專利名稱：分析方法和用于分析的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析方法和用于分析的裝置，具體涉及使用色譜條的分析方法以及用于該分析方法的裝置。
背景技術(shù)：
使用色譜條的分析方法是一種快速而方便的分析方法。如日本專利申請公開60-19226，1-63865和3-176659中所說明的，色譜條具有一色譜載體，在色譜載體中載有示蹤物，示蹤物包含能與被分析物單一地結(jié)合的物質(zhì)(本發(fā)明中稱為捕集物質(zhì)1)以及一種標(biāo)記物，它們的安排方式是使示蹤物可實現(xiàn)色譜展開；或者在加入樣品的同時加入示蹤物而有一種能與被分析物單一地結(jié)合的物質(zhì)(本發(fā)明中稱為捕集物質(zhì)2)固定于其下游區(qū)域。當(dāng)樣品溶液加至色譜載體上載有示蹤物的區(qū)域，或當(dāng)樣品溶液與示蹤物同時加至色譜載體上時，被分析物與示蹤物結(jié)合，而結(jié)合有被分析物的示蹤物以及未結(jié)合有被分析物的示蹤物都沿縱向(即下游方向)展開。當(dāng)示蹤物到達(dá)捕集物質(zhì)2被固定的區(qū)域時，只有被分析物(示蹤物結(jié)合于其上)與捕集物質(zhì)2結(jié)合，示蹤物就聚集在該處，而被分析物未結(jié)合于其上的示蹤物將在下游方向流出。于是，被分析物在水性樣品溶液中的存在及其數(shù)量，就可從捕集物質(zhì)2被固定的區(qū)域處的顏色顯現(xiàn)而得知。
此外，與本發(fā)明相關(guān)連，日本專利申請公開3-176659說明了用明膠覆蓋本發(fā)明稱為標(biāo)記區(qū)的區(qū)域的全部或一部分。
這類使用色譜條的分析方法可在短時間內(nèi)進(jìn)行分析，而且處理方便，但仍有一些方面需要改進(jìn)，例如提高被分析物的檢測靈敏度。因此，本發(fā)明需要解決的問題，是提供一種使用色譜條的分析方法，其檢測靈敏度得到提高；并提供一種用于所述分析的裝置，其檢測靈敏度得到提高。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在加入樣品時將明膠加至色譜載體的某一特定位置，或事先將其設(shè)置在色譜載體的某一特定位置，現(xiàn)有的分析方法和分析工具可在許多方面得到改進(jìn)，例如檢測靈敏度可顯著提高，檢測時間可縮短，而夾層方法中的前區(qū)(pro-zone)現(xiàn)象可減少。
因此，本發(fā)明的一個方面是一種使用色譜條的分析方法，色譜條的色譜載體至少具有一個結(jié)合區(qū)，在該區(qū)中有一種能與被分析物結(jié)合的捕集物質(zhì)2，它直接固定于該區(qū)，或通過一種既能與被分析物結(jié)合又能與捕集物質(zhì)2結(jié)合的捕集物質(zhì)3而間接固定于其上；或者在固定捕集物質(zhì)2的區(qū)域的下游部分，固定有捕集物質(zhì)4，它能單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合，(捕集物質(zhì)1可與被分析物單一地結(jié)合，或通過與被分析物的競爭而與捕集物質(zhì)2結(jié)合)；而在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，事先配置有示蹤物(包含捕集物質(zhì)1和標(biāo)記物)，或在加入樣品時加入該種示蹤物，設(shè)置或加入的方式可使示蹤物進(jìn)行色譜展開；所述分析方法包括在加入樣品時在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域加入明膠，或者預(yù)先在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域設(shè)置明膠，但不包括已預(yù)先配置示蹤物的區(qū)域(此區(qū)域在下文稱為標(biāo)記區(qū))。
