本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白及其篩選方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：維吾爾醫(yī)(維醫(yī))學(xué)是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要組成部分，維醫(yī)學(xué)體液論認(rèn)為，人體由膽液質(zhì)、血液質(zhì)、黏液質(zhì)和黑膽質(zhì)4種體液質(zhì)組成，上述4種體液質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體健康的生理基礎(chǔ)，而某一種體液質(zhì)的量或/和質(zhì)的變化，引起體液質(zhì)平衡失調(diào)，產(chǎn)生一種異常體液質(zhì)證(證候)，與多種疾病的發(fā)生存在因果關(guān)系。體液病理學(xué)(體液論)是維醫(yī)理論根基，其認(rèn)為4種體液中，黏液質(zhì)體液屬性濕寒，常易因生活、飲食與環(huán)境因素、工作壓力、缺乏運(yùn)動(dòng)等原因?qū)е麦w內(nèi)體液平衡遭到破壞，黏液質(zhì)體液發(fā)生改變，產(chǎn)生異常黏液質(zhì)，致代謝水平降低，產(chǎn)物蓄積體內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致病理性改變，引發(fā)相關(guān)疾病。臨床研究證實(shí)，異常黏液質(zhì)證(AbnormalPhlegm)在陽(yáng)痿(陰莖勃起功能障礙)、早泄、少弱精癥、卵巢早衰、不孕不育等生殖疾病、肥胖癥、高脂血癥等代謝性疾病和心血管疾病發(fā)生過(guò)程中，處于主導(dǎo)地位，可能也是腫瘤、糖尿病、高血壓等復(fù)雜性疾病發(fā)生早期的主要證型。勃起功能障礙(ErectileDysfunction，ED)，又稱(chēng)陽(yáng)痿，是指男子陰莖不能勃起及不能維持勃起而完成滿(mǎn)意的性生活，屬維醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種。陰莖勃起是由多種生物活性因子(包括神經(jīng)遞質(zhì)，激素，酶，離子通道等)綜合調(diào)節(jié)的神經(jīng)-血管性生物活動(dòng)。在維醫(yī)藥臨床與基礎(chǔ)研究方向，因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物學(xué)起步較晚，無(wú)相關(guān)病證結(jié)合動(dòng)物模型，導(dǎo)致異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證及其對(duì)證方藥作用機(jī)理研究一直滯后，并嚴(yán)重制約了維醫(yī)男科在此領(lǐng)域的研究與發(fā)展，更無(wú)關(guān)于異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的相關(guān)標(biāo)志蛋白及其蛋白標(biāo)志物體系的研究報(bào)道。為了從現(xiàn)代生殖生物學(xué)角度進(jìn)一步認(rèn)識(shí)維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿，我們基于維醫(yī)體液論和造模理念，成功建立了異常黏液質(zhì)證候動(dòng)物模型，并采用APO陰莖勃起實(shí)驗(yàn)與交配實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法，從中篩選出ED模型，對(duì)其生物學(xué)表征、性功能與交配行為、性腺軸與NO-CGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等生殖生物學(xué)方面的改變進(jìn)行了研究，但異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證并非是單一生殖器官即陰莖平滑肌組織的的疾病，而是全身性疾病，因此需要我們用整體觀(guān)念，從全身的視野，來(lái)分析、研究和探索該病證的發(fā)生發(fā)展規(guī)律與可能的治療方法。維醫(yī)辨證分型的起點(diǎn)和核心是維醫(yī)“體液論”，其出發(fā)點(diǎn)是人體內(nèi)在體液動(dòng)態(tài)變化的外在表現(xiàn)，而維醫(yī)藥學(xué)所推崇的辨證施治也是依據(jù)個(gè)體的整體水平上發(fā)生的體液表型差異，這與系統(tǒng)生物學(xué)整體研究思路不謀而合。血清融入了機(jī)體多器官、組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)信息，也是與陰莖勃起功能密切相關(guān)的分泌蛋白必經(jīng)之路，可以反映機(jī)體的病理生理改變相關(guān)的總體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空性，而藥物對(duì)任何靶器官、組織或細(xì)胞的作用最終也反映在血清蛋白質(zhì)組變化之中。陰莖是陰莖勃起的效應(yīng)器官，海綿體平滑肌則為效應(yīng)組織，其任何一種病理勝利改變也與該組織蛋白質(zhì)水平動(dòng)態(tài)變化密不可分，其中蘊(yùn)藏著陽(yáng)痿發(fā)生相關(guān)的潛在蛋白標(biāo)記，也是該疾病藥物治療的重要靶點(diǎn)之一。故，本研究基于異常黏液質(zhì)證候與病證結(jié)合動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，開(kāi)展了血清和陰莖平滑肌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，建立了異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證相關(guān)血清和陰莖平滑肌組織蛋白體系，為進(jìn)一步開(kāi)展異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的機(jī)制研究、藥物篩選、轉(zhuǎn)化與防治研究奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白體系，包括以下蛋白：優(yōu)選地，本發(fā)明的所述維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白體系來(lái)自模式動(dòng)物；所述模式動(dòng)物為大鼠。本發(fā)明的第二目的在于提供維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物陰莖平滑肌組織差異蛋白體系，包括以下蛋白：優(yōu)選地，本發(fā)明所述維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物陰莖平滑肌組織差異蛋白體系來(lái)自模式動(dòng)物；所述模式動(dòng)物為大鼠。