本發(fā)明屬于生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種定量檢測牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法。
背景技術(shù)：
：定量蛋白質(zhì)組學(xué)的目的是對復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并對蛋白質(zhì)的量及量的變化進(jìn)行準(zhǔn)確的測定，是當(dāng)前系統(tǒng)生物科學(xué)研究的重要內(nèi)容。近年來，由于質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，定量蛋白質(zhì)組學(xué)在分析蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組方面已取得了令人矚目的成就。在種種成熟的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)中，應(yīng)用三重四極桿質(zhì)譜(triplequadrupole)，在選擇反應(yīng)監(jiān)控模式(selectedreactionmonitoring，srm)中，對蛋白質(zhì)中特異肽進(jìn)行檢測，在完全酶解的情況下，特異肽的摩爾濃度與對應(yīng)蛋白質(zhì)的摩爾濃度相同，故可以通過其與蛋白質(zhì)分子量計算獲得蛋白質(zhì)的濃度。公開號為cn103616454a的專利文獻(xiàn)公開了一種定量檢測人β-酪蛋白含量的方法以及試劑盒，該方法中利用人β-酪蛋白酶解后所獲得的特異多肽序列，設(shè)計出同位素標(biāo)記的特異肽和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的序列，并基于內(nèi)標(biāo)法對人β-酪蛋白進(jìn)行定量檢測。公開號為cn103642895a的專利文獻(xiàn)公開了一種定量檢測人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒。該專利文獻(xiàn)利用人α-乳白蛋白酶解后所獲得的特異多肽序列，設(shè)計出同位素標(biāo)記的特異肽和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的序列，并基于內(nèi)標(biāo)法對人α-乳白蛋白進(jìn)行定量檢測。上述方法中，通過同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)記策略，提高特異肽的檢測準(zhǔn)確度，但是若蛋白質(zhì)未完全將所有的特異肽酶解釋放出來時，那么上述方法將不能準(zhǔn)確的測定得到的特異肽的濃度，即不能準(zhǔn)確的換算出蛋白質(zhì)的含量。而現(xiàn)有技術(shù)中，對于蛋白質(zhì)酶解效果的檢測一直缺乏一種簡單有效的方法，因此如何對蛋白質(zhì)的酶解效果進(jìn)行快速而且有效的檢測，對于后續(xù)所有提高特異肽檢測準(zhǔn)確度的研究至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種定量檢測牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法，提高牛羊乳中蛋白質(zhì)含量檢測的準(zhǔn)確度。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種定量檢測牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法，包括以下步驟：(1)以與待測牛羊乳樣品中加入蛋白酶酶解得到酶解物；(2)對所述酶解物中驗證肽和特異肽進(jìn)行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果驗證待測蛋白質(zhì)樣品的酶解效果；若通過酶解效果驗證，表示特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則用所獲得的特異肽濃度乘以待測蛋白質(zhì)樣品的分子量獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；若未通過酶解效果驗證，表示特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則將酶解物再次進(jìn)行酶解優(yōu)化處理；所述驗證肽中至少含有一個或一個以上在待測蛋白質(zhì)中最后被所述酶所酶解的位點(diǎn)；或，所述驗證肽為所述特異肽向n端或者c端延長至一個或一個以上酶解位點(diǎn)的多肽。(3)待特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到后，將所述酶解物經(jīng)由質(zhì)譜檢測；(4)制作待測蛋白質(zhì)的特異肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)將步驟(3)得到的檢測結(jié)果代入步驟(4)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，獲得樣品的特異肽摩爾濃度，然后按下式計算獲得待測蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；待測蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度＝待測樣品中待測蛋白特異肽摩爾濃度×待測蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量。本發(fā)明中對于驗證肽的選擇來說，能被相應(yīng)酶完全酶解的待測蛋白質(zhì)樣品，驗證肽中至少含有最后被所述酶所酶解的位點(diǎn)；但是對于部分蛋白質(zhì)來說，難以完全酶解，因此本發(fā)明對于此類蛋白質(zhì)來說，可以選擇特異肽向n端或者c端延長至少一個以上酶解位點(diǎn)的多肽作為驗證肽。