本發(fā)明的另一方面是一種分析用工具，它至少包括前述的色譜條和明膠，或包括設(shè)置有明膠的色譜條，其中明膠預(yù)先設(shè)置于所述色譜載體結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，但不包括標(biāo)記區(qū)。
附圖簡單說明

圖1是色譜條的說明。
圖2是用本發(fā)明分析方法進(jìn)行分析的結(jié)果示意圖(實施例2)。
圖3是用本發(fā)明分析方法進(jìn)行分析的結(jié)果示意圖(實施例3)。
實施本發(fā)明的最佳方式用本發(fā)明的方法測定其在樣品中的存在或數(shù)量的被分析物沒有特別限制，前提是存在與被分析物單一地結(jié)合的化合物。這種化合物的例子包括其中引入了生物素的化合物(抗生物素蛋白與其單一地結(jié)合的化合物)；含有抗生物素蛋白的化合物；互補(bǔ)DNA；具有抗原性的化合物或半抗原；與某種抗原的抗體單一地結(jié)合的化合物；與其抗原單一地結(jié)合的抗體或抗體片段；與糖配體單一地結(jié)合的外源凝集素和與外源凝集素單一地結(jié)合的糖配體；以及與受體單一地結(jié)合的配體和與配體單一地結(jié)合的受體。當(dāng)然，這些結(jié)合反應(yīng)具有高反應(yīng)活性或親和性時，檢測靈敏度就高。這些分析物的例子包括微生物；病毒；抗原，如致病微生物、病毒之類的特異性抗原，以及前列腺癌之類的腫瘤的標(biāo)示抗原；抗體，如由微生物、病毒等感染誘發(fā)的抗體，自身抗體之類的抗體，以及急性期蛋白抗原之類的特異性抗體；糞便的血紅蛋白或血紅蛋白特異性抗原；細(xì)胞，如培育出某種特異性抗原的細(xì)胞，具有某種特異性糖配體的細(xì)胞，以及具有某種特異性受體的細(xì)胞；激素，如甲狀腺激素，甲狀旁腺激素，生殖腺剌激之類的激素，以及生理上活潑的蛋白或肽(如細(xì)胞因子和monokine等)；蛋白或糖蛋白，如酶、含蛋白多糖、γ-精蛋白(seminoprotein)、和淀粉狀蛋白前體等；血液中的低分子化學(xué)物質(zhì)或藥物；信號轉(zhuǎn)移控制因子，如拮抗劑、頡頑藥等；血栓溶解/血液凝固控制因子；基因表達(dá)控制因子；細(xì)胞粘連分子；外源凝集素，如免疫調(diào)節(jié)劑外源凝集素等；以及RNA，DNA等核酸。尤其是，可用糞便、尿等作為非侵害性的樣品。
捕集物質(zhì)1包括一種通過捕集被分析物而與它單一地結(jié)合的化合物，或者與被分析物競爭而與捕集物質(zhì)2單一地結(jié)合的化合物。即當(dāng)被分析物是一種抗原時，捕集物質(zhì)1是一種與該抗原單一地結(jié)合的抗體或抗體片段(下文“抗體”包括與抗原單一地結(jié)合的抗體片段)，或者捕集物質(zhì)1是一種與抗體單一地結(jié)合的抗原或化合物(下文“抗原”包括與抗體單一地結(jié)合的化合物)；而當(dāng)被分析物是一種抗體時，捕集物質(zhì)1是一種抗原或抗體。同樣，當(dāng)被分析物是一種配體(或是具有配體的化合物)時，捕集物質(zhì)1是一種受體(或具有受體的化合物)或是一種配體；而當(dāng)被分析物是一種受體時，則捕集物質(zhì)1是一種配體或受體。在某些情況下，捕集物質(zhì)1通過被分析物而單一地結(jié)合于捕集物質(zhì)3，結(jié)果使它通過捕集物質(zhì)3而與捕集物質(zhì)2結(jié)合。被分析物與捕集物質(zhì)1的結(jié)合可以是可逆的，也可以是不可逆的，但親和性太低時，檢測靈敏度降低。