本發(fā)明再一目的在于提供了上述維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白體系和陰莖平滑肌組織差異蛋白體系的篩選方法，包括以下步驟：1)建立正常對(duì)照組(N組)、異常黏液質(zhì)證候組(ZM組)、異常黏液質(zhì)型病證組(BM組)；2)采集所述步驟1)得到的哺乳動(dòng)物全血，分離后得到哺乳動(dòng)物的血清，取所述步驟1)得到哺乳動(dòng)物的陰莖平滑肌組織；3)從所述步驟2)得到的所述血清和所述陰莖平滑肌組織中提取蛋白質(zhì)；4)將所述步驟3)中得到的所述蛋白質(zhì)標(biāo)記后純化，得到純化后肽段；5)將所述步驟4)得到的所述純化后的肽段經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)后得到指紋圖譜，篩選后所述指紋圖譜使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件進(jìn)行檢索，根據(jù)得到的搜索結(jié)果和篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析，將得到的分析數(shù)據(jù)在所述哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中使用蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索軟件檢索，獲得所述N組、ZM組和BM組哺乳動(dòng)物血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；6)將所述步驟5)中所述BM組與ZM組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/ZM的血清差異蛋白質(zhì)；將BM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證組的血清差異蛋白質(zhì)；所述BM組和與ZM組的陰莖平滑肌蛋白質(zhì)相比較，得到BM/ZM的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；將BM組與N組的陰莖平滑肌組織蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N組陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述哺乳動(dòng)物為大鼠。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟1)中正常對(duì)照組大鼠在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，喂食的環(huán)境溫度為18～22℃，所述喂食環(huán)境的相對(duì)濕度為40～60％，造模組的喂食的環(huán)境溫度為8～12℃，所述喂食環(huán)境的相對(duì)濕度70～80％％；所述步驟1)中正常對(duì)照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟3)中所述標(biāo)記方法為iTRAQ標(biāo)記試劑盒標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟4)中蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件為ProteomeDiscoverer；所述蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索軟件為mascot軟件。本發(fā)明還提供了上述維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白體系和陰莖平滑肌組織差異蛋白體系在制備預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿藥物中的應(yīng)用。由上可知，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中沒(méi)有證候的概念，常用疾病與正常對(duì)照組之間尋找差異蛋白，而在維醫(yī)臨床診治中，則需辨證論治，并對(duì)不同證型的陽(yáng)痿患者使用不同的方藥進(jìn)行治療，即病證與方藥對(duì)應(yīng)。本專(zhuān)利發(fā)明人，基于對(duì)證候和病證的認(rèn)識(shí)與豐富的維吾爾醫(yī)學(xué)知識(shí)，運(yùn)用辯證與辨病相結(jié)合的方式，通過(guò)類(lèi)比方法，在BM與ZM組的差異蛋白與BM與N組的差異蛋白之間尋找共同蛋白，篩查出了異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的血清和陰莖平滑肌組織候選蛋白標(biāo)志物，并通過(guò)驗(yàn)證，建立了異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清和陰莖平滑肌組織蛋白標(biāo)志物體系，而該體系則更準(zhǔn)確的反映了維醫(yī)對(duì)病證的詮釋?zhuān)w現(xiàn)了證候的本質(zhì)。并建立宏觀(guān)與微觀(guān)認(rèn)識(shí)配合、分析與綜合研究統(tǒng)一的指標(biāo)體系，提升陽(yáng)痿的辨證論治水平與藥物研發(fā)水平具有重要意義2、本發(fā)明提供了35種維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白和48種陰莖平滑肌組織差異蛋白；通過(guò)實(shí)施例表明其在模式動(dòng)物如大鼠中血清和陰莖平滑肌組織中差異蛋白的上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)，表明這些差異蛋白對(duì)大鼠的陰莖勃起功能產(chǎn)生了一定的影響，最終確定為異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的生物標(biāo)記物，可以針對(duì)上述生物標(biāo)記物進(jìn)行藥物基礎(chǔ)研究，為進(jìn)一步開(kāi)展異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿(勃起功能障礙)病證機(jī)制研究、藥物篩選、轉(zhuǎn)化與防治研究奠定了基礎(chǔ)，提供了依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1為正常對(duì)照組、異常黏液質(zhì)證侯組和病證組大鼠模型的造模流程圖；圖2為維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清和陰莖平滑肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)及其差異蛋白體系的篩選流程圖；圖3為大鼠血清差異蛋白質(zhì)和大鼠陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)的完整性檢測(cè)的SDS-PAGE電泳圖譜。圖4為35種候選差異蛋白中任意選取7種蛋白的ELISA檢測(cè)。具體實(shí)施方式在本發(fā)明實(shí)施例中，試驗(yàn)動(dòng)物為：具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠30只(體重200g左右)，雌性大鼠15只(體重180g左右)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；在本發(fā)明實(shí)施例中，藥品與試劑：濕寒性飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按前期研究中使用的要求配制；菠菜實(shí)與芫荽實(shí)等藥材購(gòu)自于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院草藥房；戊巴比妥鈉；生理鹽水；阿撲嗎啡(90μg/kg)；雌二醇；黃體酮；主要檢測(cè)試劑：ELISA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒等。