本發(fā)明涉及一種光譜檢測方法，具體是一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法。

背景技術(shù)：

胱氨酸(cystine，Cys) (C6H12N2O4S2，Mr=240.30)是兩分子半胱氨酸經(jīng)氧化得到的氨基酸，是一種含硫氨基酸，屬于二硫化物類，學名“二(β-硫-α-氨基丙酸)”；是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，廣泛存在于頭發(fā)、骨、角蛋白中，人發(fā)中的含量約為5％（以質(zhì)量計），人體中的正常值為4.40～11.52μmol/L。

胱氨酸在醫(yī)藥上作為營養(yǎng)強化劑，有促進機體細胞氧化和還原功能，改善肝臟功能、促使白細胞增生等作用，并可中和毒素、阻止病原菌生長；由于胱氨酸在生理學研究中的重要性，是應用廣泛的氨基酸類藥物；胱氨酸片劑收載在《中華人民共和國藥典》（2015年版）（二部）（化學藥品1896），采用的是傳統(tǒng)的溴酸鉀滴定比色法，操作繁瑣且誤差較大；隨著技術(shù)發(fā)展，相關儀器分析方法研究甚多，目前報道的有原子發(fā)射光譜法（ICP-AES ）、氨基酸分析儀測定法（AA）、高效液相色譜法（HPLC） 、分光光度法(UV)、高效毛細管電泳法(HPCE) 、電化學法（EC）、流動注射熒光光度法(FI-FL)、高效液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC-MS）等；這些方法常受到共存氨基酸的干擾，對非單一胱氨酸體系選擇性不好；電化學分析法通常采用不同種類的氨基酸選擇性電極對各種氨基酸進行測定；利用胱氨酸在電極上發(fā)生氧化反應時所呈現(xiàn)出的電活性，可不經(jīng)衍生化處理，利用胱氨酸與金屬離子配位反應可間接測定其含量，但是存在干擾較大的問題；高效液相色譜法特別是對柱前衍生-反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析方法更加靈敏（可測知<1pmol水平）和快速（完成一種蛋白質(zhì)的水解、分離和測定只需12～30min）；但RP-HPLC要求將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適于反相色譜分離并能被靈敏檢測的衍生物，因此，存在儀器設備昂貴，衍生化試劑較難選擇且衍生化時間長衍生化產(chǎn)物組分復雜等問題；其他儀器分析方法均需通過顯示劑對胱氨酸進行衍生化后間接測定，存在衍生化時間長、衍生化產(chǎn)物組分復雜和穩(wěn)定性差等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法，該方法包括以下步驟：

步驟一：胱氨酸標準溶液的配制，用電子天平稱取1.2015g的L-胱氨酸，用適量的氫氧化鈉溶解，調(diào)節(jié)pH，并用蒸餾水定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol∕L的溶液，之后可以根據(jù)需要將儲備液進行稀釋，臨用配制作為操作液；

步驟二：稱取0.6057g的三羥甲基氨基甲烷（Tris），用蒸餾水溶解并定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol/L的溶液；將50mL0.1mol/L Tris溶液與7.0mL0.1mol/L的鹽酸混勻并稀釋至100mL，配制成0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液；

步驟三：熒光光譜的實驗，準確移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸標準溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl緩沖溶液，再加蒸餾水定容L，搖勻，室溫靜置15 min；在水浴加熱后，于Cary Eclipse 和F-7000熒光分光光度計上測量；設置各項熒光光譜測量參數(shù)如下：激發(fā)波長：410 nm；狹縫比5.0nm/5.0nm；發(fā)射光譜波長范圍：415～700 nm；掃描速度：中速； 將反應后胱氨酸溶液在FLS920熒光光譜儀上測定其熒光量子產(chǎn)率，在FS5熒光光譜儀上測定熒光壽命；

步驟四：胱氨酸片樣品的熒光光譜測定；準確移取市售胱氨酸片10片，用研缽研細，用電子天平準確稱取0.1g，加到10mL潔凈干燥的比色管中，加少量堿溶后加水定容超聲溶解后，過濾；取1mL于10mL潔凈干燥的比色管中，加的Tris-HCl緩沖溶液，再加蒸餾水定容，搖勻，室溫靜置15 min；水浴加熱后，制成溶液；于熒光分光光度計上，設置狹縫5.0nm/5.0nm，最佳激發(fā)波長Ex=410nm，在415～700nm掃描范圍內(nèi)進行熒光光譜分析；同時用二次水進行空白實驗。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述Tris-HCl緩沖溶液的pH=8.9。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述Tris-HCl緩沖溶液用量為5mL。

所述水浴加熱時間為12小時。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述水浴加熱的加熱溫度為90℃。

