本發(fā)明屬于痕量分析技術領域，具體涉及一種能夠檢測復雜基質(zhì)中精喹禾靈及其代謝物殘留的方法。

背景技術：

精喹禾靈是由日本日產(chǎn)化學工業(yè)株式會社開發(fā)的苯氧羧酸酯類內(nèi)吸傳導型莖葉處理除草劑。其作用機理主要是：抑制細胞脂肪酸合成，抑制乙酰CoA羧化酶，破壞分生組織生長，使雜草死亡。研究發(fā)現(xiàn)，精喹禾靈對人體具有致突變作用，已被歐盟等國家列為逐漸淘汰名錄。但在我國，精喹禾靈仍然作為一種廣泛生產(chǎn)和使用的優(yōu)良除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛和大量使用。除此之外，國家對精喹禾靈在各種作物中的限量制定較少，缺乏有效監(jiān)督，導致使用存在較大的盲目性，生產(chǎn)事故時有發(fā)生。因此，建立精喹禾靈在作物中殘留量的分析與檢測方法，規(guī)范用藥，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民健康具有重要意義。

精喹禾靈主要代謝為精喹禾靈酸。研究表明，精喹禾靈酸毒性遠高于其母體。在分析精喹禾靈的同時，需要特別關注其代謝物的產(chǎn)生和含量變化。作為除草劑，精喹禾靈含量較低，尤其作為其代謝物，含量極難檢測。復雜的基質(zhì)背景會對被低含量的分析目標化合物的提取、凈化和測定等帶來很大困難，因此樣品前處理不僅復雜困難，而且對于分析結果的準確可靠和靈敏度具有決定性作用。

經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前關于精喹禾靈殘留量的測定方法，雖然能夠保證精喹禾靈在簡單基質(zhì)中的提取效率，但存在以下不足：1)采用液液分配或固相萃取的凈化方法不僅操作復雜，浪費試劑，而且對含大量色素、油脂、雜質(zhì)的復雜樣品凈化效果重現(xiàn)性差，雜質(zhì)峰極易干擾檢測結果。2)精喹禾靈和精喹禾靈酸極性差異較大，難以通過一種液液分配或固相萃取的凈化方法去除雜質(zhì)，需要采用兩種及以上方法凈化，操作復雜，中間極易造成殘留量損失。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種操作較簡單、對目標物干擾少，準確檢測復雜基質(zhì)中精喹禾靈及其代謝物殘留的方法。該方法具有簡便迅速、準確可靠的特點，對指導精喹禾靈的安全合理使用，控制食品和作物中精喹禾靈殘留具有重要價值。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種檢測復雜基質(zhì)中精喹禾靈及其代謝物殘留的方法，該凈化方法為基質(zhì)固相分散萃取方法，具體包括以下步驟：

(1)提?。悍Q取樣品于離心管中，加入乙腈，渦旋振蕩，加入鹽包、渦旋振蕩、離心，取上清液；

(2)凈化：量取步驟(2)中提取液于離心管中，然后加入凈化劑進行基質(zhì)固相分散萃取，渦旋、離心，取上清液；

(3)標準溶液的配制：稱取精喹禾靈及其代謝物標準品，用有機溶劑溶解定容，制成標準儲備液，將標準儲備液逐級稀釋，配制成系列濃度標準工作液；

(4)儀器檢測：用步驟(1)中的系列濃度標準工作液進樣，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MSMS)檢測，在此基礎上，對步驟(3)收集的凈化樣品進行HPLC-MS/MS檢測；

