè)定和樣品的簡(jiǎn)單收集，能反映樣品供體的臨床情況，并且具有高度靈敏性。
本發(fā)明的第四目的是提供測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，它可提供高度的種特異性，很少有困擾臨床的假陰性，假陽性率低，允許簡(jiǎn)單的測(cè)定，并且有高度的靈敏性。
本發(fā)明的主題如下(1)一種肺炎衣原體抗原，它包括從肺炎衣原體外膜而來的蛋白質(zhì)。
(2)上面(1)中的肺炎衣原體抗原，它與抗沙眼衣原體抗體或抗鸚鵡熱衣原體抗體基本上不發(fā)生非特異性反應(yīng)。
(3)上面(1)或(2)中的肺炎衣原體抗原，其中來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)，至少包括分子量為大約43K道爾頓，46K道爾頓和53K道爾頓這樣三種蛋白質(zhì)中的一種。
(4)上面(1)-(3)中的肺炎衣原體抗原，其中來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)包括分子量為大約43K道爾頓，46K道爾頓，53K道爾頓的三種蛋白質(zhì)。
(5)一種制備肺炎衣原體抗原的方法，包括用離子型去污劑溶解肺火衣原體原生小體的胞液和胞質(zhì)的膜，然后移去溶解的部分，得到殘余部分。
(6)一種測(cè)定抗肺火衣原體抗體的方法，包括應(yīng)用上面(1)-(4)中的任意肺炎衣原體抗原。
(7)上面(6)中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，包括把(1)-(4)中的一種肺炎衣原體抗原固定到固相載體上，使固相載體與待測(cè)樣品接觸，使所得抗原-抗體復(fù)合物與標(biāo)記的抗樣品中抗體的抗體接觸，測(cè)定結(jié)合的或未結(jié)合的標(biāo)記的抗體數(shù)量，根據(jù)測(cè)定值來確定樣品中的抗肺炎衣原體抗體。
(8)上面(7)中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中待測(cè)的樣品是人的淚液，咽部化驗(yàn)標(biāo)本或人的血清。
(9)上面(7)或(8)中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中標(biāo)記的抗體是標(biāo)記的抗人IgG抗體，標(biāo)記的抗人IgA抗體或標(biāo)記的抗人IgM抗體。
(10)上面(7)-(9)中任意測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中標(biāo)記的抗體是酶標(biāo)記的抗體。
(11)一種測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，它包含上面(1)-(4)中任意肺炎衣原體抗原。
(12)上面(11)中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，它包含固定在固相載體上的固定化抗原和與待測(cè)抗體反應(yīng)的標(biāo)記的抗體。
(13)上面(12)中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中的固相載體是聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板。
(14)上面(12)或(13)中用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中標(biāo)記的抗體是酶標(biāo)記的抗體。
(15)上面(14)中用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中酶標(biāo)記的抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體或辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
肺炎衣原體的外膜是不包含胞質(zhì)和胞質(zhì)膜的肺炎衣原體細(xì)胞壁，主要由蛋白質(zhì)和脂類組成。
本發(fā)明的肺炎衣原體抗原包括來源于上述肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)。
在肺炎衣原體抗原中，優(yōu)選那些與沙眼衣原體或鸚鵡熱衣原體基本上不發(fā)生非特異性反應(yīng)的抗原。因?yàn)樗鼈兒苌儆欣_臨床的假陰性或假陽性。本文所用術(shù)語“基本上不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)物”指沒有或幾乎沒有非特異性反應(yīng)。