在本發(fā)明實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)為以下含義：術(shù)語(yǔ)APO:阿撲嗎啡(Apomorphine)；術(shù)語(yǔ)iTRAQ：同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)術(shù)語(yǔ)HPLC:：高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography)術(shù)語(yǔ)SDS：十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt)生物學(xué)表征觀(guān)測(cè)：定性指標(biāo)觀(guān)測(cè)：所述定性指標(biāo)觀(guān)測(cè)為皮膚毛發(fā)在日光下觀(guān)察，情緒反應(yīng)以一籠內(nèi)各大鼠相互反應(yīng)為主觀(guān)察30分鐘，行為狀態(tài)以此期間內(nèi)的活動(dòng)為主、安靜環(huán)境下觀(guān)察30分鐘，興奮程度以?shī)A尾實(shí)驗(yàn)時(shí)的反應(yīng)為主，舌象舌苔在日光下觀(guān)察、記錄并拍照，飲食水狀態(tài)以各組同一時(shí)間喂飼觀(guān)察飲食水狀態(tài)，小便以各組大鼠當(dāng)日正排尿時(shí)顏色為主，大便狀態(tài)以當(dāng)日正排大便時(shí)大便形態(tài)為主；定量指標(biāo)為避免生理節(jié)奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項(xiàng)資料，其中體重：每天按規(guī)定時(shí)間稱(chēng)重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數(shù)，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱(chēng)食物余量，根據(jù)下述公式得出100g體重相對(duì)應(yīng)的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計(jì)算得出100g體重相對(duì)應(yīng)的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規(guī)定時(shí)間稱(chēng)含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風(fēng)干燥箱100℃下2小時(shí)烘干后再次稱(chēng)重，計(jì)算各組尿量；大便量：計(jì)算100g體重相對(duì)應(yīng)的大便量并記錄。APO勃起試驗(yàn)或APO實(shí)驗(yàn)方法為參考Heaton等的方法，將試驗(yàn)大鼠置于觀(guān)察箱中10～15min適應(yīng)環(huán)境，保持安靜，調(diào)暗燈光，在大鼠頸項(xiàng)皮膚注射阿撲嗎啡(APO)90μg/kg(0.5mg/kg維生素C于中溶解阿樸嗎啡后，與5mL/kg生理鹽水混勻)，注射后立刻觀(guān)察，計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，觀(guān)測(cè)并記錄1800s(0.5h)內(nèi)大鼠的勃起潛伏期和勃起次數(shù)。陰莖勃起的標(biāo)準(zhǔn)：勃起時(shí)大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭。勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時(shí)間。勃起次數(shù)為注射后1800s內(nèi)大鼠出現(xiàn)陰莖勃起的次數(shù)。若1800s內(nèi)未見(jiàn)勃起，則該大鼠勃起次數(shù)記為0,勃起潛伏期記為1800s。交配實(shí)驗(yàn)方法：將雄鼠和雌鼠(已進(jìn)行發(fā)情期制備)分別置于不同的觀(guān)察箱中適應(yīng)環(huán)境，10～15分鐘后按雌雄比例1:2放入同一個(gè)觀(guān)察箱中，觀(guān)測(cè)1800s內(nèi)雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數(shù)。若1800s內(nèi)雄性大鼠未進(jìn)行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數(shù)記為0。插入與射精行為同理。在本發(fā)明實(shí)施例中，首先建造正常對(duì)照組(N)、異常黏液質(zhì)證候組(ZM)和異常黏液質(zhì)型病證組(BM)大鼠。在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)所述N組、ZM組和BM組大鼠的獲取方法沒(méi)有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的建立異常黏液質(zhì)證候動(dòng)物模型的技術(shù)方案即可；在本發(fā)明實(shí)施例中，優(yōu)選具體包括以下步驟：選擇性成熟期雌鼠，去勢(shì)手術(shù)后常規(guī)條件下飼養(yǎng)，將所述雌鼠在發(fā)情期與雄鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)和APO實(shí)驗(yàn)測(cè)試，得到有正常性功能的雄鼠。本發(fā)明對(duì)所述交配實(shí)驗(yàn)和APO實(shí)驗(yàn)的時(shí)間順序沒(méi)有特殊限制。所述交配實(shí)驗(yàn)和APO實(shí)驗(yàn)的對(duì)象為所述正常對(duì)照組和造模組大鼠。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述交配的具體步驟優(yōu)選為將已進(jìn)行發(fā)情期的雄鼠和雌鼠分別置于不同的觀(guān)察箱中適應(yīng)環(huán)境，10～15min后按雌雄比例1:2放入同一個(gè)觀(guān)察箱中，觀(guān)測(cè)1800s內(nèi)雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數(shù)，若1800s內(nèi)雄性大鼠未進(jìn)行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數(shù)記為0；插入與射精行為同理。本發(fā)明根據(jù)所述交配的結(jié)果將具有正常交配能力的雄鼠納入正常對(duì)照組和造模組，對(duì)無(wú)正常交配能力雄鼠進(jìn)行淘汰。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述APO實(shí)驗(yàn)具體步驟優(yōu)選為將實(shí)驗(yàn)大鼠置于觀(guān)察箱中10～15min適應(yīng)環(huán)境，保持安靜，調(diào)暗燈光，在大鼠頸項(xiàng)皮膚注射90μg/kg阿撲嗎啡APO，注射后立刻觀(guān)察，計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，觀(guān)測(cè)并記錄1800s內(nèi)大鼠的勃起潛伏期和勃起次數(shù)；所述勃起的標(biāo)準(zhǔn)為勃起時(shí)大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭；所述勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時(shí)間；所述勃起次數(shù)為注射后1800s內(nèi)大鼠出現(xiàn)陰莖勃起的次數(shù)；若1800s內(nèi)未見(jiàn)勃起，則該大鼠勃起次數(shù)記為0，勃起潛伏期記為1800s。