本發(fā)明涉及藥材的質(zhì)量檢測方法，特別是娑羅子的質(zhì)量檢測方法。

背景技術(shù)：

娑羅子為七葉樹科七葉樹屬植物天師栗aesculuswilsoniirehd.、浙江七葉樹aesculuschinensisbge.var.chekiangensis(huetfang)fang或七葉樹aesculuschinensisbge.的干燥成熟種子，收載于2015年版《中國藥典》。娑羅子中主要含有三萜皂苷、鞣質(zhì)、黃酮、甾醇、有機(jī)酸等類別的化學(xué)成分，其中的三萜皂苷也稱為七葉皂苷，是娑羅子的主要活性成分，其鈉鹽七葉皂苷鈉已應(yīng)用于臨床，用于治療腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致的腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病。

娑羅子基原植物較多，不同產(chǎn)地的娑羅子的質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致娑羅子藥材和制劑的質(zhì)量不穩(wěn)定，影響臨床療效。2015年版《中國藥典》僅記載了娑羅子中的七葉皂苷a的含量測定方法。目前針對娑羅子中指標(biāo)成分的含量測定常用方法為hplc法。文獻(xiàn)《hplc法測定娑羅子中4種皂苷類成分的含量》(魏鋒等，藥物分析雜志，2004,24(4):400-402)公開了hplc法測定娑羅子中七葉皂苷a、七葉皂苷b、異七葉皂苷a、異七葉皂苷b的含量的方法。該方法中，供試品溶液的制備方法是采用甲醇提取后，再用石油醚進(jìn)行脫脂處理，以除去其中干擾性的油脂類成分，因而耗時較長。文獻(xiàn)《娑羅子中三萜皂苷成分的hplc定量分析》(郭杰等，中草藥,2007,38(5):767-770)公開了利用hplc法同時測定七葉樹皂苷a、b和異七葉樹皂苷a、b的含量的方法。其中供試品溶液的制備方法為，將娑羅子采用水飽和的正丁醇超聲提取，除去溶劑，加甲醇溶解，再上d-101大孔樹脂柱，依次用水和95％乙醇洗脫，95％乙醇洗脫液除去溶劑，再用甲醇溶解，得到供試品溶液。該方法供試品溶液處理步驟繁雜，耗時較長。此外，上述方法進(jìn)行高效液相色譜檢測方法時，為了得到良好的組分分離度，保留時間均較長。

因此，需要一種簡單、耗時短的娑羅子質(zhì)量檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種娑羅子的質(zhì)量檢測方法，該方法簡單、準(zhǔn)確、快速。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種娑羅子的質(zhì)量檢測方法，包括如下步驟：

(1)供試品溶液的制備步驟：將娑羅子用溶劑提取，得到提取液；將所述提取液用微孔濾膜濾過，得到供試品溶液；所述溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液；

(2)對照品溶液的制備步驟：將七葉皂苷a和七葉皂苷b對照品用溶劑溶解，再用微孔濾膜濾過，得到對照品溶液；所述溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液；

(3)檢測步驟：將所述供試品溶液和對照品溶液分別注入超快速液相色譜儀，分別得到液相色譜圖；其中，流動相由乙腈(a)和含量為0.05vol％的三氟乙酸水溶液(b)組成，采用如下梯度洗脫方式洗脫：

0→t1，流動相中乙腈的體積百分比為a1；

t2→t3，流動相中乙腈的體積百分比由a2增加至a3；

其中，t1為4～8min；t2為t1+0.01～t1+0.05min；t3為12～18min；a1為33％～37％；a2為38％～39％；a3為40％～41％；

其中，步驟(1)和步驟(2)的順序不分先后。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(1)的提取方法選自浸漬法、超聲提取法或加熱回流提取法。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(1)的溶劑為50～100vol％的甲醇水溶液；步驟(2)的溶劑為50～100vol％的甲醇水溶液。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(1)的提取方法為超聲提取法，提取時間為15～90分鐘；且溶劑的用量為娑羅子重量的15～80倍。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(1)中，將娑羅子用40～50倍量的65～80vol％的甲醇水溶超聲提取20～30分鐘，得到提取液；將所述提取液用微孔濾膜濾過，得到所述供試品溶液。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述七葉皂苷a和七葉皂苷b對照品為同時含有七葉皂苷a和七葉皂苷b的對照品，所述對照品溶液為同時含有七葉皂苷a和七葉皂苷b的混合對照品溶液。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(2)的對照品溶液中，七葉皂苷a的濃度為200～800μg/ml；且七葉皂苷b的濃度為200～800μg/ml。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(3)中，t1為6min，t2為t1+0.01min，且t3為15min；a1為35％，a2為39％，且a3為40％。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(3)中，超快速液相色譜儀的檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器或二極管陣列檢測器；檢測波長為220nm；流動相的流速為0.1～0.3ml/min；且柱溫為25～35℃。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，步驟(3)中，超快速液相色譜儀的檢測器采用二極管陣列檢測器；流動相的流速為0.2ml/min；且柱溫為30℃。

