本發(fā)明屬于食品分析及質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蓮藕酚類化合物指紋圖譜的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

蓮藕是我國栽培最廣、銷售量和銷售范圍最大的水生蔬菜。隨著蓮藕產(chǎn)業(yè)規(guī)模的逐漸壯大，產(chǎn)品品質(zhì)及個性化需求不斷增加，產(chǎn)業(yè)發(fā)展對品種選育提出了更高要求。藕蓮品種選育從單一的高產(chǎn)目標(biāo)向營養(yǎng)和感官等品質(zhì)改良方向轉(zhuǎn)移，而以滿足加工、保鮮、消費習(xí)慣等個性特征的育種目標(biāo)成為當(dāng)前研究的熱點(柯衛(wèi)東,2003)。據(jù)早期文獻報道，在“國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃”中保存的藕蓮資源已達310份，而人工選育品種達12種(柯衛(wèi)東，2015)。豐富的種質(zhì)資源為個性化加工和產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)保障，同時也對產(chǎn)品質(zhì)量控制提出挑戰(zhàn)：如何區(qū)分鑒別不同特性的品種。

韓延闖(2004)、劉月光(2006)、全志武(2008)和李長春(2011)均采用分子生物學(xué)技術(shù)研究了蓮藕種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性，并基于生物指紋圖譜應(yīng)用于品種的鑒別。但相關(guān)技術(shù)在實際生產(chǎn)應(yīng)用中較受局限，且研究對象均為蓮藕葉，有效用于藕原料鑒別的技術(shù)相對缺乏。基于物質(zhì)群體的認識，指紋圖譜可實現(xiàn)資源真實性鑒別、質(zhì)量一致性評價和產(chǎn)品穩(wěn)定性分析，尤以色譜指紋圖譜的研究應(yīng)用最為普遍(李強，2013)，而蓮藕的色譜指紋圖譜技術(shù)尚未見報道。

植物多酚是一類存在于植物體內(nèi)的多羥基酚類化合物的總稱，主要包括黃酮類、單寧、花色苷類、酚酸類等，其含量、組成及結(jié)構(gòu)的多樣性被廣泛應(yīng)用于化學(xué)指紋圖譜的構(gòu)建，如三葉青葉指紋圖譜(范世明，2016)、丹參指紋圖譜(周毅生，2009)、烤煙指紋圖譜(李軍營，2009)等。蓮藕中含有豐富的酚類物質(zhì)，其相關(guān)研究報道主要集中在提取、純化以及少數(shù)組分的定量和定性分析(王清章，2004；嚴(yán)守雷，2005，2006，2007；劉煥云，2011；覃海明，2015；徐燕燕2016)，蓮藕中酚類化合物的指紋特征尚不清晰。研究蓮藕酚類化合物指紋圖譜對完善蓮藕加工技術(shù)體系，實現(xiàn)加工原料的質(zhì)量控制具有重要意義。

現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)存在的問題歸納為以下兩點：(1)蓮藕的種質(zhì)資源豐富，相關(guān)的品種鑒別技術(shù)均依托于幼嫩葉片的生物指紋圖譜，尚無法直接針對藕原料進行品種鑒別，亦無法應(yīng)用于藕產(chǎn)品質(zhì)量控制。(2)基于酚類化合物多樣性和復(fù)雜性的化學(xué)指紋圖譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物資源的品種鑒別，然而蓮藕酚類化合物的指紋特征尚不清晰，在蓮藕品種鑒別中的應(yīng)用前景亦不明確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種蓮藕酚類化合物指紋圖譜的構(gòu)建方法，其針對蓮藕皮部和節(jié)部的酚類化合物構(gòu)建二元指紋圖譜，從酚類化合物分布、含量和組成等多角度反映品種之間的差異，有利于提高蓮藕品種鑒別的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種蓮藕酚類化合物指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1)蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)，藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮和藕節(jié)兩種供試部位，分別粉碎至5-20目待用；