在捕集物質(zhì)1中加入標(biāo)記物就形成示蹤物。在捕集物質(zhì)1中加入標(biāo)記物的方法，可以通過吸收或摻入，或是通過氫鍵或共價鍵使它們結(jié)合。簡言之，標(biāo)記物加入的方式應(yīng)使捕集物質(zhì)1不容易與它脫離，并且能被捕集物質(zhì)2或被分析物識別。
當(dāng)捕集物質(zhì)1與被分析物、捕集物質(zhì)2(將在下文說明)、或捕集物質(zhì)4(也將在下文說明)結(jié)合時，標(biāo)記物就產(chǎn)生一個信號(即一種顏色)，以表明其存在。較好的是標(biāo)記物由不溶于水或防水性差的微顆粒構(gòu)成。較好的標(biāo)記物的例子包括金膠體等金屬膠體和硒膠體等非金屬膠體；有機(jī)膠體；染料顆粒；著色聚苯乙烯等著色的有機(jī)聚合物；其中包封有顯色劑的脂質(zhì)體等油質(zhì)微粒。當(dāng)膠體等不顯現(xiàn)顏色時，就加入顯色劑。顯色劑的例子包括在可見光區(qū)域顯色的物質(zhì)，也包括螢光物質(zhì)或在紫外區(qū)域顯色的物質(zhì)。通過設(shè)置在結(jié)合區(qū)中的酶之類物質(zhì)而顯現(xiàn)顏色(包括螢光)的物質(zhì)也屬于本發(fā)明的顯色劑。
當(dāng)將樣品溶液加至色譜條上時，示蹤物(它本身或者它與被分析物結(jié)合的形式)就在色譜載體中展開和遷移。示蹤物能夠以溶液(或懸浮液)形式使用，但可通過冰凍干燥等方法以粉末形式保存。
示蹤物有兩種設(shè)置方法，使其可用水性溶劑在色譜載體上實現(xiàn)色譜展開。第一種方法是，將一段浸透過示蹤物水溶液然后干燥的色譜載體，預(yù)先放置在結(jié)合區(qū)(結(jié)合區(qū)將在下文說明)上游處的基底材料或色譜載體上，與結(jié)合區(qū)相隔一定距離。在這種方法中，設(shè)置示蹤物的位置稱為標(biāo)記區(qū)。第二種方法是，在加入樣品時將示蹤物加在色譜載體上。因此，在這種方法中，色譜條上沒有標(biāo)記區(qū)。
捕集物質(zhì)2通過被分析物而與帶有被分析物的示蹤物結(jié)合，或者通過捕集物質(zhì)1而與帶有捕集物質(zhì)1的示蹤物結(jié)合。在后一種通過捕集物質(zhì)1而結(jié)合的情況中，捕集物質(zhì)1是通過與被分析物的競爭而與捕集物質(zhì)2結(jié)合。不論哪一種情況，捕集物質(zhì)2都單一地結(jié)合于被分析物。在另一種方式中，它可通過單一地與捕集物質(zhì)3結(jié)合(捕集物質(zhì)3單一地結(jié)合于被分析物)，而間接地結(jié)合于被分析物。當(dāng)被分析物是一種抗原時，捕集物質(zhì)2的一個例子是一種抗體(按前面的定義，這里的“抗體”也包括單一地與抗原結(jié)合的抗體片段)。當(dāng)捕集物質(zhì)2是一種抗體而捕集物質(zhì)1也是一種抗體時，最好是它們能識別待檢測抗原的不同表位。同樣，當(dāng)被分析物是一種抗體時，捕集物質(zhì)2是一種抗原(按前面的定義，這里的“抗原”也包括單一地與抗體結(jié)合的化合物)；當(dāng)被分析物是一種受體時，它是一種配體；而當(dāng)被分析物是一種配體時，它是一種受體。另外，當(dāng)捕集物質(zhì)2單一地與捕集物質(zhì)3結(jié)合時，捕集物質(zhì)2的例子為抗生物素蛋白、抗生物素抗體、和外源凝集素等。
捕集物質(zhì)2可通過色譜載體的適當(dāng)官能團(tuán)與捕集物質(zhì)2上某一官能團(tuán)之間的共價鍵，或通過色譜載體對捕集物質(zhì)2的強(qiáng)烈吸附，而固定在色譜載體上。另外，捕集物質(zhì)2可與微顆粒結(jié)合或吸附于其上，然后這些顆粒分散并固定在色譜載體上。在這方面，“固定”表示物質(zhì)的設(shè)置方式使其不會被水性溶劑顯著地分散或展開。捕集物質(zhì)2固定于其上的區(qū)域稱為結(jié)合區(qū)。