本發(fā)明的娑羅子的質(zhì)量檢測方法，供試品溶液處理方法簡單且耗時短，節(jié)約溶劑；能夠有效檢測娑羅子中的七葉皂苷a和七葉皂苷b，具有良好的分離度，方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，且更省時。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的對照品溶液的快速液相色譜圖。

圖2為實(shí)施例1的供試品溶液的快速液相色譜圖。

附圖標(biāo)記如下：

1為七葉皂苷a的吸收峰；2為七葉皂苷b的吸收峰。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。

本發(fā)明中，所述娑羅子為七葉樹科七葉樹屬植物天師栗aesculuswilsoniirehd.、浙江七葉樹aesculuschinensisbge.var.chekiangensis(huetfang)fang或七葉樹aesculuschinensisbge.的干燥成熟種子。

本發(fā)明中，所述超快速液相色譜是指ultrafastliquidchromatograph，簡稱uflc。

本發(fā)明中，所述的100vol％甲醇水溶液是指甲醇，即不含水的甲醇溶劑。

本發(fā)明的娑羅子的質(zhì)量檢測方法，包括(1)供試品溶液的制備步驟；(2)對照品溶液的制備步驟；和(3)檢測步驟。其中，步驟(1)和步驟(2)的順序不分先后。

<供試品溶液的制備>

本發(fā)明的供試品溶液的制備步驟，是將娑羅子用溶劑提取，得到提取液；將所述提取液用微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。所述溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液中的一種或幾種。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，所述溶劑為50～100vol％的甲醇水溶液，優(yōu)選為60～100vol％的甲醇水溶液，更優(yōu)選為65～80vol％的甲醇水溶液，再優(yōu)選為70vol％的甲醇水溶液。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，所述溶劑為甲醇。采用上述溶劑能夠?qū)㈡读_子中的七葉皂苷類組分充分提取出來，且得到uflc色譜圖中組分的峰形更好。

本發(fā)明中，所述的提取方法可以采用浸漬法、超聲提取法或加熱回流提取法，優(yōu)選為超聲提取法。采用超聲提取法省時，操作簡單，且提取率更高。超聲提取的時間為15～90分鐘，優(yōu)選為15～60分鐘，更優(yōu)選為20～30分鐘。本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲提取20～30分鐘時，已能夠?qū)㈡读_子中的七葉皂苷類組分充分提取出來。

本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述溶劑的用量為娑羅子重量的15～80倍，優(yōu)選為30～60倍，更優(yōu)選為40～50倍，再優(yōu)選為50倍。采用這樣的溶劑用量，得到的供試品溶液的峰面積更合適。

優(yōu)選地，所述供試品溶液的制備步驟為：將娑羅子用40～50倍量的65～80vol％的甲醇水溶超聲提取20～30分鐘，得到提取液；將所述提取液用微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。

根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，所述供試品溶液的制備步驟為：將娑羅子用50倍量的70％的甲醇水溶超聲提取30分鐘，得到提取液；將所述提取液用微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。優(yōu)選地，所述微孔濾膜為孔徑為0.22μm的微孔濾膜。

本發(fā)明的供試品溶液的處理方法無需復(fù)雜的脫脂處理或樹脂除雜處理，操作簡單，處理時間短，且節(jié)約溶劑。

<對照品溶液的制備>

本發(fā)明的對照品溶液的制備步驟，是將七葉皂苷a和七葉皂苷b對照品用溶劑溶解，再用微孔濾膜濾過，得到對照品溶液。所述溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙腈水溶液中的一種或幾種。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，所述溶劑為50～100vol％的甲醇水溶液，優(yōu)選為60～100vol％的甲醇水溶液，更優(yōu)選為65～80vol％的甲醇水溶液，再優(yōu)選為70vol％的甲醇水溶液。

本發(fā)明中，所述的對照品溶液可以是將上述七葉皂苷a和七葉皂苷b對照品分別溶解在單獨(dú)的溶劑中，制成每份僅包含一種對照品的對照品溶液；也可以是將同時含有上述七葉皂苷a和七葉皂苷b的對照品(例如七葉皂苷鈉對照品)溶解在同一溶劑中，制成混合對照品溶液。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的對照品溶液是將含有七葉皂苷a和七葉皂苷b的對照品溶解于同一溶劑中制備而成的混合對照品溶液。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述混合對照品溶液中，七葉皂苷a的濃度為200～800μg/ml，更優(yōu)選為300～700μg/ml，再優(yōu)選為400～600μg/ml；七葉皂苷b的濃度為200～800μg/ml，更優(yōu)選為300～700μg/ml，再優(yōu)選為400～600μg/ml。優(yōu)選地，所述微孔濾膜為孔徑為0.22μm的微孔濾膜。

<檢測方法>

本發(fā)明的檢測方法，將所述供試品溶液和對照品溶液分別注入超快速液相色譜儀(uflc)，得到超快速液相色譜圖。本發(fā)明的檢測方法中，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，可以采用市售的色譜柱，例如capcellcorec18(2.1mmi.d×150mm，2.7μm)，superc18(3.0mmi.d×150mm，2.5μm)或shim-packxr-odsiicolumn等。