本發(fā)明實(shí)施例中根據(jù)所述APO測(cè)試的結(jié)果將具有正常陰莖勃起功能的雄鼠納入正常對(duì)照組和造模組，對(duì)無(wú)正常陰莖勃起功能雄鼠進(jìn)行淘汰。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述90μg/kg阿撲嗎啡溶液優(yōu)選包括90μg阿樸嗎啡溶解于0.5mg/kg維生素C和生理鹽水中，調(diào)整體積為5ml/kg。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述正常對(duì)照組在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，喂食的環(huán)境溫度為18～22℃，所述喂食環(huán)境的相對(duì)濕度為40～60％；造模組的喂食的環(huán)境溫度為8～12℃，所述喂食環(huán)境的相對(duì)濕度70～80％；正常對(duì)照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述生物學(xué)表征觀(guān)測(cè)是指定性和定量觀(guān)測(cè)和記錄。定性指標(biāo)觀(guān)測(cè)：所述定性指標(biāo)觀(guān)測(cè)為皮膚毛發(fā)在日光下觀(guān)察，情緒反應(yīng)以一籠內(nèi)各大鼠相互反應(yīng)為主觀(guān)察30分鐘，行為狀態(tài)以此期間內(nèi)的活動(dòng)為主、安靜環(huán)境下觀(guān)察30分鐘，興奮程度以?shī)A尾實(shí)驗(yàn)時(shí)的反應(yīng)為主，舌象舌苔在日光下觀(guān)察、記錄并拍照，飲食水狀態(tài)以各組同一時(shí)間喂飼觀(guān)察飲食水狀態(tài)，小便以各組大鼠當(dāng)日正排尿時(shí)顏色為主，大便狀態(tài)以當(dāng)日正排大便時(shí)大便形態(tài)為主；定量指標(biāo)為避免生理節(jié)奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項(xiàng)資料，其中體重：每天按規(guī)定時(shí)間稱(chēng)重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數(shù)，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱(chēng)食物余量，根據(jù)下述公式得出100g體重相對(duì)應(yīng)的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計(jì)算得出100g體重相對(duì)應(yīng)的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規(guī)定時(shí)間稱(chēng)含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風(fēng)干燥箱100℃下2小時(shí)烘干后再次稱(chēng)重，計(jì)算各組尿量；大便量：計(jì)算100g體重相對(duì)應(yīng)的大便量并記錄。得到有正常性功能(正常交配能力和陰莖勃起功能)的雄鼠后，本發(fā)明將得到的有正常性能的雄鼠分為正常對(duì)照組和造模組，所述正常對(duì)照組在常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)，所述造模組以濕寒性飼料喂養(yǎng)，在濕寒環(huán)境中飼養(yǎng)，觀(guān)察并記錄正常組和造模組的生物學(xué)表征觀(guān)。包括定性指標(biāo)和定量指標(biāo)。定性指標(biāo)觀(guān)測(cè)所有組大鼠的皮膚毛發(fā)、情緒反應(yīng)、興奮程度、睡眠狀態(tài)、飲水狀態(tài)、尿量性質(zhì)、大便狀態(tài)和舌象舌苔。定量指標(biāo)為記錄所有組大鼠的體重、飲食量、飲水量、尿量和大便量。在造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大鼠皮膚毛發(fā)稍暗淡，無(wú)光澤；倦怠，蜷臥少動(dòng)；對(duì)刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無(wú)爭(zhēng)水現(xiàn)象；尿量清，色淡，量多；大便時(shí)軟時(shí)溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，造模組體重增長(zhǎng)緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學(xué)表征符合維醫(yī)臨床證侯特點(diǎn)，從而獲得了異常黏液質(zhì)證侯大鼠模型，且該模型具有良好的科學(xué)性、可靠性和穩(wěn)定性。通過(guò)APO和交配實(shí)驗(yàn)從證候模型組中篩選出異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證結(jié)合模型(陰莖勃起功能障礙和無(wú)交配能力)，從而獲得異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證動(dòng)物模型。本發(fā)明對(duì)所述證候成模率達(dá)100％，病證模型成模率達(dá)到50％以上，病證模型的周期優(yōu)選為22～25周。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述N組的大鼠數(shù)量?jī)?yōu)選為10只。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)的方法同上步驟中的常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)方法。本發(fā)明中，所述N組的喂養(yǎng)量?jī)?yōu)選為每日300g的普通飼料。所述普通飼料為包括500ml水和80g墊料。本發(fā)明對(duì)所述墊料沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的墊料即可。本發(fā)明中，所述的實(shí)驗(yàn)組的大鼠的數(shù)量?jī)?yōu)選為20只。本發(fā)明中，所述的濕寒性飼料為菠菜實(shí)和芫荽實(shí)與常規(guī)飼料的混合物。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述濕寒性飼料優(yōu)選為：每1kg常規(guī)飼料中包括100～200g芫荽實(shí)和100～200g菠菜實(shí)，更優(yōu)選每1kg常規(guī)飼料中包括150g芫荽實(shí)和150g菠菜實(shí)。本發(fā)明對(duì)常規(guī)飼料沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于飼養(yǎng)大鼠的飼料均可。本發(fā)明對(duì)所述菜實(shí)與芫荽實(shí)的來(lái)源也沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的菜實(shí)與芫荽實(shí)即可。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述菜實(shí)與芫荽實(shí)的來(lái)源購(gòu)自于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院草藥房。本發(fā)明中，所述的濕寒性飼料的喂養(yǎng)量?jī)?yōu)選為每日300g。