當(dāng)捕集物質(zhì)1、捕集物質(zhì)2、捕集物質(zhì)3或捕集物質(zhì)4是一種抗體時，在大多數(shù)情況下使用的是單克隆抗體，但如果通過必要的適當(dāng)方法，如吸附處理、選擇抗原或動物品種等，即使是血清抗體也可以使用。
捕集物質(zhì)3是一個共軛體，它包括單一地與被分析物結(jié)合的部分以及單一地與捕集物質(zhì)2結(jié)合的另一部分。如在討論捕集物質(zhì)1時所詳細(xì)說明的，當(dāng)被分析物是一種抗體時，單一地與被分析物結(jié)合的部分是一種抗原；當(dāng)被分析物是一種抗原時，該部分是一種抗體；當(dāng)被分析物是一種配體時，它是一種受體；而當(dāng)被分析物是一種受體時，它是一種配體。單一地與捕集物質(zhì)2結(jié)合的部分，例如，當(dāng)捕集物質(zhì)2是抗生物素蛋白時，它是生物素；當(dāng)捕集物質(zhì)2是生物素時，它是抗生物素抗體或抗生物素蛋白；當(dāng)捕集物質(zhì)2是外源凝集素時，它是一種糖配體。
捕集物質(zhì)3可預(yù)先設(shè)置在色譜載體的固定區(qū)上游的一個任選區(qū)域，其設(shè)置方式是當(dāng)水性樣品溶液加至色譜條上時，它能在色譜載體上展開和遷移；或者它是在加入樣品時加至色譜載體上。其設(shè)置方法與設(shè)置示蹤物的方法相同。
捕集物質(zhì)4單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合。
色譜載體并無特別限制，只要它能用水性溶劑展開溶質(zhì)。例如，它可以是用纖維素、硝化纖維素、乙酸纖維素、聚丙烯酸酯、玻璃、瓊脂糖、或聚氨酯等或是這些材料與一種無機(jī)粉末相結(jié)合所制造的非織造織物。
在必要時可將色譜載體層疊在適當(dāng)基底材料上而得到色譜條。
眾所周知，明膠凝膠是由魚、哺乳類動物之類的脊椎動物得到的。所用明膠的熔融溫度較好為15℃或15℃以上，更好為25℃或25℃以上。
在本發(fā)明中，明膠凝膠的熔融溫度按以下方法測量。
將明膠溶解在含有0.9％氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，使最終濃度為10g/dl。將一份1ml所得到的明膠溶液放入長度為100mm，直徑為12.5mm的試管中，并用塞子將試管封口。將試管完全浸沒在0℃的水浴中，使明膠實現(xiàn)膠凝。然后，使水浴的溫度以每1℃經(jīng)歷2分鐘的速率緩慢上升，然后測量試管倒置時明膠凝膠最初滴落的溫度。
明膠是在加入樣品溶液時使用，或者預(yù)先設(shè)置在色譜載體上。當(dāng)在加入樣品溶液時使用，它可以溶解在樣品溶液中，或者作為明膠水溶液與樣品溶液分別加入。制備水性明膠溶液所用的水性溶劑，一般最好使用制備樣品溶液所用的同樣溶劑。當(dāng)明膠是在加入樣品溶液時使用，明膠溶液中明膠的濃度最好是在0.1-1.5％(重量)。當(dāng)明膠是預(yù)先設(shè)置的，預(yù)先設(shè)置的數(shù)量最好也是相對于樣品溶液為上述重量％。
當(dāng)明膠是在加入樣品溶液時加入，它是加在結(jié)合區(qū)上游的位置。當(dāng)明膠是預(yù)先設(shè)置的，它是設(shè)置在結(jié)合區(qū)上游的位置，但不包括標(biāo)記區(qū)。作為加入位置和設(shè)置位置的例子，最適當(dāng)?shù)奈恢檬穷A(yù)先任意選定的，而最好的結(jié)果有時是將明膠設(shè)置在區(qū)域7而得到的。當(dāng)?shù)玫矫髂z預(yù)先設(shè)置在色譜載體上的設(shè)置有明膠的色譜條時，明膠是設(shè)置在預(yù)先選定的位置，位于結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，但不包括標(biāo)記區(qū)，其設(shè)置方式可使它能用水性溶劑展開。也就是說，有一段色譜載體，預(yù)先用明膠水溶液浸漬，然后干燥，再將這段載體設(shè)置在基底材料上或色譜載體上。