來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)為這樣一些蛋白質(zhì)，它們的分子量為大約30K道爾頓、大約37K道爾頓、大約40K道爾頓、大約43K道爾頓、大約46K道爾頓、大約53K道爾頓、大約60K道爾頓和大約98K道爾頓。
對(duì)于本發(fā)明的肺炎衣原體抗原，在來源于上述肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)中優(yōu)選對(duì)肺炎衣原體具有種特異性的，分子量為大約43K道爾頓，大約46K道爾頓，大約53K道爾頓的蛋白質(zhì)中的至少一種。
對(duì)于本發(fā)明的肺炎衣原體抗原，在來源于上述肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)中更優(yōu)選包含分子量為大約43K道爾頓，大約46K道爾頓，大約53K道爾頓這三種蛋白質(zhì)的抗原，因?yàn)樗鼈冇泻芎玫膽?yīng)付肺炎衣原體感染者中抗衣原體抗體的多樣性的能力。
另外，對(duì)于本發(fā)明的肺炎衣原體抗原，在來源于上述肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)中優(yōu)選那些除含有分子量為大約43K道爾頓，大約46K道爾頓，大約53K道爾頓的三種蛋白質(zhì)中的至少一種外，還包含有分子量為大約98K道爾頓的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈冇懈玫膽?yīng)付上述多樣性的能力。
下面將解釋本發(fā)明中制備肺炎衣原體抗原的方法。
本發(fā)明的肺炎衣原體抗原可從肺炎衣原體的細(xì)胞團(tuán)中獲得，因?yàn)榉窝滓略w細(xì)胞團(tuán)外的EB可提供具有有利特性的抗原所以優(yōu)選用它作初始物質(zhì)。
下面舉例說明從肺炎衣原體EB中獲得本發(fā)明的肺炎衣原體抗原的方法，其中用離子型去污劑溶解肺炎衣原體EB的胞質(zhì)和胞質(zhì)膜，然后移去溶解的部分以得到殘余部分。因?yàn)樵摲椒苋菀椎禺a(chǎn)生抗原并且獲得的抗原具有良好的抗原性，所以該方法是優(yōu)選的。上述的離子型去污劑優(yōu)選應(yīng)用陰離子肌氨酸去污劑，因?yàn)檫@樣獲得的抗原具有良好的抗原性，特別優(yōu)選Sarcosyl(N-十二烷酰肌氨酸鈉)。另外，用離子型去污劑溶解肺炎衣原體EB的胞質(zhì)和胞質(zhì)膜時(shí)，優(yōu)選應(yīng)用脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(Rnase)進(jìn)行反應(yīng)以溶解并移去核酸。
用離子型去污劑溶解肺炎衣原體EB的胞質(zhì)和胞質(zhì)膜后，移去溶解部分，所獲得的殘余部分主要由肺炎衣原體EB除胞質(zhì)和胞質(zhì)膜之外的細(xì)胞壁組成，即肺炎衣原體的外膜。肺炎衣原體的外膜包含上述分子量為大約30K道爾頓、大約37K道爾頓、大約40K道爾頓、大約43K道爾頓、大約46K道爾頓、大約53K道爾頓、大約60K道爾頓和大約98K道爾頓的蛋白質(zhì)，并且含有微量的其它蛋白質(zhì)。
對(duì)于本發(fā)明的肺炎衣原體抗原，可應(yīng)用肺炎衣原體的部分外膜，即衣原體外膜復(fù)合體(以后稱作COMC)。
另外，對(duì)于本發(fā)明的肺炎衣原體抗原，反應(yīng)產(chǎn)物通過殘余部分與溶解劑反應(yīng)而獲得。對(duì)于溶解劑，這里提到的實(shí)例為十二烷基硫酸鈉(SDS)。獲得的反應(yīng)產(chǎn)物包含上述殘余部分的溶解產(chǎn)物或分解產(chǎn)物。
這些肺炎衣原體抗原具有高度的種特異性，很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性和假陽性。
在這些肺炎衣原體抗原中，優(yōu)選上面提到的主要由肺炎衣原體外膜組成的殘余成分，因?yàn)樗男Ч爸噩F(xiàn)性較好。
只要上述的肺炎衣原體抗原用作部分抗原或全部抗原，用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法并不受限制。
對(duì)于測(cè)定抗體的方法，這里例舉的是優(yōu)選的方法，如應(yīng)用各種標(biāo)記的抗體的夾心型酶促免疫測(cè)定，應(yīng)用乳膠載體顆粒的乳膠凝集法，免疫比濁法等。
下面詳述夾心型免疫測(cè)定。
