本發(fā)明涉及藥品檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種中成藥的高效液相色譜檢測(cè)。

背景技術(shù)：

由丁香、肉桂、蓽茇三味中藥組成的藥物組合物丁桂兒臍貼，具有溫中健脾、散寒止瀉的功效。《中國(guó)藥典》中沒(méi)有記載該品種的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)中存在不足為：薄層鑒別中丁香、肉桂及蓽茇方法各不相同，有機(jī)溶劑消耗量大，污染環(huán)境，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并且完全不能定量，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量可控性差。

中國(guó)專(zhuān)利201210035570.5改進(jìn)了其質(zhì)量檢測(cè)的方法，但是該方法側(cè)重于對(duì)本藥物組合物主要成分的定性鑒別和定量檢測(cè)，缺乏對(duì)藥物整體質(zhì)量的控制。

因此，需要提供一種新的、快速、準(zhǔn)確并且適合工業(yè)化大生產(chǎn)需求的所述藥物組合物的質(zhì)量控制方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述至少一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種健脾溫中、散寒止瀉的藥物組合物中有效成分的測(cè)定方法，以及利用這種方法建立相應(yīng)指紋圖譜的方法。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，一種健脾溫中、散寒止瀉的藥物組合物中有效成分的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對(duì)照品溶液的制備：稱取桂皮醛對(duì)照品，加甲醇制得對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液的制備：取所述藥物組合物，粉碎，過(guò)篩，加入甲醇溶液，提取1～2小時(shí)，放至室溫，加入甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液。(3)測(cè)定法：吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，其中，

高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：流動(dòng)相a為甲醇，流動(dòng)相b選自甲酸，磷酸或乙酸，進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序如下表

流動(dòng)相的流速為0.8-1.2ml/min，柱溫25-40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：244～264nm。

本發(fā)明所選擇的檢測(cè)條件是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)反復(fù)比較和驗(yàn)證的，和現(xiàn)有技術(shù)比較，具有準(zhǔn)確度高，可以實(shí)現(xiàn)半定量測(cè)定的特點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，其中，步驟(1)中對(duì)照品溶液中桂皮醛的濃度0.1mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，其中，步驟(1)和(2)中甲醇的濃度為70～100％。優(yōu)選地，步驟(1)和(2)中甲醇的濃度分別為100％和75％。

根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方式，其中，步驟(2)中所述藥物組合物經(jīng)粉碎、過(guò)篩后加入甲醇，使得每100ml提取溶劑中所含藥粉為1g～5g。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，步驟(2)中提取方法為加熱回流提取。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)中流動(dòng)相b的濃度為0.2％。進(jìn)一步地，流動(dòng)相b可以為0.2％甲酸。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，最優(yōu)選的梯度洗脫程序可以為：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，色譜柱為agilentzorbaxsb-c18柱。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，色譜柱的柱溫優(yōu)選30℃。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，流動(dòng)相的流速優(yōu)選1ml/min。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為254nm。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，一種健脾溫中、散寒止瀉的藥物組合物高效液相指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：

(1)對(duì)照品溶液的制備：稱取桂皮醛對(duì)照品，加入濃度為70～100％的甲醇制得對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液的制備：取所述藥物組合物，粉碎，過(guò)篩，加入濃度為70～100％的甲醇溶液，使得每100ml提取溶劑中所含藥粉為1g～5g，加熱回流提取1-2小時(shí)，放至室溫，加入濃度為70～100％的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液。(3)獲得色譜圖：以對(duì)照品溶液作為參照物，將供試品溶液和對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，其中，

所述高效液相色譜儀的色譜條件如下：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相a為甲醇，流動(dòng)相b選自甲酸，磷酸或乙酸，進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序如下表

流動(dòng)相的流速為0.8-1.2ml/min，柱溫25-40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為244～264nm。

(4)生成對(duì)照指紋圖譜：選擇合格的多批所述藥物組合物色譜圖，以桂皮醛為參比峰，得到12個(gè)共有峰的圖譜，按中位數(shù)法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜，其中，指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間為：

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，桂皮醛色譜峰在供試品指紋圖譜中峰面積所占比例相對(duì)較大，且經(jīng)多個(gè)樣品實(shí)測(cè)，結(jié)果顯示其相對(duì)穩(wěn)定，因此選定6號(hào)峰桂皮醛作為丁桂兒臍貼指紋圖譜的參照物。本發(fā)明所得標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜參見(jiàn)附圖23。

本發(fā)明第一次采取hplc指紋圖譜對(duì)該品種進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)對(duì)流動(dòng)相和梯度洗脫條件等方法進(jìn)行優(yōu)化，使得圖譜的主峰分離良好，同時(shí)對(duì)照峰的峰形也明顯變好，可以全面控制本品的整體質(zhì)量，同時(shí)滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。通過(guò)本發(fā)明提供的方法建立的該品種標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可以為本品種的國(guó)際化提供良好的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從下面結(jié)合附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1根據(jù)本發(fā)明提供方法所得對(duì)照品指紋圖譜；