本發(fā)明中，所述濕寒環(huán)境的溫度優(yōu)選為8～12℃，所述濕寒環(huán)境的濕度優(yōu)選為70～80％。本發(fā)明對(duì)提供所述濕寒環(huán)境的設(shè)施沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提供濕寒環(huán)境的設(shè)施即可。本發(fā)明中實(shí)例中，提供濕寒環(huán)境的設(shè)施為人工氣候箱。本發(fā)明中，所述濕寒性飼料喂養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為于北京時(shí)間09:00至21:00放入，其它時(shí)間放置于對(duì)照大鼠相同的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。本發(fā)明中，所述APO實(shí)驗(yàn)和交配實(shí)驗(yàn)的方法和驗(yàn)證結(jié)果同上述APO實(shí)驗(yàn)和交配實(shí)驗(yàn)的方法和驗(yàn)證結(jié)果。本發(fā)明對(duì)所述采血前優(yōu)選對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。本發(fā)明對(duì)所述麻醉的方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的麻醉方法即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述的麻醉方法為腹腔注射。本發(fā)明對(duì)所述麻醉過(guò)程中使用的麻醉劑優(yōu)選為戊巴比妥鈉。所述的戊巴比妥鈉的來(lái)源購(gòu)自和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述采集外周血的具體方法優(yōu)選為將麻醉后的大鼠快速?gòu)母怪鲃?dòng)脈取血。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述分離血清的方法優(yōu)選為將新鮮大鼠全血立即置4℃環(huán)境，30～40min后以3000～3500rpm的速度離心5～10min，將得到的上清液在4℃條件下，以3000～3500rpm的速度再次離心，得到血清，將最終離心得到的血清放置于-80℃超低溫冰箱備用。所述的4℃環(huán)境優(yōu)選為4℃冰箱。得到陰莖平滑肌組織的方法具體是：從根部取陰莖平滑肌組織，洗去血漬，并除去殘余皮膚、筋膜，取上段陰莖平滑肌組織，放置于凍存管中放置于-80℃超低溫冰箱備用。得到血清和陰莖平滑肌組織后，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)血清和組織中提取蛋白質(zhì)，檢測(cè)，得到已知濃度血清和陰莖平滑肌組織蛋白質(zhì)。本發(fā)明實(shí)施例中，在提取蛋白前優(yōu)選按照組別分別進(jìn)行混樣，得到三組血清樣品和三組陰莖平滑肌組織樣品。本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述提取蛋白質(zhì)的方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提取蛋白質(zhì)的方法即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述提取蛋白質(zhì)的方法為T(mén)CA-丙酮沉淀法。本發(fā)明實(shí)施例中，所述檢測(cè)優(yōu)選包括對(duì)蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)和對(duì)蛋白質(zhì)完整性的檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)施例中，所述對(duì)蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法優(yōu)選為Bradford法，所述對(duì)蛋白質(zhì)完整性的檢測(cè)方法優(yōu)選為SDS-PAGE法。得到已知濃度的蛋白質(zhì)后，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述蛋白質(zhì)用iTRAQ標(biāo)記試劑盒標(biāo)記，得到標(biāo)記的蛋白質(zhì)，經(jīng)純化，得到純化后肽段。在本發(fā)明實(shí)施例中，在所述標(biāo)記前優(yōu)選將得到的已知濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化。本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述消化的方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的蛋白質(zhì)消化方法即可。在本發(fā)明實(shí)施例所述消化采用胰蛋白酶消化法。本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述iTRAQ標(biāo)記試劑盒的來(lái)源沒(méi)有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的iTRAQ標(biāo)記試劑盒的市售商品即可。本發(fā)明實(shí)施例使用的試劑盒為Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem)8標(biāo)iTRAQ試劑，其中包括8種等量的同位素試劑(報(bào)告基團(tuán)質(zhì)量113-121，不包括120)，能對(duì)蛋白質(zhì)酶解后肽段進(jìn)行標(biāo)記，從而結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜等方法，可以對(duì)肽段進(jìn)行精確鑒定和定量。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述純化優(yōu)選采用HPLC進(jìn)行肽段的純化。所述進(jìn)行純化的儀器采用型號(hào)為(發(fā)明人提供)安捷倫常規(guī)液相。本發(fā)明實(shí)施例中使用SCX強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱分離，在pH＝3磷酸緩沖液中，使用20％-30％的梯度洗脫液(10mMKH2PO4,2MKCl,25％ACN，pH＝3)，洗脫條件和梯度參考儀器和耗材具體操作說(shuō)明即可，洗脫消化后的肽段。洗脫后的跳段使用C18反相色譜脫鹽處理。得到純化肽段后，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述純化的肽段經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)后得到質(zhì)譜總圖，將所述指紋圖譜在PD軟件中篩選，在本發(fā)明實(shí)施例中，所述質(zhì)譜檢測(cè)的儀器采用型號(hào)為T(mén)hermofisherQ-Exactive的質(zhì)譜儀。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述PD軟件的版本為ProteomeDiscoverer1.3，購(gòu)自美國(guó)thermo公司。本發(fā)明實(shí)施例中，質(zhì)譜篩選的參數(shù)如下：母離子質(zhì)量范圍350Da-6000Da二級(jí)質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)10信噪比S/N域值1.5PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結(jié)果，使用PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。