2)將步驟1)中粉碎的藕皮和藕節(jié)分別進行酚類化合物浸提處理，得藕皮酚類化合物供試液和藕節(jié)酚類化合物供試液；

3)以步驟2)得到的藕皮酚類化合物供試液和藕節(jié)酚類化合物供試液為試樣，分別進行高效液體色譜檢測，得藕皮酚類化合物指紋圖譜和藕節(jié)酚類化合物指紋圖譜；

4)重復(fù)步驟1)、2)和3)得到多個不同品種蓮藕的藕皮和藕節(jié)相應(yīng)的酚類化合物指紋圖譜，通過Chempattern軟件進行指紋圖譜的比對分析，分別確定8個共有峰，并以共有峰分別建立藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以有如下進一步的具體化。

具體的，步驟1)中藕皮的厚度為0.8-1.2mm。

具體的，步驟2)中的酚類化合物浸提處理的具體內(nèi)容為：按1g:8～12mL的料液比將步驟1)中粉碎的供試部位加入預(yù)冷至4℃的浸提液中，在8000～12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理3～5min，勻漿經(jīng)10000r/min離心5min，固液分離得一次提取液和殘渣，殘渣以1g:8～12mL的料液比加入預(yù)冷至4℃的浸提液，在6000～8000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理3～5min，勻漿經(jīng)10000r/min離心5min，固液分離得二次提取液和殘渣；合并一次提取液和二次提取液，在50℃水浴下真空濃縮至約10mL，全部轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中并用甲醇定容，采用0.45μm針頭過濾器過濾后得到相應(yīng)的酚類化合物供試液。

具體的，所述浸提液為甲醇、甲酸和水的混合液，混合液中甲醇的濃度為80wt％，甲酸的濃度為2wt％。

具體的，步驟3)中的高效液相色譜的檢測條件為：色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，規(guī)格為250×4.6mm，粒徑為5μm，柱溫為30℃；檢測波長為280nm；流動相A為乙腈，流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.4％的乙酸溶液，梯度洗脫時間0min→30min→40min→55min→65min對應(yīng)的流動相A/B體積比為5：95→25:75→50:50→5:95→5:95，流速為1.0mL/min；進樣體積為20μL。

具體的，步驟4)中通過Chempattern軟件分確定藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜時，均以最小共有峰值在5％以上確定8個共有特征峰。

具體的，步驟4)中的多個不同品種蓮藕的數(shù)量為13個以上。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)基于幼嫩葉遺傳物質(zhì)多態(tài)性構(gòu)建的生物指紋圖譜雖能有效鑒別蓮藕不同品種，但應(yīng)用局限于遺傳資源研究和鑒定，尚無法對藕原料進行品種鑒別。本發(fā)明構(gòu)建蓮藕酚類化合物指紋圖譜有望解決現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用存在的缺陷。

2)本發(fā)明在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的方法中對主要共有指紋特征峰進行鑒別，解決了傳統(tǒng)指紋圖譜中主成分不明確的問題，將指紋圖譜的整體性和成分特異性進行有機結(jié)合。

3)研究發(fā)現(xiàn)藕皮和藕節(jié)中酚類化合物的含量及組成成分?jǐn)?shù)量均明顯高于食用部位，針對酚類化合物在蓮藕組織中的分布差異性，選擇皮部和節(jié)部建立酚類化合物指紋圖譜，強化了指紋圖譜信息的多態(tài)性。

4)相比單一指紋圖譜，針對蓮藕皮部和節(jié)部的酚類化合物構(gòu)建二元指紋圖譜，從酚類化合物分布、含量和組成等多角度反映品種之間的差異，有利于提高鑒別的準(zhǔn)確性。

5)本發(fā)明中建立的蓮藕酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可用于蓮藕酚類提取物產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定。

附圖說明

圖1為本發(fā)明構(gòu)建的藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

圖2為本發(fā)明構(gòu)建的藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

圖3為多品種蓮藕藕皮酚類化合物指紋圖譜；

圖4為多品種蓮藕藕節(jié)酚類化合物指紋圖譜；

圖5為對比例中藕食用部位酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的作進一步的詳細描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