本發(fā)明中若酶解物中不含有所述驗證肽時，則所述待測蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，可以對特異肽的濃度進(jìn)行測定，再通過特異肽的濃度測定結(jié)果換算出待測蛋白質(zhì)的含量；反之，若酶解物中含有所述驗證肽時，則所述待測蛋白質(zhì)樣品未完全酶解釋放得到特異肽，則所述待測蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，待測蛋白質(zhì)樣品還需再次進(jìn)行酶解，并重復(fù)上述驗證過程。作為優(yōu)選，所述待測蛋白質(zhì)與其特異肽的對應(yīng)關(guān)系為：一般來說，為每個蛋白質(zhì)只需選擇一條多肽作為特異肽。在此情況下，所以無需追求蛋白質(zhì)徹底水解，只要保證所選擇的特異肽完全釋放出來即可。因此本發(fā)明在此情況下，本發(fā)明還可以選擇特異肽向n端或者c端延長至一個或一個以上酶解位點(diǎn)的多肽作為驗證肽。本發(fā)明中驗證肽的選擇有多種，作為優(yōu)選，所述驗證肽為所述特異肽向特異肽的n端延長至下一個酶解位點(diǎn)的多肽。對于位于蛋白質(zhì)c端的特異肽，可以選擇向n端延伸至下一個酶解位點(diǎn)的多肽作為驗證肽。作為優(yōu)選，所述驗證肽為所述特異肽向特異肽的c端延長至下一個酶解位點(diǎn)的多肽。對于位于蛋白質(zhì)n端的特異肽，可以選擇向c端延伸至下一個酶解位點(diǎn)的多肽作為驗證肽。作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述驗證肽和特異肽采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測。本發(fā)明中對驗證肽進(jìn)行檢測時，可以采用與特異肽相同的檢測方法，其中預(yù)處理方法和儀器通用參數(shù)與特異肽完全一致，僅增加驗證肽專屬的srm參數(shù)。因此本發(fā)明可以在不增加實(shí)驗操作和成本的前提下，僅通過參數(shù)的設(shè)置即能完成本發(fā)明，從而本發(fā)明具有很高的便利性和實(shí)用性。作為優(yōu)選，在步驟(1)和步驟(4)中加入同位素標(biāo)記的同位素特異肽作為內(nèi)標(biāo)，并且采用同位素稀釋法進(jìn)行檢測和計算。本發(fā)明人工合成同位素內(nèi)標(biāo)，在樣品預(yù)處理階段和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備階段加入，用同位素稀釋法的原理進(jìn)行檢測和結(jié)果計算，以提高檢測準(zhǔn)確度和精密度。作為優(yōu)選，所述待測蛋白質(zhì)與所述同位素特異肽的對應(yīng)關(guān)系為：其中v*是[13c5,15n]-纈氨酸，i*是[13c6,15n]-異亮氨酸，l*是[13c6,15n]-亮氨酸，f*是[13c9,15n]-苯丙氨酸。同位素特異肽與特異肽的序列相同，兩者的區(qū)別僅在于：同位素特異肽與特異肽上的某些元素互為同位素。本發(fā)明中采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對驗證肽進(jìn)行檢測時，為了降低檢測誤差，本發(fā)明需要合理設(shè)置驗證肽的檢測參數(shù)，由于儀器品牌型號、狀態(tài)、信號的表達(dá)方式的差異，相同濃度的驗證肽在不同設(shè)備上所產(chǎn)生的信號也不同。所以驗證肽的閾值無法是一個絕對值，而是是一個相對值，作為優(yōu)選，所述驗證肽的信號強(qiáng)度閾值設(shè)置為所述特異肽信號強(qiáng)度的1％。若驗證肽的信號強(qiáng)度小于所述驗證肽的信號強(qiáng)度閾值時，則特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到。作為優(yōu)選，所述驗證肽的信噪比低于3。若驗證肽的信號強(qiáng)度小于所述驗證肽的信噪比時，則特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到。針對蛋白質(zhì)含量特別低的樣品(例如乳糖)，作為優(yōu)選，將所述步驟(1)中的酶解物進(jìn)行富集純化操作。通過富集純化操作，提高樣品中多肽濃度，降低基質(zhì)濃度，使本發(fā)明適用于更為廣泛的濃度范圍。作為優(yōu)選，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，所述的待測蛋白質(zhì)的特異肽可由人工合成方法獲得，或者通過待測蛋白質(zhì)酶解的辦法獲得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明中若酶解物中含有驗證肽時，則待測蛋白質(zhì)樣品未完全酶解釋放得到特異肽；反之，則待測蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，待測蛋白質(zhì)樣品還需再次進(jìn)行酶解并重復(fù)上述驗證肽的檢測，直至酶解物中不含有驗證肽。因此本發(fā)明中可以對于待測蛋白質(zhì)是否酶解完全釋放得到所對應(yīng)的特異肽進(jìn)行驗證，以獲得準(zhǔn)確的特異肽的濃度，進(jìn)而準(zhǔn)確的換算出待測蛋白質(zhì)的含量。具體實(shí)施方式實(shí)施例1以合成的特異肽為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測牛羊奶粉中6種蛋白質(zhì)的含量。