定性檢索參數(shù)如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產(chǎn)生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生自身環(huán)化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結(jié)合。peptidetol是一級(jí)質(zhì)譜的精度。MS/MStol是二級(jí)質(zhì)譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時(shí)最大允許漏切的數(shù)目。Enzyme是實(shí)驗(yàn)所使用的酶種類(lèi)。Database是檢索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)。Timefilescompressed為數(shù)據(jù)庫(kù)建立時(shí)間。Numberofsequences為數(shù)據(jù)庫(kù)中序列數(shù)。定量檢索參數(shù)如下：注:ProteinratioType：用來(lái)定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來(lái)定量的最少的uniquepeptide數(shù)Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來(lái)做矯正。P-value蛋白可信度評(píng)估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根據(jù)所述搜索結(jié)果和篩選后的譜圖定量分析，得到的分析數(shù)據(jù)在大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(組織)中檢索，血清總蛋白為318種，組織總蛋白為844種，F(xiàn)DR<1％，具體見(jiàn)下表。注：Allspectra為全部的譜圖數(shù)；Matchedspectra為匹配上的譜圖數(shù)；Peptide為肽段種類(lèi)數(shù)；ProteinGroup為匹配上的蛋白總數(shù)；FDR為假陽(yáng)性率，本實(shí)施例使用的是假陽(yáng)性率小于1％來(lái)過(guò)濾結(jié)果。按照軟件操作規(guī)程，使用相同參數(shù)及方法，鑒定篩選獲得大鼠血清蛋白質(zhì)318種和陰莖平滑肌組織蛋白844種。得到的三組(N、ZM和BM)血清和組織蛋白質(zhì)后，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述三組蛋白質(zhì)進(jìn)行維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的哺乳動(dòng)物血清差異蛋白和陰莖平滑肌組織差異蛋白的篩選。本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所述異常黏液質(zhì)型病證組血清和陰莖平滑肌組織差異蛋白蛋白的差異蛋白的篩選方法具體是：所述BM組與ZM組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/ZM的血清差異蛋白質(zhì)；將BM組的與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證組的血清差異蛋白質(zhì)；所述BM組和與ZM組的陰莖平滑肌蛋白質(zhì)相比較，得到BM/ZM組陰莖平滑肌差異蛋白質(zhì)；將BM組的蛋白質(zhì)與N組的陰莖平滑肌蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM組和BM/N組的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；以下通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例11、造模與分組選用性成熟期雌鼠15只，去勢(shì)手術(shù)后正常條件下飼養(yǎng)，交配實(shí)驗(yàn)備用。將雄性大鼠經(jīng)與發(fā)情期雌鼠進(jìn)行交配試驗(yàn)并結(jié)合APO勃起實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有正常性功能(無(wú)正常性功能者淘汰)，取30只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，從中再隨機(jī)抽取10只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，飼養(yǎng)于常規(guī)環(huán)境下，溫度18～22℃，溫度喂養(yǎng)，環(huán)境相對(duì)濕度40～60％，余20只為造模組，以濕寒性飼料喂養(yǎng)，按維吾爾醫(yī)學(xué)對(duì)環(huán)境的看法采用人工氣候箱進(jìn)行造模，設(shè)置溫度：8～12℃，濕度為70～80％，12/12小時(shí)晝夜交替飼養(yǎng)，其它時(shí)間放置于正常組大鼠相同的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。當(dāng)造模組鼠出現(xiàn)皮膚毛發(fā)稍暗淡，無(wú)光澤；倦怠，蜷臥少動(dòng)；對(duì)刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無(wú)爭(zhēng)水現(xiàn)象；尿量清，色淡，量多；大便時(shí)軟時(shí)溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，造模組體重增長(zhǎng)緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學(xué)表征符合維醫(yī)臨床證侯特點(diǎn)，從而獲得了異常黏液質(zhì)證侯大鼠模型，且該模型具有良好的科學(xué)性、可靠性和穩(wěn)定性。通過(guò)APO和交配實(shí)驗(yàn)從證候模型組中篩選出無(wú)陰莖勃起功能和交配能力雄性大鼠，獲得異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證動(dòng)物模型。本發(fā)明對(duì)所述模率達(dá)到50％,以上病證模型的周期優(yōu)選為22～25周。從造模第一周開(kāi)始每周記錄大鼠的生物學(xué)表征，根據(jù)生物學(xué)表征確定異常黏液質(zhì)證候模型成模情況，本發(fā)明對(duì)所述證候模率達(dá)到100％的周期優(yōu)選為8-10周。并在此基礎(chǔ)上，每月進(jìn)行一次APO實(shí)驗(yàn)及交配實(shí)驗(yàn)，APO實(shí)驗(yàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)勃起的次數(shù)和勃起潛伏期，判斷陰莖勃起功能，交配實(shí)驗(yàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)爬被潛伏期/次數(shù)、插入潛伏期/次數(shù)和射精潛伏期/次數(shù)這幾項(xiàng)指標(biāo)判斷大鼠的交配能力，當(dāng)出現(xiàn)陰莖勃起功能障礙和交配能力障礙，即陽(yáng)痿病證成模率達(dá)到50％以后，從異常黏液質(zhì)證候模型組中通過(guò)APO實(shí)驗(yàn)及交配實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)痿病證大鼠，并納入BM組，余為ZM組。