圖2根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所得供試品指紋圖譜；

圖3根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例210～350nm待測(cè)樣品色譜圖；

圖4根據(jù)本發(fā)明不同波長(zhǎng)下待測(cè)樣品色譜圖；

圖5不同濃度和種類(lèi)的提取溶劑所得供試品色譜圖；

圖6不同提取方式所得供試品色譜圖；

圖7不同提取時(shí)間所得供試品色譜圖；

圖8不同品牌色譜柱所得供試品色譜圖；

圖9不同柱溫所得供試品色譜圖；

圖10不同流速所得供試品色譜圖；

圖11確定色譜信息采集時(shí)間所得供試品色譜圖；

圖12采用乙腈-水流動(dòng)相所得供試品色譜圖；

圖13采用甲醇-水流動(dòng)相所得供試品色譜圖；

圖14采用甲醇-0.2％甲酸流動(dòng)相所得供試品色譜圖；

圖15采用甲醇-0.2％磷酸流動(dòng)相所得供試品色譜圖；

圖16采用甲醇-0.2％乙酸流動(dòng)相所得供試品色譜圖；

圖17系統(tǒng)適用性試驗(yàn)指紋圖譜；

圖18重復(fù)性試驗(yàn)指紋圖譜；

圖19中間精密度試驗(yàn)指紋圖譜；

圖20穩(wěn)定性試驗(yàn)指紋圖譜；

圖21儀器耐用性試驗(yàn)指紋圖譜；

圖22色譜柱耐用性試驗(yàn)指紋圖譜；

圖23根據(jù)本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1指紋圖譜建立

1.1儀器

agilent1260高效液相色譜儀，島津lc-20at高效液相色譜儀，agilent1200高效液相色譜儀，色譜柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl060354)，色譜柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl058060)，色譜柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl036549)，色譜柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl059648)，色譜柱(phenomenexgemiric18，4.6×250mm，5μm，s/n:695685-14)，色譜柱(thermoods-2hypersil，4.6×250mm，5μm，s/n:0905415n4)，色譜柱(inertsilods-3，4.6×250mm，5μm，s/n:1a7143425)，色譜柱(unitaryc18，4.6×250mm，5μm，s/n:z2013112901)。

1.2試劑

試劑：甲酸(ar，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(ar，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(ar，北京精求化工有限責(zé)任公司)，純水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，甲醇(ar，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(hplc，honeywell)。

對(duì)照品：丁香酚對(duì)照品(110725-200711，純度99.3％，中檢所)，桂皮醛對(duì)照品(110710-201016，純度98.6％，中檢所)，胡椒堿對(duì)照品(0775-200203，純度100％，中檢所)。

1.3檢測(cè)樣品

丁桂兒臍貼(批號(hào)：151012、151013、151014、151015、151016、151020、151065、151066、151067、151069)，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。

1.4測(cè)試方法

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0512)測(cè)定。

對(duì)照品溶液的制備取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備取丁桂兒臍貼，剪碎，混勻。取1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，取出，放至室溫，再稱定重量，用75％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱：agilentzorbaxsb-c18250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇為流動(dòng)相a，0.2％甲酸溶液為流動(dòng)相b，按下表進(jìn)行梯度洗脫：

檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫30℃；流速1.0ml/min；理論板數(shù)按桂皮醛峰計(jì)算應(yīng)不得低于10000。

測(cè)定法分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄90分鐘的色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1，2。

附圖1為對(duì)照品指紋圖譜，根據(jù)丁桂兒臍貼各藥味所含化學(xué)成分，選擇丁香酚、桂皮醛、胡椒堿作為參照物進(jìn)行成分確認(rèn)。附圖2可見(jiàn)供試品色譜圖中，呈現(xiàn)與桂皮醛對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并應(yīng)呈現(xiàn)12個(gè)與對(duì)照指紋圖譜相對(duì)應(yīng)的特征峰。由供試品指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜比較可知，6號(hào)峰為桂皮醛(保留時(shí)間為：37.7min)，7號(hào)峰為丁香酚(保留時(shí)間為：47.2min)，8號(hào)峰為胡椒堿(保留時(shí)間為：56.0min)。其中桂皮醛色譜峰在供試品指紋圖譜中峰面積所占比例相對(duì)較大，且經(jīng)多個(gè)樣品實(shí)測(cè)，結(jié)果顯示其相對(duì)穩(wěn)定，因此選定6號(hào)峰桂皮醛作為丁桂兒臍貼指紋圖譜的參照物(s)。

實(shí)施例2最佳色譜條件考察

儀器和試劑同實(shí)施例1。

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用pda檢測(cè)器對(duì)供試品進(jìn)行檢測(cè)，考察樣品色譜峰信息，篩選檢測(cè)波長(zhǎng)。

供試品溶液的制備：取本品，剪碎，混勻。取1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(500w，40khz)30分鐘，取出，放至室溫，用50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

采用agilentzorbaxsb-c18色譜柱，柱溫30℃，流速0.8ml/min，甲醇為流動(dòng)相a，水溶液為流動(dòng)相b，按下表進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣10ul，采集時(shí)間150min。