用本發(fā)明的肺炎衣原體抗原通過夾心型免疫測(cè)定方法檢測(cè)抗肺炎衣原體抗體的方法，其中可用物理或化學(xué)方法把上面的抗原固定在固相載體上，以制備固定化抗原，該固定化抗原與樣品接觸，培養(yǎng)一段時(shí)間，當(dāng)樣品中存在抗肺炎衣原體抗體時(shí)，該抗體與固定化抗原結(jié)合，在載體上形成抗原-抗體復(fù)合物，按需要進(jìn)行洗滌，然后接觸樣品中標(biāo)記的抗體的抗抗體，樣品和標(biāo)記的抗體任選地同時(shí)彼此接觸。
當(dāng)上述抗原-抗體復(fù)合物形成時(shí)，它還與標(biāo)記的抗體結(jié)合以固定在固相載體上。隨后用依賴于標(biāo)記種類的方法來測(cè)定結(jié)合或未結(jié)合在固相載體上的標(biāo)記的抗體的標(biāo)記量，根據(jù)測(cè)定值可確定樣品中抗肺炎衣原體抗體的存在或數(shù)量。
對(duì)于固相載體，可應(yīng)用例如塑料物，如聚苯乙烯，乙烯基氯等，絲狀物如硝基纖維素，尼龍等，無機(jī)物如玻璃，硅膠等，它們可以是滴定板，珠，磁珠，紙盤，線等任何一種形式。優(yōu)選聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板，因?yàn)樗鼈円子诳刂?，最?yōu)選的是聚苯乙烯微量滴定板，因?yàn)樗貏e易于控制。
另外，對(duì)于把抗原固定在上述固相載體上的方法，所應(yīng)用的是基于物理吸附的方法，用BrCN2等形成共價(jià)結(jié)合的方法。
這里提到的樣品可以是人的各種液體組分，優(yōu)選人的淚液，咽部化驗(yàn)標(biāo)本或血清，因?yàn)樗鼈兛煞从呈茉囌叩呐R床情況，通常應(yīng)用人的血清。
對(duì)于標(biāo)記的抗體，這里指的是用不同標(biāo)記物標(biāo)記的樣品抗體(例如，人的抗體)的抗抗體。對(duì)于被標(biāo)記的抗體，這里指的是抗人IgG抗體，抗人IgA抗體，抗人IgM抗體，或是其部分分解產(chǎn)物，如F(ab′)2，F(xiàn)ab等，可依據(jù)被測(cè)抗體的種類適當(dāng)應(yīng)用。
已知肺炎衣原體表面感染后，1-2周內(nèi)出現(xiàn)IgM，IgG抗體相對(duì)出現(xiàn)較早并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而消失，但可保持較長(zhǎng)時(shí)間。另一方面，已知分泌型IgA抗體在細(xì)胞免疫和抗再感染中起著一定作用。
因此，在標(biāo)記的抗體與上述樣品中的抗體接觸的步驟中，優(yōu)選由標(biāo)記不同種類的抗體而得到的標(biāo)記的抗體在測(cè)定中單獨(dú)進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于由標(biāo)記不同種類的抗體而得到的標(biāo)記的抗體，這里指的是標(biāo)記的抗IgG抗體，標(biāo)記的抗IgA抗體，標(biāo)記的抗IgM抗體等。
標(biāo)記的抗體時(shí)應(yīng)用的標(biāo)記物可以應(yīng)用例如酶，放射性同位素，熒光化合物，化學(xué)發(fā)光物等，優(yōu)選應(yīng)用具有靈敏、安全、簡(jiǎn)單等特性的酶類。所應(yīng)用的酶類例如蘋果酸脫氫酶(酶號(hào)1.1.1.37)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(酶號(hào)1.1.1.49)，葡萄糖氧化物(酶號(hào)1.1.3 4)，辣根過氧化物酶(酶號(hào)1.11.1.7)，乙酰膽堿酯酶(酶號(hào)3.1.1.7)堿性磷酸酶(酶號(hào)3.1.3.1)，糖淀粉酶(酶號(hào)3.2.1.3)，溶菌酶(酶號(hào)3.2.2.17)，β-半乳糖苷酶(酶號(hào)3.2.1.23)等。
對(duì)于酶標(biāo)記的抗體，優(yōu)選用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體或辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，因?yàn)樗鼈兡苓M(jìn)行簡(jiǎn)單和靈敏的測(cè)定，并且這些酶標(biāo)記的抗體可以購得。
下面描述的實(shí)施例表明，本發(fā)明用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法與用傳統(tǒng)的衣原體EB所進(jìn)行的間接微量IF試驗(yàn)結(jié)果有很好的相關(guān)性，具有高度的種特異性，很少有困擾臨床的假陰性和假陽性。
只要測(cè)定中用上述肺炎衣原體抗原作為部分或全部抗原，本發(fā)明中用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑并不受限制。