同樣，當(dāng)單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合的捕集物質(zhì)4固定在色譜載體上，位于捕集物質(zhì)2結(jié)合處的下游區(qū)域，以制備結(jié)合區(qū)時，最好在捕集物質(zhì)2固定的區(qū)域與捕集物質(zhì)4固定的區(qū)域之間的區(qū)域加入或預(yù)先設(shè)置明膠。
當(dāng)按本發(fā)明以外的其它方法使用明膠時，例如把明膠預(yù)先設(shè)置在標(biāo)記區(qū)時，在許多情況下會引起探測時間延長、探測靈敏度降低等問題。另一方面，當(dāng)明膠是在加入樣品時使用，即使它是加在標(biāo)記區(qū)，也不會發(fā)生這些問題。其原因是，當(dāng)明膠預(yù)先設(shè)置在標(biāo)記區(qū)時，明膠在保存色譜條的同時會對標(biāo)記區(qū)產(chǎn)生某些影響。
樣品溶液的水性溶劑可以是水，但一般使用pH緩沖液。水性溶劑的pH最好在5-9。
樣品溶液是加在標(biāo)記區(qū)上或標(biāo)記區(qū)的上游區(qū)域(當(dāng)存在標(biāo)記區(qū)時)，或加在結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域(當(dāng)不存在標(biāo)記區(qū)時)?！凹尤搿睒悠?，在這里是指將樣品溶液放在色譜條上，或是將色譜條的最上游端浸在樣品溶液中。
當(dāng)示蹤物和/或捕集物質(zhì)3未預(yù)先設(shè)置在色譜載體上時，它們可在加入樣品時加入。關(guān)于其加入方法，它們一般是與樣品一起加入。
本發(fā)明用于分析的裝置有兩種情況。
在第一種情況，至少結(jié)合使用色譜條(其中未預(yù)先設(shè)置明膠)和明膠。在這種情況，可進(jìn)一步結(jié)合使用一種水性溶劑。而且，明膠可以溶解或不溶解在該水性溶劑中。
第二種情況包括設(shè)置有明膠的色譜條。在這種情況，也可結(jié)合使用水性溶劑等其它組分。不論上面哪種情況，示蹤物和/或捕集物質(zhì)3，當(dāng)未預(yù)先設(shè)置在色譜條上時，可以使用冰凍干燥等方法制備的粉末或其水性溶液(或懸浮液)。
以下參照附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。
圖1表示設(shè)置有標(biāo)記區(qū)的色譜條。色譜條1由色譜載體2與基底材料(如果有必要時)構(gòu)成。色譜載體2上有標(biāo)記區(qū)3，其設(shè)置方式是使示蹤物可用水性溶劑展開。
標(biāo)記區(qū)3的上游可按情況需要而設(shè)置一個上游區(qū)5，當(dāng)設(shè)有此區(qū)時，在許多情況下它就是樣品溶液的加入位置。這個區(qū)域可對樣品溶液中的懸浮物質(zhì)進(jìn)行過濾，并可含有使分析順利進(jìn)行的輔助物質(zhì)。這類輔助物質(zhì)的例子包括能使被分析物與捕集物質(zhì)1的結(jié)合反應(yīng)更單一或更定量化的物質(zhì)，以及不溶性標(biāo)記物的顯色劑等。
當(dāng)將樣品溶液加至標(biāo)記區(qū)3的上游區(qū)域或是加至標(biāo)記區(qū)3，包含在樣品中的被分析物，如果它能與捕集物質(zhì)1結(jié)合，就將被示蹤物加上標(biāo)記。然后，被分析物結(jié)合于其上的示蹤物、被分析物未結(jié)合于其上的其余示蹤物、以及其余的被分析物通過色譜展開而向圖1中的右方遷移(即向下游方向遷移)，并到達(dá)設(shè)置在標(biāo)記區(qū)3下游的結(jié)合區(qū)4。