本發(fā)明的檢測方法中，流動相由乙腈(a)和含量為0.05vol％的三氟乙酸水溶液(b)組成；當(dāng)a組分的體積含量確定后，余量即為b組分。本發(fā)明采用如下梯度洗脫方式將七葉皂苷a和七葉皂苷b分離，且分離度良好：

0→t1，流動相中乙腈的體積百分比為a1；

t2→t3，流動相中乙腈的體積百分比由a2增加至a3；

其中，

t1為4～8min，優(yōu)選為5～7min，更優(yōu)選為6min；

t2為t1+0.01～t1+0.05min，優(yōu)選為t1+0.01min；

t3為12～18min，優(yōu)選為13～17min，更優(yōu)選為15min；

a1為33％～37％，更優(yōu)選為34％～36％，優(yōu)選為35％；

a2為38％～39％，更優(yōu)選為39％；

a3為40％～41％，更優(yōu)選為40％。

根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，所述流動相采用如下洗脫方式洗脫：0→6min，流動相中乙腈的體積百分比為35％；6.01→15min，流動相中乙腈的體積百分比由39％增加至40％。

本發(fā)明的檢測方法中，超快速液相色譜儀的檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器(elsd)或二極管陣列檢測器(dad)。優(yōu)選地，所述檢測器采用dad檢測器，其檢測信號更強(qiáng)，且操作更簡單。本發(fā)明的檢測方法中，優(yōu)選地，檢測波長為220nm。本發(fā)明的檢測方法中，優(yōu)選地，流動相的流速為0.1～0.3ml/min，優(yōu)選為0.2ml/min。優(yōu)選地，柱溫為25～35℃，并優(yōu)選為30℃。采用本發(fā)明的檢測條件，供試品溶液中的大部分雜質(zhì)組分能夠在5min之前、甚至在2.5min之前洗脫出來，且七葉皂苷類成分的吸收峰附近很少或幾乎沒有雜質(zhì)峰，具有良好的分離效果；整個洗脫時間在15min以內(nèi)，耗時短。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方式，所述檢測條件為檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為220nm，流動相的流速為0.2ml/min，柱溫為30℃。

本發(fā)明采用超快速液相檢測方法，能夠有效檢測娑羅子中的七葉皂苷a和七葉皂苷b，具有良好的分離度，方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，且更省時。本發(fā)明的檢測方法對于供試品溶液中的雜質(zhì)

以下通過實(shí)施例來具體闡述本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法。其中采用的快速液相色譜儀為島津超快速液相色譜儀lc-20adxr(二極管陣列檢測器，二元高壓梯度泵，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，自動進(jìn)樣器；labsolutions色譜工作站)。色譜柱采用shim-packxr-odsii(2.0mmi.d×75mm)。甲醇為色譜純，水為超純水，甲酸為分析純，三氟乙酸為化學(xué)純。七葉皂苷鈉對照品購自中國食品藥品檢定研究院，其中含七葉皂苷a38.8wt％，七葉皂苷b28.3wt％。實(shí)施例1的娑羅子藥材來自湖北；實(shí)施例2～11的娑羅子藥材來自湖北、山東等地。

實(shí)施例1-娑羅子的質(zhì)量檢測

(1)供試品溶液的制備：取娑羅子約0.5g，精密稱定，置于50ml離心管中，精密加入70vol％甲醇25ml，密封，搖勻，稱定重量。超聲處理(功率500w，頻率40khz)30min，放冷，再稱定重量，用70vol％甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。

(2)對照品溶液的制備：精密稱取七葉皂苷鈉對照品2.99g，置于2ml容量瓶中，加入70vol％甲醇適量，超聲溶解，用70％甲醇定容至刻度，搖勻，得到混合對照品溶液。其中七葉皂苷a的濃度為580.060μg/ml，七葉皂苷b的濃度為423.085μg/ml。

(3)檢測方法：將供試品溶液和對照品溶液分別注入快速液相色譜儀，分別得到高效液相色譜圖。進(jìn)樣量：10μl，流動相為乙腈(a)-0.05％三氟乙酸水溶液(b)梯度洗脫，0→6min，流動相中乙腈的體積百分比為35％，6.01→15min，流動相中乙腈的體積百分比由39％增加至40％；柱溫：30℃；檢測波長：220nm；流動相的流速為0.2ml/min；七葉皂苷a和七葉皂苷b的理論塔板數(shù)分別為9032和8065。

上述對照品溶液和供試品溶液的超快速液相色譜圖分別見圖1和圖2。七葉皂苷a和七葉皂苷b具有良好的分離度，方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，且更省時。

實(shí)施例2-12-娑羅子的質(zhì)量檢測

采用實(shí)施例1的方法檢測另外11批娑羅子藥材，所得超快速液相色譜圖與圖1和圖2相似。

本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的任何變形、改進(jìn)、替換均落入本發(fā)明的范圍。