(5)標準曲線的建立：采用峰面積定量，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線；

(6)結果分析：按以下公式計算試樣中農(nóng)藥的含量

R—樣品中所含農(nóng)藥殘留量，單位mg/kg；

C_標—標準溶液濃度，單位mg/L；

V_標—標準溶液進樣體積，單位μL；

S_樣—樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

V_終—樣品溶液最終定容體積，單位mL；

V_樣—樣品溶液進樣體積，單位μL；

S_標—標準溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

W—樣品稱樣重量，單位g；

其中，所述復雜基質(zhì)是指內(nèi)在組成成分比較復雜的樣品，比如煙葉、茶葉、生姜、油料作物等含大量色素、油脂、雜質(zhì)的復雜樣品。

進一步地，所述步驟(2)中的凈化劑為多壁碳納米管，或者多壁碳納米管與N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)三種之一的組合；所述多壁碳納米管使用量為0.01g/mL提取液；PSA使用量為0.05g/mL提取液；C18和GCB使用量均為0.01g/mL提取液。

針對類似煙葉、茶葉、花生等內(nèi)在組成成分比較復雜的樣品，色素、油脂以及跟檢測目標化合物共存雜質(zhì)較多，如果這些干擾物質(zhì)不能有效去除，將嚴重降低檢測結果的準確度。因此，針對復雜基質(zhì)，必須進行行之有效的凈化?，F(xiàn)有的凈化方法對復雜基質(zhì)凈化效果差，本發(fā)明采用基于多壁碳納米管的基質(zhì)固相分散萃取方法，能夠一次完成凈化，而且凈化效果好，因此檢測結果更為準確。

凈化效果不好的復雜樣品中會存在大量干擾物質(zhì)，導致在目標化合物檢測分析時產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)干擾現(xiàn)象，影響儀器的分辨率和重現(xiàn)性，而且還存在損壞儀器的危險。通過適當?shù)膬艋椒ㄈコ蓴_物質(zhì)，分析的重現(xiàn)性和準確度將大大提高。由于多壁碳納米管比表面積大，凈化能力強，使其應用于痕量物質(zhì)檢測方面較傳統(tǒng)凈化劑更具優(yōu)勢。多壁碳納米管對大部分有機化合物都有較強的吸附性，同時可有效降低或消除樣品中色素，脂肪等基質(zhì)對檢測結果的影響。常規(guī)凈化劑如C18通常只適合非極性或弱極性樣品的分離，凈化效果不理想。因此多壁碳納米管結合常規(guī)凈化劑非常適合對復雜基質(zhì)的凈化。

進一步地，所述步驟(1)中乙腈使用量為2mL/g試樣；

進一步地，所述步驟(1)中鹽包是指無水硫酸鎂，氯化鈉混合物。使用量無水硫酸鎂0.4g/mL提取液、氯化鈉0.1g/mL提取液。

進一步地，所述步驟(3)中稱取標準品的重量為0.01g±0.2mg；有機溶劑采用色譜甲醇。

進一步地，所述步驟(3)中標準儲備液是指制成100mg/L儲備液。

進一步地，所述步驟(3)中空白基質(zhì)提取液是指按照步驟(1)、(2)提取凈化的空白基質(zhì)乙腈提取液。

進一步地，所述步驟(4)中HPLC-MS/MS選用Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；色譜柱選用SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；；

色譜檢測條件：

柱溫：20℃；

流動相：A相為乙腈，B相為5mmol/L乙酸銨水溶液；

梯度洗脫條件為:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

進樣量：10μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源ESI；

掃描方式：正離子源/負離子源；

噴霧電壓：3200V/2800V；

毛細管溫度：350℃；

鞘氣壓力：50Arb；

輔助氣壓力：20Arb；

檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM)。

進一步地，所述步驟(5)中進樣濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1、本發(fā)明采用乙腈提取、基質(zhì)固相分散萃取凈化，能同時保證精喹禾靈及其代謝物兩種極性差異較大物質(zhì)的提取效率，而且與單一的液液萃取或固相萃取的凈化方法相比，操作簡便，能夠一次完成凈化，省時省力。

2、本發(fā)明采用多壁碳納米管作為凈化材料的新選擇，結合基質(zhì)的復雜程度，添加常規(guī)凈化劑輔助凈化，對不同復雜基質(zhì)均能夠達到良好凈化效果，提高了檢測準確度。