對(duì)于在上述夾心免疫測(cè)定中用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，盡管其組成元素依測(cè)定方法而不同，但這里所指的是，例如該試劑分別包含固定在固相載體上的固定化抗原和與待測(cè)抗體反應(yīng)的標(biāo)記的抗體。
固相載體和標(biāo)記的抗體如上所述。
標(biāo)記的抗體可懸浮在緩沖液等之中。
對(duì)于本發(fā)明的試劑，優(yōu)選的是以分別制備的標(biāo)記的抗人IgG抗體，標(biāo)記的抗人IgA抗體和標(biāo)記的抗人IgM抗體作標(biāo)記的抗體，因?yàn)檫@樣可反映樣品供體的臨床情況。
本發(fā)明的試劑可按需要聯(lián)合其它組分。例如，在夾心免疫測(cè)定中應(yīng)用的其它組分包括陰性對(duì)照樣品、陽性對(duì)照樣品、洗液、標(biāo)準(zhǔn)品，并且在標(biāo)記物為酶時(shí)，反應(yīng)物、稀釋液、反應(yīng)終止液等可單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用。該試劑對(duì)肺炎衣原體感染的診斷非常有益。
如上所述，本發(fā)明的肺炎衣原體抗原包括來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)常含有相對(duì)或絕對(duì)大量的肺炎衣原體非特異性組分。但是，依照本發(fā)明，即使應(yīng)用該肺炎衣原體抗原也可對(duì)抗肺炎衣原體抗體進(jìn)行定量測(cè)定。
由此可知，本發(fā)明的肺炎衣原體抗原在抗沙眼衣原體抗體和抗鸚鵡熱衣原體抗體間基本上不引起非特異性反應(yīng)，且具有高度的種特異性，因此很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性和假陽性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了肺炎衣原體的十二烷酰肌氨酸鈉-非溶解性外膜部分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖譜，其中每一箭頭代表一種蛋白質(zhì)，其分子量為1大約98K道爾頓，2大約60K道爾頓，3大約53K道爾頓，4大約46K道爾頓，5大約43K道爾頓，6大約40K道爾頓，7大約37K道爾頓，8大約30K道爾頓。
圖2顯示了用本發(fā)明的肺炎衣原體抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和用肺炎衣原體的EB進(jìn)行微量IF試驗(yàn)時(shí)二者的相關(guān)性，其中縱座標(biāo)代表ELISA于405nm處的吸收值，橫座標(biāo)代表微量IF試驗(yàn)的血清稀釋因子(滴度)。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案現(xiàn)在參照下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡釋。實(shí)施例A)肺炎衣原體EB的提純所用的衣原體是肺炎衣原體YK-41株(Kanamoto等，傳染性疾病雜志66(5)，637-641(1992))。
用YK-41株預(yù)先感染HL細(xì)胞，培養(yǎng)4天(在6孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中)，每孔加入1ml的SPG液(75.0g蔗糖，0.52g磷酸二氫鉀，1.22g磷酸氫二鉀，0.72g谷氨酸溶于1升水中配成水溶液，pH7.4-7.6)。用硅酮橡膠塊刮掉HL細(xì)胞，收集含HL細(xì)胞的SPG液。
將收集的溶液在SPG液中稀釋48倍，然后放置于聚苯乙烯離心管中，每隔1秒進(jìn)行30次聲處理，離心管在1500xg離心3分鐘，收集上清液制備YK-41株懸液(105IFU/ml)。
把在補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的HL細(xì)胞懸液(約8×104細(xì)胞/ml)4ml分散到6孔培養(yǎng)板中后，在36℃ 5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，以制備單層細(xì)胞。向其中接種2ml上述YK-41株懸液(105IFU/ml)，然后離心吸收(900xg，60分鐘)。吸收后，吸去接種的溶液，加入4ml補(bǔ)充有10％(v/v)FBS，含有環(huán)己酰亞胺(1μl/ml)的Eagle MEM培養(yǎng)基，然后在36℃ 5％CO2(v/v)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。用硅酮橡膠塊刮去感染的細(xì)胞，收集感染細(xì)胞的上清液。此時(shí)在6孔培養(yǎng)板中放置直徑為13mm的蓋玻片，在刮掉感染的細(xì)胞前立即移去。用CulturesetTM對(duì)蓋玻片進(jìn)行染色以確定感染率(Ortho診斷系統(tǒng)，Raritan，N.J.美國)。