2、外周血采集、組織樣品取材與保存：戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，快速?gòu)母怪鲃?dòng)脈取血，將新鮮大鼠全血立即置4℃冰箱，30分鐘后以3000rpm的速度離心5min，吸取上清液，再置高速低溫離心機(jī)，在4℃條件下，以3000rpm的速度離心再吸取上清液后，分裝置-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。從根部取陰莖平滑肌組織，洗去血漬，并除去殘余皮膚、筋膜，取上段陰莖平滑肌組織，放置于凍存管中放置于-80℃超低溫冰箱備用。3、蛋白質(zhì)組樣品的制備蛋白質(zhì)提取方法采用TCA-冰丙酮提取。4、iTRAQ標(biāo)記及HPLC(1)iTRAQ標(biāo)記：取各組大鼠血清和陰莖平滑肌組織，按組別混樣后，提取各組蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS檢測(cè)蛋白的完整性及使用Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)經(jīng)Trypsin消化后用ITRAQ標(biāo)記試劑盒(Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem))進(jìn)行標(biāo)記，后經(jīng)HPLC(安捷倫常規(guī)液相)進(jìn)行肽段的純化；三組大鼠的血清蛋白質(zhì)的濃度如表1所示，組織蛋白質(zhì)的濃度如表2所示。從附圖3中SDS-PAGE凝膠電泳圖片來(lái)看，提取的三組蛋白質(zhì)完整性較好，可以用于下游實(shí)驗(yàn)。表1Bradford法對(duì)大鼠血清蛋白進(jìn)行定量結(jié)果樣品名稱(chēng)NBMZM濃度(μg/μL)0.260.390.42表2Bradford法對(duì)大鼠陰莖平滑肌組織蛋白進(jìn)行定量結(jié)果樣品名稱(chēng)NBMZM濃度(μg/μL)1.751.291.46定量后，將各組蛋白質(zhì)消化后，用ITRAQ標(biāo)記試劑盒。液相純化后的肽段經(jīng)質(zhì)譜(ThermofisherQ-Exactive質(zhì)譜儀)檢測(cè)后獲得指紋圖譜，將質(zhì)譜圖輸入到PD(ProteomeDiscoverer1.3，thermo)軟件后，軟件先對(duì)質(zhì)譜譜圖進(jìn)行篩選鑒定，種類(lèi)，名稱(chēng)，PD提取后的譜圖用mascot進(jìn)行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析，最后檢索大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得最終鑒定到大鼠血清和陰莖平滑肌組織蛋白質(zhì)分別為318種和844種，具體參數(shù)如下。本發(fā)明實(shí)施例中，質(zhì)譜篩選的參數(shù)如下：母離子質(zhì)量范圍350Da-6000Da二級(jí)質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)10信噪比S/N域值1.5PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結(jié)果，使用PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。定性檢索參數(shù)如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產(chǎn)生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生自身環(huán)化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結(jié)合。peptidetol是一級(jí)質(zhì)譜的精度。MS/MStol是二級(jí)質(zhì)譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時(shí)最大允許漏切的數(shù)目。Enzyme是實(shí)驗(yàn)所使用的酶種類(lèi)。Database是檢索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)。Timefilescompressed為數(shù)據(jù)庫(kù)建立時(shí)間。Numberofsequences為數(shù)據(jù)庫(kù)中序列數(shù)。定量檢索參數(shù)如下：參數(shù)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)選項(xiàng)ProteinratioTypemedianMinimumpeptides1NormalisationmethodmedianP-value<0.05注:ProteinratioType：用來(lái)定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來(lái)定量的最少的uniquepeptide數(shù)Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來(lái)做矯正。P-value蛋白可信度評(píng)估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根據(jù)所述搜索結(jié)果和篩選后的譜圖定量分析，得到的分析數(shù)據(jù)在大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)(Uniprot-2014-rat(血清)和Uniprot-2015-rat(組織))中檢索，獲得血清總蛋白為318種，組織總蛋白844種，F(xiàn)DR<1％，具體見(jiàn)下表。注：Allspectra為全部的譜圖數(shù)；Matchedspectra為匹配上的譜圖數(shù)；Peptide為肽段種類(lèi)數(shù)；ProteinGroup為匹配上的蛋白總數(shù)；FDR為假陽(yáng)性率，本實(shí)施例使用的是假陽(yáng)性率小于1％來(lái)過(guò)濾結(jié)果。按照軟件操作規(guī)程，使用相同參數(shù)及方法，鑒定篩選獲得大鼠血清蛋白質(zhì)318種，組織蛋白844種。5、維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型血清及組織候選差異蛋白的篩選方法(1)維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型血清差異蛋白的篩選方法將BM組與ZM組的血清蛋白質(zhì)相比較，使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，比較得到BM/ZM的血清差異蛋白質(zhì)；將BM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，，使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型病證組的血清差異蛋白質(zhì)共計(jì)35種，如下表3，其中上調(diào)表達(dá)蛋白31種，下調(diào)表達(dá)蛋白4種：表3異常粘液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模病證組血清差異蛋白(2)維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型陰莖平滑肌組織差異蛋白的篩選方法使用上述軟件(取差異大于等于1.2倍，p值小于等于0.05)，將BM組與ZM組的陰莖平滑肌組織蛋白質(zhì)相比較，得到BM/ZM的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；將BM組與N組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計(jì)所述BM/ZM和BM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類(lèi)和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)型病證組的陰莖平滑肌組織差異蛋白質(zhì)共計(jì)48種，其中上調(diào)表達(dá)蛋白35種，下調(diào)表達(dá)蛋白13種。