以下實施例及對比例中所用到的不同品種蓮藕為13種，具體為：鄂蓮5號、鄂蓮6號、鄂蓮7號、鄂蓮8號、應(yīng)城白蓮、走馬羊、貴溪浮藕、巴河藕、白泡子、博白藕、武植2號、8143、常州漂江。由國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃提供，取樣時間為2015年10月。

實施例

一種蓮藕酚類化合物指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1)蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)，藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮和藕節(jié)兩種供試部位，分別粉碎至5-20目待用；

2)取粉碎的藕皮5.0g，按料液比(g/mL)1:10加入預(yù)冷至4℃的浸提液(含80wt％甲醇和2wt％甲酸)，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理3min，勻漿經(jīng)10000r/min離心5min分離浸提液和殘渣；殘渣以料液比(g/mL)1:10加入預(yù)冷至4℃的浸提液(含80％甲醇和2％甲酸)，在6000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理5min，勻漿經(jīng)10000r/min離心5min分離浸提液和殘渣；合并兩次離心分離得到的浸提液，在50℃水浴下真空濃縮至約10mL，以甲醇全部轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中并定容，采用0.45μm針頭過濾器過濾后得到藕皮酚類化合物供試液；另外，取粉碎的藕節(jié)5.0g，按上述步驟制得藕節(jié)酚類化合物供試液；

3)以步驟2)得到的藕皮酚類化合物供試液和藕節(jié)酚類化合物供試液為試樣，分別進行高效液體色譜檢測，檢測條件為：紫外檢測器波長為280nm；色譜柱為Luna C18(2)(規(guī)格250×4.6mm，粒徑5μm，美國Phenomenex公司)，柱溫為30℃；流動相A為乙腈，流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.4％的乙酸溶液，梯度洗脫時間0min→30min→40min→55min→65min對應(yīng)的流動相A/B體積比為5：95→25:75→50:50→5:95→5:95，流速為1.0mL/min；進樣體積為20μL，得藕皮酚類化合物指紋圖譜和藕節(jié)酚類化合物指紋圖譜；

4)重復(fù)步驟1)、2)和3)得到13個不同品種蓮藕的藕皮和藕節(jié)相應(yīng)的指紋圖譜，通過Chempattern軟件進行指紋圖譜的比對分析，分別確定8個共有峰，并以共有峰分別建立藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖1所示：以最小共有峰值不低于5％確定8個共有特征峰，其保留時間分別為5.44、11.02、16.97、18.38、25.06、25.52、26.21、32.02min，保留時間RSD分別為2.50％、2.52％、1.06％、1.15％、0.78％、0.48％、0.66％、0.43％。

圖1中各共有峰的詳細信息如下表所示(結(jié)合內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法鑒別色譜圖中各峰對應(yīng)的酚類化合物)：

藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖2所示：以最小共有峰值不低于5％確定8個共有特征峰，其保留時間分別為5.44、10.02、11.02、16.97、18.38、24.99、26.21、32.02min，保留時間RSD分別為1.98％、0.48％、0.45％、0.24％、0.08％、0.66％、0.67％、0.23％。

圖2中各共有峰的詳細信息如下表所示(結(jié)合內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法鑒別色譜圖中各峰對應(yīng)的酚類化合物)：

以上兩表中各自8個共有峰的保留時間RSD值<2.50％，表明蓮藕皮酚類物質(zhì)測定的重復(fù)性較好；但峰面積RSD值介于23.81～65.67％，說明13個品種蓮藕皮部的酚類物質(zhì)含量存在較大差異。

為了證實本發(fā)明提供的蓮藕酚類化合物指紋圖譜的構(gòu)建方法的可行性，以下通過方法學(xué)考察、指紋圖譜相似度考察和對比例進行說明。

方法學(xué)考察

1.精密度試驗

1.1稱取粉碎的藕皮5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備藕皮酚類化合物供試液，然后按本發(fā)明提供的方法進行高效液相色譜檢測，連續(xù)進樣5次，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<2.41％，相對峰面積RSD<1.54％，表明方法精密度良好。