在上面感染的培養(yǎng)物懸液中的細(xì)胞經(jīng)勻漿破裂后，在20℃離心10分鐘，收集上清液。上清液的兩部分在含30％泛影葡胺(泛影葡胺和泛影鈉)(w/v)，pH 7.2的0.033M Tris-HCl緩沖液的兩部分中分層，所述泛影葡胺已在一部分含50％(w/v)蔗糖，pH 7.2的0.033MTris-HCl緩沖液中分層，然后43000xg，20℃離心60分鐘。所獲得的團(tuán)塊作為粗提純的EB。
上述粗提純EB的一部分懸液在三部分含梯度尿泛影葡胺35-50(w/v)，pH 7.2的0.033M Tris-HCl緩沖液中分層，然后離心，43,000xg，20℃離心60分鐘。收集離心后位于中段的混濁層，此為純化的EB。B)肌氨酸不可溶的衣原體外膜級(jí)分的獲得所得的純化EB懸于含2％(w/v)十二烷酰肌氨酸鈉，1.5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.14M鹽水(十二烷酰肌氨酸鈉緩沖液)(pH8.0)的0.01M磷酸鈉緩沖液中，然后在20KHz聲波處理60秒。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，離心，100,000xg，20℃離心60分鐘。離心后，將團(tuán)塊重懸在少量的上述十二烷酰肌氨酸鈉緩沖液中，100,000xg，20℃離心60分鐘。離心后，再次收集上清液作為溶解部分。將團(tuán)塊用PBS(pH 8.0)洗滌2次，以除去剩余的十二烷酰肌氨酸鈉。隨后，將上面的團(tuán)塊懸于含10mM MgCl2，pH8.0的0.02M磷酸鈉緩沖液中，其中DNase和RNase均以2.5μg/ml溶解，在37℃反應(yīng)兩小時(shí)后，100,000xg，4℃離心60分鐘。為了除去可能殘留的DNase和RNase，用PBS(pH8.0)沖洗殘余物兩次，從而獲得殘余物組分(十二烷酰肌氨酸鈉不可溶的衣原體外膜級(jí)分)。
所得殘余物組分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以確定其中所含每一種蛋白質(zhì)的分子量。
按照Laemuli(英國，自然，227，680-685，1970)所描述的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中丙烯酰胺凝膠的梯度為4-20％。電泳緩沖液為含1％(w/w)SDS和0.2M甘氨酸的0.025M Tris緩沖液。每孔10μl的要進(jìn)行電泳的樣品預(yù)先制備，加60μl殘余物(蛋白質(zhì)濃度為500μg/ml)，60μl樣品處理液(0.125M Tris緩沖液，pH6.8，其中含有4％(w/v)SDS，2％(v/v)甘油，0.01％(w/v)BPB)，加12μl的2-巰基乙醇作還原劑，然后在95℃處理5分鐘。電泳在40mA進(jìn)行1小時(shí)。用Kaleidoscope Prestain Standard(BioRad產(chǎn)品的商品名)作分子量標(biāo)記物，按上面的條件進(jìn)行同一電泳，以每一樣品中蛋白質(zhì)的遷移率來確定其分子量。
用Wako銀染試劑盒(商品名，Wako純化工有限公司產(chǎn)品)以銀染方法進(jìn)行染色。
圖1給出了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖譜。其中每一箭頭代表蛋白質(zhì)，其分子量為1大約98K道爾頓，2大約60K道爾頓，3大約56K道爾頓，4大約46K道爾頓，5大約43K道爾頓，6大約40K道爾頓，7大約37K道爾頓，8大約30K道爾頓。C)抗肺炎衣原體抗體的測(cè)定上面所得的殘余物組分被用作抗原，在固定載體用的緩沖液(1升含NaHCO32.93g和Na2CO31.59g)中調(diào)整蛋白質(zhì)的濃度為5μg/ml，在96孔聚苯乙烯微量滴定板的每一孔中加100μl，在4℃過夜培養(yǎng)。然后用含有0.05％(v/v)吐溫20，pH7.2的PBS(以后稱作0.05％(v/v)吐溫20-PBS)300μl洗三次，以去除未吸附的抗原。然后每孔加入含5％(w/v)胎牛血清(BSA)(KPL產(chǎn))的封阻緩沖液250μl(緩沖液用于封阻和稀釋樣品)，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，從而制備抗原固定的板。