標(biāo)記區(qū)3和結(jié)合區(qū)4并不直接地彼此連接，而是隔開一個可任選的距離。間距區(qū)7可有凝膠放于其上，或者設(shè)置在其上的標(biāo)記物質(zhì)3上，使它可進(jìn)行色譜展開。在有些情況下，在其上可進(jìn)一步設(shè)置標(biāo)記物的顯色劑。
結(jié)合區(qū)4有兩種情況。在第一種情況，與被分析物結(jié)合的示蹤物被捕集在該區(qū)并顯色，或者示蹤物與被分析物競爭而被捕集在該區(qū)并顯色。在第二種情況，捕集物質(zhì)4固定在一個位于捕集物質(zhì)2固定于其上的區(qū)域(此區(qū)域?qū)?yīng)于上述第一種情況中的結(jié)合區(qū))下游的區(qū)域。在這種情況，其設(shè)置可按情況需要而任選，但當(dāng)設(shè)置該區(qū)并用以檢測顏色展開時，是將它用作結(jié)合區(qū)4。在第二種情況，未與捕集物質(zhì)2結(jié)合的示蹤物或者與被分析物競爭而未被捕集物質(zhì)2捕集的示蹤物在這結(jié)合區(qū)被捕集物質(zhì)4捕集并顯色。
當(dāng)設(shè)置有捕集物質(zhì)3時，捕集物質(zhì)3與結(jié)合于示蹤物的被分析物結(jié)合，而由此形成的示蹤物/被分析物/捕集物質(zhì)3復(fù)合物通過捕集物質(zhì)3而結(jié)合于捕集物質(zhì)2，并停止在結(jié)合區(qū)4。另外一種方式是，捕集物質(zhì)3與捕集物質(zhì)2結(jié)合，然后在結(jié)合區(qū)4單一地與被分析物結(jié)合。
在結(jié)合區(qū)4下游的區(qū)域6可按情況需要而設(shè)置，其目的是當(dāng)捕集物質(zhì)1能與被分析物結(jié)合時，使未通過捕集物質(zhì)1與被分析物結(jié)合的示蹤物流出，或使樣品溶液中所含的被分析物以外的可溶性組分流出。在某些情況下，可在下游區(qū)域6設(shè)置一種當(dāng)水性樣品溶液的水性溶劑流入時會顯色的物質(zhì)(例如pH指示劑等)，以判定檢測的可靠性。
當(dāng)色譜條上沒有標(biāo)記區(qū)3時，分析方法與上面所說相同，只是示蹤物是在加入樣品時加入。
實施例1由用硒膠體標(biāo)記的抗人血紅蛋白抗體構(gòu)成的示蹤物的制備將91mM L-抗壞血酸鈉和32mM氧化硒在約4℃攪拌15分鐘，然后在約42℃攪拌70小時，制得硒膠體。
將所得的硒膠體用10mM二-三羥甲基氨基甲烷(bis-tris buffer)緩沖溶液(pH7.0)稀釋至其在550nm的吸光度為15。將抗人血紅蛋白小鼠單克隆抗體(0.02％)加入至稀釋的制劑中，然后將混合物在室溫下攪拌1小時。然后用10mM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液(pH7.2)洗滌得到的以硒膠體標(biāo)記的抗人血紅蛋白抗體，并用它作為示蹤物。
標(biāo)記區(qū)的制備將示蹤物加至含有1％酪蛋白的10mM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液(pH7.2)中，得到示蹤物懸浮液，并將混合物在550nm波長的吸光度調(diào)節(jié)至等于1.0。將一片玻璃纖維薄膜(Lypore 9524，由美國LYDALL制造)浸在這樣制得的懸浮液中，使它吸飽該懸浮液，然后將玻璃纖維薄膜干燥，用作標(biāo)記區(qū)。