3、本發(fā)明通過HPLC-MS/MS同步檢測精喹禾靈及其代謝物，不僅有利于精喹禾靈與其代謝物的分離，而且干擾小，而且準確度高，能夠準確方便、快速的檢測精喹禾靈及其代謝物含量，其精喹禾靈最小檢出量為4.5×10^-11g、代謝物最小檢出量為1.2×10^-12g，最低檢出濃度均為0.01mg/kg。

本發(fā)明的檢測方法能夠快速、靈敏、準確的測定復雜基質(zhì)中精喹禾靈及其代謝物殘留量，為精喹禾靈及其代謝物在復雜基質(zhì)中的檢測提供了一種新的檢測技術。

附圖說明

圖1是精喹禾靈標準色譜圖；

圖2是實施例1的煙葉空白基質(zhì)色譜圖；

圖3是實施例1的添加精喹禾靈的煙葉樣品色譜圖；

圖4是精喹禾靈代謝物標準色譜圖；

圖5是實施例2的茶葉空白基質(zhì)色譜圖；

圖6是實施例2的添加精喹禾靈代謝物的茶葉樣品色譜圖；

其中，圖1、3中的色譜峰代表精喹禾靈；4、6中的色譜峰代表精喹禾靈代謝物。

具體實施方式

下面分別以煙葉中精喹禾靈及茶葉中精喹禾靈代謝物殘留量檢測為例，并結合附圖詳述本發(fā)明的技術方案，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變更或改進，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：煙葉中精喹禾靈殘留量的檢測

(1)提取

稱取2.0g煙葉樣品于50mL具蓋離心管中，移取10mL乙腈到該離心管中，于漩渦混合振蕩器上震蕩提取1min，加入4g無水硫酸鎂，1g氯化鈉，立即于漩渦混合振蕩儀振蕩2min，然后以4000r/min離心5min。

(2)凈化

移取1mL提取液于1.5mL離心管中，加入10mg多壁碳納米管、50mg PSA，于漩渦混合振蕩儀上漩渦振蕩2min，以6000r/min離心2分鐘。吸取上清液，過0.22μm濾膜，待測。

(3)HPLC-MS/MS檢測

HPLC檢測條件為：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色譜柱：SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；

柱溫：20℃；

流動相：A相為乙腈，B相為5mmol/L乙酸銨水溶液；

梯度洗脫條件為:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

進樣量：10μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源ESI；

掃描方式：正離子源；

噴霧電壓：3200V；

毛細管溫度：350℃；

鞘氣壓力：50Arb；

輔助氣壓力：20Arb；

檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM)如下表：

在上述條件下所得的標準色譜圖見圖1。保留時間為5.2min。

(4)標準曲線的建立

稱取0.0100g精喹禾靈標準品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L儲備液。將精喹禾靈標準儲備液逐級稀釋，配制成0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L的標準工作液。以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。所得標準曲線回歸方程為：Y＝4811860X+53833，相關系數(shù)r＝0.9999。

(5)計算公式

R—樣品中所含農(nóng)藥殘留量，單位mg/kg；

C_標—標準溶液濃度，單位mg/L；

V_標—標準溶液進樣體積，單位μL；

S_樣—樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

V_終—樣品溶液最終定容體積，單位mL；

V_樣—樣品溶液進樣體積，單位μL；

S_標—標準溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

W—樣品稱樣重量，單位g；

(5)添加回收率試驗

在煙葉空白樣品中添加0.01～0.5mg/kg精喹禾靈標準品溶液，每個濃度重復5次，按上述方法提取、凈化和檢測，驗證本發(fā)明方法的可靠性。結果見表1。結果表明，精喹禾靈在煙葉中添加濃度為0.01mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg時，平均回收率為89.0％～91.6％，相對標準偏差分別為2.9％～3.9％?；厥章屎拖鄬藴势罹限r(nóng)藥殘留試驗的要求。