板在250μl 0.05％(v/v)吐溫20-PBS中洗兩次。然后把100μl在用以封阻和稀釋樣品的緩沖液中稀釋了的樣品血清加到上面的抗原固定的板中，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，用250μl 0.05％(v/v)的吐溫20-PBS洗3次。然后用0.05％(v/v)吐溫20-PBS把用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗原(標(biāo)記的抗體)稀釋為1μg/ml，每孔加100μl。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，用250μl 0.05％(v/v)的吐溫20-PBS洗3次。然后每孔加入100μl的P-NPP(對(duì)硝基苯基磷酸酯)，P-NPP為堿性磷酸酶的底物，溶于二乙醇胺中(酶反應(yīng)的底物，濃度1mg/ml)，室溫下培養(yǎng)10分鐘。加入25μl 3N NaOH溶液(反應(yīng)終止液)來終止反應(yīng)，用微量滴定板讀數(shù)儀(Corona Denki K.K.產(chǎn)，商品名MTP-120型)來測(cè)定吸收值(405nm)。D)對(duì)人血清的敏感性和特異性通過用間接微量IF試驗(yàn)作對(duì)照來進(jìn)行具體說明。用55個(gè)肺炎衣原體抗體陽性者的血清樣品和66個(gè)肺炎衣原體抗體陰性者的血清樣品來進(jìn)行敏感性和特異性試驗(yàn)。用0.05％(v/v)的吐溫20-PBS稀釋人血清200倍，以制備用于測(cè)定衣原體抗體的樣品。后面將對(duì)間接微量-IF試驗(yàn)進(jìn)行闡釋。
為了進(jìn)一步明確本發(fā)明的效果，除用肺炎衣原體YK-41的純化EB作抗原來檢測(cè)抗肺炎衣原體抗原外，均用同一方法進(jìn)行測(cè)定，以與本發(fā)明的肺炎衣原體抗原比較敏感性和特異性。結(jié)果如表1和圖2所示。
圖2中的圖對(duì)用本發(fā)明的肺炎衣原體抗原進(jìn)行的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)與微量IF試驗(yàn)的相關(guān)性進(jìn)行比較，其中縱座標(biāo)代表ELISA405nm的吸收值，橫座標(biāo)代表微量IF試驗(yàn)的血清稀釋因子(滴度)。
表1所用抗原 陽性試驗(yàn)的預(yù)值 陰性試驗(yàn)的預(yù)值 截?cái)嘀?靈敏性) (特異性)(陽性樣品＝55) (陰性樣品＝66)肺炎衣原體外膜復(fù)合體 98.2％(54) 86.4％(57) 0.171純化的原生小體(EB)54.5％(30) 83.3％(55) 0.453每一試驗(yàn)截?cái)嘀档拇_定是66個(gè)陰性樣品的平均吸收值加標(biāo)準(zhǔn)差。
圖2中的結(jié)果顯示用本發(fā)明的方法所獲得的結(jié)果與常規(guī)的微量IF試驗(yàn)有很好的相關(guān)性。
表1的結(jié)果也顯示本發(fā)明的肺炎衣原體抗原與微量IF試驗(yàn)的一致性要好于用作對(duì)照抗原的純EB的試驗(yàn)。尤其是，它顯示出沒有困擾臨床的假陰性，因此有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。E)與沙眼衣原體抗體和鸚鵡熱衣原體抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)的研究用間接微量IF試驗(yàn)測(cè)定與肺炎衣原體，沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體的反應(yīng)性。該試驗(yàn)按照衣原體感染的基礎(chǔ)與臨床病理學(xué)，pp62-91(Kinbara Shuppan K.K.于1988年2月20日出版)中描述的方法如下進(jìn)行。
用肺炎衣原體TW-183株，沙眼衣原體L2株，和鸚鵡熱衣原體澳洲長(zhǎng)尾小鸚鵡Budgerigar-1株按上述的方法(A)獲得EB。每種EB與3％正常卵煮囊混合，以彼此極近的距離點(diǎn)在載玻片上。所點(diǎn)的三種EB為一組，總共16組，四組一列，四組一行，點(diǎn)在載玻片上。點(diǎn)完后，把丙酮加到載玻片上以固定EB。
人的血清樣品在0.05％(v/v)吐溫20-PBS中進(jìn)行系列稀釋，如稀釋成2、4、8倍，以制備樣品溶液。將每一樣品溶液加到上面各組中的EB上，37℃培養(yǎng)30分鐘，移去樣品溶液，在吐溫20-PBS中洗滌載玻片。