結(jié)合區(qū)的制備將抗人血紅蛋白小鼠單克隆抗體(它具有與前述的抗人血紅蛋白抗體不同的結(jié)合部位)與含有150mM氯化鈉的30mM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液(pH7.4)混合，使最終濃度為2mg/ml。另外，將厚度為100μm，長方形(0.4×6.0cm)的薄片(PET 100 PE LR 007A，Lintech制造)與用作色譜載體的硝化纖維薄膜(0.4×4.5cm的長方形，孔隙大小為5μm，美國Schleicher&Schuell制造)粘合起來，使它們的長邊沿其長度并列，而上端對齊。抗體混合溶液在離粘合在薄片上的硝化纖維薄膜底端約1cm的區(qū)域點成一線，而將各點徹底干燥，以固定抗人血紅蛋白抗體。
色譜條的制備將切成0.4×0.4cm正方形的含有用硒膠體標(biāo)記的抗人血紅蛋白抗體的玻璃纖維墊片粘在薄片上，位于已固定有抗人血紅蛋白抗體的硝化纖維的下側(cè)，使它輕微地與硝化纖維接觸。在該墊片下側(cè)的薄片上，粘上切成0.4×1.3cm的疏水性非織造織物(Sontala 8801，Du Pont，U.S.A.制造)，使其輕微地與硝化纖維接觸，作為預(yù)過濾器，從而得到色譜條。
分析以含有0.1％牛血清清蛋白(Seikagaku Kogyo，Tokyo制造)、0.9％氯化鈉和0.1％疊氮化鈉的0.1M三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液(pH7.6)，并補(bǔ)充加入人血紅蛋白(由Sigma，U.S.A制造)作為樣品。在其中加入豬皮明膠(由Sigma，U.S.A制造)，使最終濃度為0.7％。將一份25μl樣品溶液施加在色譜條的預(yù)過濾器上。加入樣品7分鐘后，可通過用肉眼觀察硒膠體所引起的“紅色”來判斷分析結(jié)果。用肉眼可觀察到其“紅色”的血紅蛋白的最小濃度，就作為分析的靈敏度。
判斷的結(jié)果見表1。由表1可明顯看出，使用明膠時(a)與不使用明膠時(b)相比，靈敏度增大了約80倍。
表1

實施例2重復(fù)實施例1的過程，但在加入樣品后1分鐘開始判斷，然后每隔1分鐘判斷一次，直至加樣品后12分鐘。
結(jié)果見圖2，由圖2可明顯看到，使用明膠時(曲線a)與不使用明膠時(曲線b)相比，分析時間約縮短為1/3。
實施例3重復(fù)實施例1的過程，但樣品溶液中的人血紅蛋白濃度改變?yōu)閳D3所示的數(shù)值。結(jié)果見圖3，由圖3可明顯看到，使用明膠時(曲線a)與不使用明膠時(曲線b)相比，可測量的人血紅蛋白濃度的上限約高10倍。換言之，使用明膠時，顯然前區(qū)現(xiàn)象減少了。
實施例4重復(fù)實施例1的過程，但使用表2所示的明膠制劑來檢測人血紅蛋白。在本例中，人血紅蛋白濃度固定為10ng/ml，而加入至樣品溶液中的明膠數(shù)量改變?yōu)?.0％。結(jié)果見表2。明膠的熔融溫度是用前面所述的方法測定。
表2

工業(yè)實用性使用本發(fā)明的分析方法或分析裝置，被分析物的檢測靈敏度可得到提高。而且，檢測所需的時間可以縮短。此外，夾層方法中的所謂前區(qū)(pro-zone)現(xiàn)象減少了。
權(quán)利要求
1.一種使用色譜條的分析方法，其特征在于其中的色譜載體至少具有一個結(jié)合區(qū)，有一種能與被分析物結(jié)合的捕集物質(zhì)2直接固定于該區(qū)，或者通過捕集物質(zhì)3間接固定于該區(qū)，而捕集物質(zhì)3能同時與被分析物和捕集物質(zhì)2二者結(jié)合；或者有一種捕集物質(zhì)4固定在捕集物質(zhì)2所固定的區(qū)域的下游區(qū)域，捕集物質(zhì)4能單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合，而捕集物質(zhì)1單一地與被分析物結(jié)合，或者與被分析物競爭而單一地與捕集物質(zhì)2結(jié