樣品預(yù)處理方式：稱取10g樣品于100ml容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料離心管中，依次加入10μl混合同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；再加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴鍋中反應(yīng)2h；加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾，通過用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜進(jìn)樣分析，其中目標(biāo)多肽(特異肽)和子離子信息見表1，液相色譜條件和質(zhì)譜條件高效液相色譜分離條件如下：色譜柱為c18色譜柱，柱溫為40℃；流動相a為體積百分比為0.1％的甲酸的乙腈溶液，流動相b為體積百分比為0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3ml/min；其中，梯度洗脫為：流動相a的體積百分比由3％耗時10min上升至40％，對應(yīng)地流動相b的體積百分比由97％耗時10min下降至60％，然后改為100％流動相a沖洗2min，最后改為流動相a體積百分比3％和流動相b體積百分比97％保留3min；進(jìn)樣分析質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900l/min，錐孔反吹氣流量：30l/hr，碰撞室壓力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5v，高端分辨率1：15.0v，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8v，高端分辨率2：15.0v，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0v，入口透鏡電壓：0.5v，出口電壓：0.5v，碰撞梯度：1.0。特異肽標(biāo)準(zhǔn)曲線預(yù)處理方式：將合成的特異肽用水稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，取10μl標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，依次加入10μl混合同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和845μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min，加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾，進(jìn)樣分析，分析參數(shù)同上。樣品完全酶解的驗證方式：在檢測過程中為每條特異肽設(shè)置一條驗證肽，驗證肽是以特異肽為基礎(chǔ)，向n端或者c端延伸到下一個胰蛋白酶酶解位點(diǎn)。當(dāng)驗證肽的信號強(qiáng)度小于閾值時，認(rèn)為該特異肽已經(jīng)完全酶解。由于儀器品牌型號、狀態(tài)、信號的表達(dá)方式的差異，相同濃度的驗證肽在不同設(shè)備上所產(chǎn)生的信號也不同。所以驗證肽的閾值無法是一個絕對值，而是是一個相對值，本方法將驗證肽的閾值設(shè)置為對應(yīng)的特異肽的1％。若驗證肽信號大于閾值，需要將樣品再次酶解，并且可以適量提高酶解時間和酶濃度。驗證肽的分析參數(shù)見表2。樣品計算方式：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＝特異肽的摩爾濃度×蛋白質(zhì)的分子量結(jié)果見表3表1特異肽和同位素特異肽的檢測參數(shù)表2驗證肽檢測參數(shù)表3檢測結(jié)果實(shí)施例2用不同來源的牛奶和羊奶按照比例(質(zhì)量比)配制混合樣品，冷凍干燥后，在未告知濃度的情況下，以盲樣形式進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果，參見表4。表4檢測結(jié)果顯示，測得值與設(shè)計值具有高度相關(guān)性，證實(shí)了本發(fā)明的準(zhǔn)確性。除此之外，樣品制備單位和檢測單位采用不同的羊奶和牛奶用于樣品制備和檢測，說明本發(fā)明所選擇的多肽具有普遍性，在不同來源的樣品中均能獲得穩(wěn)定的檢測結(jié)果。實(shí)施例3乳糖主要是牛奶、羊奶中分離純化得到的，在配方奶粉中需要乳糖，若乳糖引入異源蛋白質(zhì)，會影響產(chǎn)品物種源性方面的純度和品質(zhì)。本實(shí)施例搜集了一個乳糖樣品，對其中牛源性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。首先按照實(shí)施例1的方式進(jìn)行檢測，結(jié)果見下表。作為優(yōu)化方法，在實(shí)施例1“加入5μl甲酸溶液”步驟之后加入純化富集操作。具體如下：(1)用3ml的甲醇活化c18固相萃取柱；(2)用10ml的純水平衡c18固相萃取柱；(3)加入5ml酶解溶液，緩速滴干后，用10ml的純水清洗；(4)用5ml甲醇水溶液(70/30，v/v)洗脫，搜集洗脫液后冷凍干燥；(5)用0.5ml純水復(fù)溶。上述兩種方法均重復(fù)三次，結(jié)果見表5。表5方法平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)施例117.2mg/kg8.7mg/kg50.6％優(yōu)化后的實(shí)施例122.5mg/kg1.3mg/kg5.8％用上述兩個方法都能得到相似的檢測結(jié)果，但是單純使用實(shí)施例1所述方法會產(chǎn)生非常大的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。主要原因是在乳糖樣品中蛋白質(zhì)含量偏低，未經(jīng)過富集，其濃度處于儀器檢測范圍的下限附近，雖然可以獲得濃度，但是其偏差較大，難以獲得較為精準(zhǔn)的檢測結(jié)果。倘若單純使用蒸發(fā)等濃縮方式，會使樣品中大量的乳糖析出，樣品無法進(jìn)樣。本發(fā)明優(yōu)選固相萃取的方式進(jìn)行濃縮，可以提高樣品濃度的同時，降低基質(zhì)中的雜質(zhì)。當(dāng)前第1頁12