把抗人IgG-FITC連接物(熒光抗體由Sigma化學(xué)公司產(chǎn))加到各組的EB上，37℃培養(yǎng)30分鐘，除去樣品溶液，在吐溫20-PBS中洗載玻片。在熒光顯微鏡下觀察載玻片，檢測(cè)熒光的存在，把能觀察到熒光的最高稀釋度定為可得結(jié)果的滴度，滴度16被定為截?cái)嘀怠?br> 由間接微量IF試驗(yàn)的結(jié)果，將樣品分組，即分為含有肺炎衣原體抗體的，含有沙眼衣原體抗體的和含有鸚鵡熱衣原體抗體的，如表2-4所示。
用上述間接微量IF試驗(yàn)檢測(cè)人血清樣品時(shí)(樣品溶液的制備與測(cè)定衣原體抗體時(shí)制備樣品溶液的方式一樣)，如C)中描述的本發(fā)明的方法檢測(cè)抗體。如表2-4所示。
結(jié)果顯示本發(fā)明的測(cè)定方法與沙眼衣原體或鸚鵡熱衣原體沒有交叉反應(yīng)性。
表2樣品號(hào)微量IF試驗(yàn)(滴度) 本發(fā)明的測(cè)定方法肺炎衣原體 鸚鵡熱衣原體 沙眼衣原體 (吸收值)A 164 小于8小于80.372232 小于8小于80.172332 880.301416 小于8小于80.207564 小于8小于80.277616 小于8小于80.270732 小于8小于80.2348 512 8 160.5019 128 小于8小于80.38710 512 小于8小于80.434
表3樣品號(hào)微量IF試驗(yàn)(滴度) 本發(fā)明的測(cè)定方法肺炎衣原體 鸚鵡熱衣原體 沙眼衣原體 (吸收值)B 11 小于8小于8 16 0.14312 小于8小于8 8 0.11513 小于8小于8 16 0.10614 小于8小于8 16 0.07015 8小于8 16 0.14816 小于8小于8 16 0.08817 88 16 0.08918 小于8小于8 64 0.12119 小于8小于8 64 0.12420 小于8 16 16 0.117
表4樣品號(hào)微量IF試驗(yàn)(滴度) 本發(fā)明的測(cè)定方法肺炎衣原體 鸚鵡熱衣原體 沙眼衣原體 (吸收值)B 21 小于8 小于8 128 0.11722 小于8 小于8 128 0.12023 小于8 小于8 64 0.063C 24 小于8 16 8 0.13125 小于8 16 小于8 0.065表2-4中，A是含抗肺炎衣原體抗體的樣品，B為含抗沙眼衣原體抗體的樣品，C是含抗鸚鵡熱衣原體抗體的樣品(微量IF試驗(yàn)結(jié)果)。
本發(fā)明實(shí)施例中的截?cái)嘀禐?.171。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的肺炎衣原體抗原具有高度的種特異性、很少有困擾臨床的假陰性問題，很少出現(xiàn)假陽性，有很好的重現(xiàn)性，因此有利于檢測(cè)抗肺炎衣原體抗體。
依照本發(fā)明制備肺炎衣原體抗原的方法，可以提供一種制備抗原的方法，該抗原具有高度種特異性，很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性問題，且很少有假陽性。
本發(fā)明測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，具有高度的種特異性，很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性問題，很少出現(xiàn)假陽性，允許簡(jiǎn)單的測(cè)定和樣品的簡(jiǎn)單收集，反映樣品供體的臨床情況，具有高度的靈敏性，因此使它對(duì)肺炎衣原體感染的診斷非常有益。
本發(fā)明用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑具有高度的種特異性，很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性問題，很少出現(xiàn)假陽性，易于測(cè)定，具有高度靈敏性，因此對(duì)于肺炎衣原體感染的診斷很有價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種肺炎衣原體抗原，它包含來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的肺炎衣原體抗原，它與抗沙眼衣原體抗體或抗鸚鵡熱衣原體抗體基本上不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的肺炎衣原體抗原，其中來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)包含分子量為大約43K道爾頓，大約46K道爾頓和大約53K道爾頓的三種蛋白質(zhì)中的至少一種。