1.2稱取粉碎的藕節(jié)5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備蓮藕節(jié)酚類化合物供試液，然后按本發(fā)明提供的方法進行高效液相色譜檢測，連續(xù)進樣5次，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<2.41％，相對峰面積RSD<1.54％，表明方法精密度良好。

2.穩(wěn)定性試驗

2.1稱取粉碎的藕皮5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備藕皮酚類化合物供試液，分別于0、4、8、12和24h進行高效液相色譜檢測，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<2.45％，相對峰面積RSD<2.48％，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.2稱取粉碎的藕節(jié)5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備藕節(jié)酚類化合物供試液，分別于0、4、8、12和24h進行高效液相色譜檢測，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<1.89％，相對峰面積RSD<2.15％，表明方法穩(wěn)定性良好。

3.重復(fù)性試驗

3.1稱取粉碎的藕皮5份，每份質(zhì)量為5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備藕皮酚類化合物供試液，然后按本發(fā)明提供的方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<2.37％，相對峰面積RSD<2.21％，表明方法重復(fù)性良好。

3.2稱取粉碎的藕節(jié)5份，每份質(zhì)量為5.0±0.1g，按本發(fā)明提供的方法制備藕節(jié)酚類化合物供試液，然后按本發(fā)明提供的方法進行高效液相色譜檢測，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間RSD<1.78％，相對峰面積RSD<2.63％，表明方法重復(fù)性良好。

指紋圖譜相似度考察

1.藕皮酚類化合物指紋圖譜相似度考察

采用Chempattern軟件分析13個品種蓮藕皮部酚類化合物指紋圖譜(圖3)，以最小共有峰值不低于5％確定8個共有特征峰，以共有峰建立藕皮酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(圖1)。采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)和歐氏距離三種相似度分析方法，借助Chempattern軟件分析該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與13個品種蓮藕皮部酚類化合物指紋圖譜的相似性，計算結(jié)果如下表所示：

上表中，匹配峰數(shù)目中“+”號前面的數(shù)字表示匹配峰的數(shù)目，“+”號后面的數(shù)字表示未匹配的峰數(shù)目。上表中匹配峰數(shù)目、未匹配峰相對面積及相似度共五項數(shù)據(jù)因蓮藕品種的不同而有明顯差異，故可據(jù)此對蓮藕的不同品種進行鑒別，也即發(fā)明提供的方法構(gòu)建的指紋圖譜能夠用于對蓮藕品種進行鑒別。

2.藕節(jié)酚類化合物指紋圖譜相似度考察

采用Chempattern軟件分析12個品種蓮藕節(jié)部酚類化合物指紋圖譜(圖4，未包括博白藕)，以最小共有峰值不低于5％確定8個共有特征峰，以共有峰建立藕節(jié)酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(圖2)。采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)和歐氏距離三種相似度分析方法，借助Chempattern軟件分析該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與12個品種蓮藕節(jié)部酚類化合物指紋圖譜的相似性，計算結(jié)果如下表所示：

上表中，匹配峰數(shù)目中“+”號前面的數(shù)字表示匹配峰的數(shù)目，“+”號后面的數(shù)字表示未匹配的峰數(shù)目。上表中匹配峰數(shù)目、未匹配峰相對面積及相似度值共五項數(shù)據(jù)因蓮藕品種的不同而有明顯差異，故可據(jù)此對蓮藕的不同品種進行鑒別，也即發(fā)明提供的方法構(gòu)建的指紋圖譜能夠用于對蓮藕品種進行鑒別。

對比例

以去了皮和節(jié)剩下的蓮藕部位(食用部位)，使用與實施例中相同的方法獲得13個不同品種蓮藕的食用部位酚類化合物指紋圖譜，然后使用Chempattern軟件對其進行分析比對，以最小共有峰值不低于5％確定僅有3個共有特征峰，以此3個共有峰建立蓮藕食用部位酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖5所示。因只有3個共有特征峰信息，信息量偏少，故不適于蓮藕不同品種的鑒別。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。