表1精喹禾靈在煙葉中添加回收率試驗結果

煙葉空白基質(zhì)色譜圖見圖2；添加精喹禾靈的煙葉樣品色譜圖見圖3。

由圖2可以看出，本發(fā)明對樣品中的雜質(zhì)凈化效果較好，煙葉空白基質(zhì)中無雜質(zhì)干擾峰出現(xiàn)，精喹禾靈本底值為0，對本實驗不會形成干擾。由圖3可以看出，目標峰峰形良好，鄰近幾乎無干擾峰，對結果的分析不會產(chǎn)生偏差。

實施例2：茶葉中精喹禾靈代謝物殘留量的檢測

(1)提取

稱取2.0g煙葉樣品于50mL具蓋離心管中，移取10mL乙腈到該離心管中，于漩渦混合振蕩器上震蕩提取1min，加入4g無水硫酸鎂，1g氯化鈉，立即于漩渦混合振蕩儀振蕩2min，然后以4000r/min離心5min。

(2)凈化

移取1mL提取液于1.5mL離心管中，加入10mg多壁碳納米管、10mg C18，于漩渦混合振蕩儀上漩渦振蕩2min，以6000r/min離心2分鐘。吸取上清液，過0.22μm濾膜，待測。

(3)HPLC-MS/MS檢測

HPLC檢測條件為：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色譜柱：SunFire C18 Column,4.6μm,2.1mm×100mm；；

柱溫：20℃；

流動相：A相為乙腈，B相為5mmol/L乙酸銨水溶液；

梯度洗脫條件為:0～0.5min，保持10％A；0.5～1.0min，10％～90％A；1.0～6.0min，保持90％A；6.0～8.0min，90％～10％A；8.0～10.0min，保持10％A；

流速：0.30mL/min；

進樣量：10μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源ESI；

掃描方式：負離子源；

噴霧電壓：2800V；

毛細管溫度：350℃；

鞘氣壓力：50Arb；

輔助氣壓力：20Arb；

檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM)如下表：

在上述條件下所得的標準色譜圖見圖4。保留時間為4.4min。

(4)標準曲線的建立

稱取0.0100g精喹禾靈代謝物標準品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L儲備液。將精喹禾靈酸標準儲備液逐級稀釋，配制成0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/L的標準工作液。以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。所得標準曲線回歸方程為：Y＝394746X+296，相關系數(shù)r＝0.9999。

(5)計算公式

R—樣品中所含農(nóng)藥殘留量，單位mg/kg；

C_標—標準溶液濃度，單位mg/L；

V_標—標準溶液進樣體積，單位μL；

S_樣—樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

V_終—樣品溶液最終定容體積，單位mL；

V_樣—樣品溶液進樣體積，單位μL；

S_標—標準溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；

W—樣品稱樣重量，單位g；

(5)添加回收率試驗

在茶葉空白樣品中添加0.01～0.5mg/kg精喹禾靈代謝物標準品溶液，每個濃度重復5次，按上述方法提取、凈化和檢測，驗證本發(fā)明方法的可靠性。結果見表2。結果表明，精喹禾靈代謝物在茶葉中添加濃度為0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg時，平均回收率分別為88.1％～95.0％，相對標準偏差分別為1.7％～5.4％。回收率和相對標準偏差均符合農(nóng)藥殘留試驗的要求。

表2精喹禾靈代謝物在茶葉中添加回收率試驗結果

茶葉空白基質(zhì)色譜圖見圖5；添加精喹禾靈代謝物的茶葉樣品色譜圖見圖6。由圖6可以看出，茶葉空白基質(zhì)中精喹禾靈酸本底值為0，對本實驗不會形成干擾。

實施例1和2采用乙腈提取，多納米碳管配合其他凈化劑凈化，不僅操作簡便，而且凈化效果更好，能夠有效去除復雜基質(zhì)中干擾物質(zhì)，提高了檢測的準確性。通過HPLC-MS/MS檢測精喹禾靈及其代謝物來反映基質(zhì)中精喹禾靈含量，不僅干擾小，而且準確、快速，其精喹禾靈最小檢出量為4.5×10^-11g、代謝物最小檢出量為1.2×10^-12g，最低檢出濃度均為0.01mg/kg。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。