4.權(quán)利要求1-3的肺炎衣原體抗原，其中來源于肺炎衣原體外膜的蛋白質(zhì)包含分子量為大約43K道爾頓，大約46K道爾頓和大約53K道爾頓的三種蛋白質(zhì)。
5.一種制備肺炎衣原體抗原的方法，它包括用離子型去污劑溶解肺炎衣原體原生小體的胞液 和胞質(zhì)膜，然后去除溶解的部分以得到殘余部分。
6.一種測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，它包括應(yīng)用權(quán)利要求1-4中任一權(quán)項(xiàng)的肺炎衣原體抗原。
7.權(quán)利要求6中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，它包括把權(quán)利要求1-4中的肺炎衣原體抗原固定在固相載體上，使載體與待測(cè)樣品接觸，使所得抗原-抗體復(fù)合物與標(biāo)記的抗樣品中抗體的抗體接觸，測(cè)定結(jié)合的或未結(jié)合的標(biāo)記的抗體的標(biāo)記量，根據(jù)測(cè)量值來確定樣品中的抗肺炎衣原體抗體。
8.權(quán)利要求7中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中待測(cè)樣品是人的淚液，人的咽部化驗(yàn)標(biāo)本或人的血清。
9.權(quán)利要求7或8中測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中標(biāo)記的抗體是標(biāo)記的抗人IgG抗體，標(biāo)記的抗人IgA抗體或標(biāo)記的抗人IgM抗體。
10.權(quán)利要求7-9中任一權(quán)項(xiàng)的測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法，其中標(biāo)記的抗體是酶標(biāo)記的抗體。
11.一種用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，它包含權(quán)利要求1-4中任一權(quán)項(xiàng)的肺炎衣原體抗原。
12.權(quán)利要求11的用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，它包含固定在固相載體上的固定化抗原和與待測(cè)抗體反應(yīng)的標(biāo)記的抗體。
13.權(quán)利要求12的用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中固相載體是聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板。
14.權(quán)利要求12或13的用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中標(biāo)記的抗體是酶標(biāo)記的抗體。
15.權(quán)利要求14的用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑，其中酶標(biāo)記的抗體是用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，或用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含來源于肺炎衣原體外膜蛋白質(zhì)的肺炎衣原體抗原;制備肺炎衣原體抗原的方法,該方法包括用離子型去污劑溶解肺炎衣原體的胞液和胞質(zhì)膜,然后去除溶解的部分以得到殘余部分;測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法,該方法包括應(yīng)用肺炎衣原體抗原;一種用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑,該試劑包含肺炎衣原體抗原。根據(jù)本發(fā)明,提供了一種肺炎衣原體抗原,該抗原具有高度的種特異性,很少出現(xiàn)困擾臨床的假陰性問題,很少出現(xiàn)假陽性,本發(fā)明提供了制備該抗原的方法,測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的方法,以及用于測(cè)定抗肺炎衣原體抗體的試劑。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1184532SQ96193991
公開日1998年6月10日 申請(qǐng)日期1996年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月28日
發(fā)明者守川俊英, 川越清隆, 井筒浩, 井口晃史, 山木光男 申請(qǐng)人:日立化成工業(yè)株式會(huì)社