如表4所示：表4異常粘液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型組織病證組候選差異蛋白6、異常粘液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型血清候選差異蛋白的ELISA檢測(cè)隨機(jī)選擇7種血清候選差異蛋白，對(duì)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型與對(duì)照組進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以驗(yàn)證本發(fā)明血清候選差異蛋白是否可以作為異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的標(biāo)志物：即隨機(jī)選擇檢測(cè)第11號(hào)蛋白P48199(c反應(yīng)蛋白)；第13號(hào)蛋白P26644(β-2-糖蛋白1)；第15號(hào)蛋白P20059(血紅素結(jié)合蛋白)；第24號(hào)蛋白P04916(視黃醇結(jié)合蛋白4)；第26號(hào)蛋白P02767(甲狀腺素運(yùn)載蛋白)；第27號(hào)蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)和第33號(hào)蛋白O35460(血管生成素-1)分別使用雙抗夾心試劑盒(大鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠β2糖蛋白1(APOH)雙抗夾心試劑盒：武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；大鼠血紅素結(jié)合蛋白(HPx)雙抗夾心試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；大鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)雙抗夾心試劑盒：Abnova亞諾法生技股份有限公司；大鼠α1酸性糖蛋白(α1AG)雙抗夾心試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；大鼠血管生成素1(Ang-1)雙抗夾心試劑盒：Raybiotech瑞博奧(廣州)生物科技有限公司；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)正常對(duì)照組和病證組大鼠血清進(jìn)行ELSA檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如圖4A-G所示，由圖4可知，各個(gè)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型血清候選蛋白中除血管生成素-1的含量顯著低于對(duì)照組外，其它蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組，這與iTRAQ結(jié)果相符，說(shuō)明本發(fā)明方法獲得蛋白標(biāo)志物可以作為異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的血清的生物標(biāo)志物。與iTRAQ結(jié)果相符，說(shuō)明可以作為異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證血清的生物標(biāo)志物，具體結(jié)果見(jiàn)下表：各組大鼠血清中蛋白含量與N組相比*P<0.057.異常粘液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型陰莖平滑肌免疫組織化學(xué)檢測(cè)隨機(jī)選擇4種陰莖平滑肌組織候選差異蛋白，對(duì)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠與對(duì)照組大鼠陰莖平滑肌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以驗(yàn)證本發(fā)明組織中的候選差異蛋白是否可以作為異常黏液質(zhì)陽(yáng)痿病證的標(biāo)志物：即隨機(jī)選擇檢測(cè)第12號(hào)蛋白Q9Z2L0(電壓依賴(lài)性陰離子選擇性通道蛋白1)；第30號(hào)蛋白P02625(小清蛋白α)；第36號(hào)蛋白P04904(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α-3)和第44號(hào)蛋白P47853(雙鏈蛋白聚糖)分別使用上述蛋白的抗體(所有抗體均購(gòu)置于A(yíng)bcam(上海)貿(mào)易有限公司)，按照抗體說(shuō)明書(shū)對(duì)正常對(duì)照組和病證組大鼠陰莖平滑肌組織進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。照片放大倍數(shù)為物鏡倍數(shù)×目鏡倍數(shù)。染色結(jié)果計(jì)數(shù)方法如下：在放大倍數(shù)為400的情況下，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇6-10個(gè)視野，各視野之間完全不重疊，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每組一般為10個(gè)不同樣本，隨后進(jìn)行組間的比較。評(píng)分方法分為兩個(gè)方面，即陽(yáng)性范圍和著色強(qiáng)度。其中陽(yáng)性細(xì)胞所占視野中的百分比為陽(yáng)性范圍5％-100％；陽(yáng)性細(xì)胞染色的深淺為著色強(qiáng)度，分為4個(gè)等級(jí)，即0(幾乎不著色或者稍微有一點(diǎn)著色)、1(有著色，但比較淺)、2(有著色，比較深)、3(有著色，非常深)；最終結(jié)果為(陽(yáng)性范圍×著色強(qiáng)度)/視野個(gè)數(shù)。測(cè)定結(jié)果如表5所示，由表5可知，各個(gè)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型的陰莖平滑肌組織候選蛋白中電壓依賴(lài)性陰離子選擇性通道蛋白1和小清蛋白α的含量顯著高于正常對(duì)照組，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α-3和雙鏈蛋白聚糖的含量顯著低于正常對(duì)照組，這與iTRAQ結(jié)果相符，說(shuō)明本發(fā)明方法獲得蛋白標(biāo)志物可以作為異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的陰莖平滑肌組織的生物標(biāo)志物。表5各組大鼠陰莖組織中蛋白表達(dá)結(jié)果*與N比較<0.05以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3