作為本發(fā)明再進一步的方案：按實驗方法中的步驟，取反應后堿性胱氨酸溶液于熒光分光光度計上連續(xù)測定標準溶液熒光9次，取其熒光強度計算其標準偏差為6.119，則RSD值為1.08%，偏差較小，說明該熒光體系有較好的精確性。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述熒光強度在一定范圍內(nèi)隨著胱氨酸濃度的增加而增強，線性范圍為1×10^-4mol/L -1×10^-3 mol/L，相關系數(shù)r=0.9927擬合的線性方程為：Y=-19.02+4.524×10⁴C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10^-5mol/L，K為工作曲線的斜率。

作為本發(fā)明再進一步的方案：取1支25mL潔凈干燥的比色管，按實驗方法中的步驟，在水浴溫度90℃下加熱12小時，于2小時內(nèi)在熒光分光光度計上每隔10min測定其熒光強度，結(jié)果表明，在后100min內(nèi)熒光強度基本不變。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明精密度高，準確度好；反應條件溫和，所用儀器成本較低；無需復雜前處理過程，操作過程簡單，省時省力；所用溶劑簡單易得，對操作人員傷害小，污染少。

附圖說明

圖1為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法的胱氨酸熒光光譜圖。

圖2為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法的熒光壽命圖。

圖3為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法中不同pH值熒光強度的影響示意圖。

圖4、5為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法的緩沖溶液的用量對熒光強度的影響示意圖。

圖6為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法中加熱時間對熒光強度的影響示意圖。

圖7、8為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法的加熱溫度對熒光強度的影響示意圖。

圖9為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法中體系的穩(wěn)定性實驗示意圖。

圖10、11為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法的胱氨酸標準溶液的工作曲線示意圖。

圖12為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法中胱氨酸片含量測定結(jié)果（n=6）。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

請參閱圖1～12，本發(fā)明實施例中，一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接熒光光譜檢測方法，該方法包括以下步驟：

步驟一：胱氨酸標準溶液的配制，用電子天平稱取1.2015g的L-胱氨酸，用適量的氫氧化鈉溶解，調(diào)節(jié)pH，并用蒸餾水定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol∕L的溶液，之后可以根據(jù)需要將儲備液進行稀釋，臨用配制作為操作液；

步驟二：稱取0.6057g的三羥甲基氨基甲烷（Tris），用蒸餾水溶解并定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol/L的溶液；將50mL0.1mol/L Tris溶液與7.0mL0.1mol/L的鹽酸混勻并稀釋至100mL，配制成0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液；

步驟三：熒光光譜的實驗，準確移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸標準溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl緩沖溶液，再加蒸餾水定容L，搖勻，室溫靜置15 min；在水浴加熱后，于Cary Eclipse 和F-7000熒光分光光度計上測量；設置各項熒光光譜測量參數(shù)如下：激發(fā)波長：410 nm；狹縫比5.0nm/5.0nm；發(fā)射光譜波長范圍：415～700 nm；掃描速度：中速； 將反應后胱氨酸溶液在FLS920熒光光譜儀上測定其熒光量子產(chǎn)率，在FS5熒光光譜儀上測定熒光壽命；

步驟四：胱氨酸片樣品的熒光光譜測定；準確移取市售胱氨酸片10片，用研缽研細，用電子天平準確稱取0.1g，加到10mL潔凈干燥的比色管中，加少量堿溶后加水定容超聲溶解后，過濾；取1mL于10mL潔凈干燥的比色管中，加的Tris-HCl緩沖溶液，再加蒸餾水定容，搖勻，室溫靜置15 min；水浴加熱后，制成溶液；于熒光分光光度計上，設置狹縫5.0nm/5.0nm，最佳激發(fā)波長Ex=410nm，在415～700nm掃描范圍內(nèi)進行熒光光譜分析；同時用二次水進行空白實驗。

所述Tris-HCl緩沖溶液的pH=8.9。

所述Tris-HCl緩沖溶液用量為5mL。

所述水浴加熱時間為12小時。

所述水浴加熱的加熱溫度為90℃。

按實驗方法中的步驟，取反應后堿性胱氨酸溶液于熒光分光光度計上連續(xù)測定標準溶液熒光9次，取其熒光強度計算其標準偏差為6.119，則RSD值為1.08%，偏差較小，說明該熒光體系有較好的精確性。

所述熒光強度在一定范圍內(nèi)隨著胱氨酸濃度的增加而增強，線性范圍為1×10^-4mol/L -1×10^-3 mol/L，相關系數(shù)r=0.9927擬合的線性方程為：Y=-19.02+4.524×10⁴C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10^-5mol/L，K為工作曲線的斜率。

取1支25mL潔凈干燥的比色管，按實驗方法中的步驟，在水浴溫度90℃下加熱12小時，于2小時內(nèi)在熒光分光光度計上每隔10min測定其熒光強度，結(jié)果表明，在后100min內(nèi)熒光強度基本不變。

對于本領域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應將權(quán)利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權(quán)利要求。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術(shù)人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。