)合；而捕集物質(zhì)1和標(biāo)記物構(gòu)成的示蹤物預(yù)先設(shè)置在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，或者在加入樣品時加在該處，其設(shè)置和加入方式可使示蹤物能進(jìn)行色譜展開；所述分析方法包括在加入樣品時將明膠加在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，或者將明膠預(yù)先設(shè)置在所述結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，但不包括預(yù)先設(shè)置示蹤物的區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征還在于所述的明膠凝膠在15℃或15℃以上熔融。
3.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征還在于所述的明膠凝膠在25℃或25℃以上熔融。
4.如權(quán)利要求1，2或3所述的分析方法，其特征還在于其中的樣品是糞或尿。
5.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征還在于當(dāng)能單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合的捕集物質(zhì)4固定在捕集物質(zhì)2所固定的區(qū)域下游的區(qū)域作為結(jié)合區(qū)時，明膠是加在或預(yù)先設(shè)置在捕集物質(zhì)2固定的區(qū)域與捕集物質(zhì)4固定的區(qū)域之間的區(qū)域。
6.一種用于分析的裝置，其特征在于它至少包括權(quán)利要求1的色譜條和明膠，或包括設(shè)置有明膠的色譜條，其中明膠預(yù)先設(shè)置在權(quán)利要求1的結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，但不包括預(yù)先設(shè)置示蹤物的區(qū)域。
7.如權(quán)利要求7所述的分析裝置，其特征還在于所述的明膠凝膠在25℃或25℃以上熔融。
8.如權(quán)利要求7所述的分析裝置，其特征還在于所述的明膠凝膠在15℃或15℃以上熔融。
9.如權(quán)利要求6、7或8所述的分析裝置，其特征還在于其中的樣品是糞或尿。
10.如權(quán)利要求1所述的分析裝置，其特征還在于當(dāng)能單一地與捕集物質(zhì)1結(jié)合的捕集物質(zhì)4固定在捕集物質(zhì)2所固定的區(qū)域下游的區(qū)域作為結(jié)合區(qū)時，明膠是加在或預(yù)先設(shè)置在捕集物質(zhì)2固定的區(qū)域與捕集物質(zhì)4固定的區(qū)域之間的區(qū)域。
全文摘要
一種使用色譜條的分析方法，色譜條上有一個結(jié)合區(qū)，其中有能單一地與被分析物結(jié)合的捕集物質(zhì)2固定在色譜載體上，而示蹤物(它包括能與分析物競爭而單一地與捕集物質(zhì)2結(jié)合的捕集物質(zhì)1以及一種標(biāo)記物)預(yù)先設(shè)置在結(jié)合區(qū)的上游區(qū)域，或者在加入樣品時加在該區(qū)域，設(shè)置和加入的方式可使其實現(xiàn)展開，而將明膠在加入樣品時加在結(jié)合區(qū)上游的區(qū)域或預(yù)先設(shè)置在該區(qū)域。
文檔編號G01N33/543GK1157040SQ9619067
公開日1997年8月13日 申請日期1996年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日
發(fā)明者吉村徹 申請人:大納寶株式會社