比較樣品在210nm-350nm內(nèi)色譜圖，230nm-270nm波段內(nèi)色譜吸收比較豐富且基線平穩(wěn)，見(jiàn)圖3。比較樣品在234nm(a)、244nm(b)、254nm(c)、264nm(d)處色譜峰情況，見(jiàn)圖4。254nm的指紋圖譜信息量比較多，能夠更加充分地體現(xiàn)本品的化學(xué)成分，且基線漂移不大。丁桂兒臍貼的處方有丁香、肉桂、蓽茇三味，其質(zhì)量控制成分分別為丁香酚、桂皮醛和胡椒堿，這三種成分最大吸收在280nm～343nm之間。綜合比較上述三種成分在254nm處均有吸收且圖形較好，故優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

2.2供試品溶液的制備考察

對(duì)照品溶液的制備和測(cè)定法同實(shí)施例1。

(1)提取溶劑濃度考察

取藥貼(批號(hào)151012)，剪碎，混勻。取6份，各1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入無(wú)水乙醇、甲醇、75％甲醇、50％甲醇、25％甲醇、水50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(500w，40khz)1小時(shí)，取出，放至室溫，再稱定重量，分別用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(agilentzorbaxsb-c18色譜柱，柱長(zhǎng)為250mm，內(nèi)徑為4.6mm，s/n:uscl060354)，以甲醇為流動(dòng)相a，0.2％甲酸為流動(dòng)相b，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫為30℃。

精密吸取供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1、圖5。

表1不同濃度和種類(lèi)的提取溶劑所得色譜峰面積

由上表可知，75％甲醇為溶劑提取時(shí)，所獲取指紋圖譜信息量較多，峰響應(yīng)值較大，故最優(yōu)選75％甲醇為提取溶劑。

(2)提取方式考察

取本品(批號(hào)151012)，剪碎，混勻。取2份，各1g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶和圓底燒瓶中，分別精密加入75％甲醇50ml，密塞，稱定重量，一份超聲處理(500w，40khz)1小時(shí)，另一份水浴加熱回流1小時(shí)，取出，放至室溫，再稱定重量，用75％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定方法同(1)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖6。

表2不同提取方式所得色譜峰面積

由上表可知，采用回流提取時(shí)，所獲取指紋圖譜信息量較多，峰響應(yīng)值較大，故優(yōu)選回流提取。

(3)提取時(shí)間考察

取本品(批號(hào)151012)，剪碎，混勻。取3份，各1g，精密稱定，分別置圓底燒瓶中，分別精密加入75％甲醇50ml，稱定重量，分別水浴加熱回流0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)，取出，放至室溫，再稱定重量，用75％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定方法同(1)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖7。

表3不同提取時(shí)間所得色譜峰面積

由上表可知，回流1小時(shí)即可獲得最多的信息量，峰響應(yīng)值也較大，故優(yōu)選回流1小時(shí)。

將以上制備方法所得到的色譜圖中主要色譜峰進(jìn)行積分，對(duì)比各保留時(shí)間下的峰面積，選擇色譜峰信息豐富，提取效率高，總峰面積較大的方法。

綜上所述，最終確定的最佳供試品制備方法為：取本品，剪碎，混勻。取1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，取出，放至室溫，再稱定重量，用75％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜柱的選擇

色譜柱的填料和裝填方式可能對(duì)藥品化學(xué)成分分離效果產(chǎn)生影響。發(fā)明人對(duì)agilentzorbaxsb-c18、phenomenexgemiric18、thermoods-2、inertsilods-3、unitaryc18五個(gè)不同品牌的c18色譜柱(5μm，250×4.6mm)進(jìn)行考察。其他色譜條件同實(shí)施例1。agilentzorbaxsb-c18柱的分離效果和峰型均優(yōu)于其余四種，故優(yōu)先選擇agilentzorbaxsb-c18色譜柱。結(jié)果見(jiàn)圖8。

2.4柱溫的選擇

在色譜指紋圖譜測(cè)定中，柱溫往往會(huì)影響分離效果，發(fā)明人分別在30℃、35℃、40℃三個(gè)柱溫條件下，對(duì)丁桂兒臍貼供試品溶液的指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明在30℃時(shí)各個(gè)色譜峰的分離效果比較好，故最優(yōu)選擇30℃為檢測(cè)時(shí)柱溫。結(jié)果見(jiàn)圖9。

2.5流速考察

在色譜指紋圖譜測(cè)定中，流速在一定程度上會(huì)影響分離效果，本試驗(yàn)分別在0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min四個(gè)流速條件下，對(duì)丁桂兒臍貼供試品溶液的指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明在1.0ml/min時(shí)各個(gè)色譜峰的分離效果比較好，故選擇1.0ml/min為最合適的流速。結(jié)果見(jiàn)圖10。

2.6色譜信息采集時(shí)間確定

為考察色譜信息采集時(shí)間，對(duì)本品進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下：色譜柱為agilentzorbaxsb-c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫30℃；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量10μl；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相a，0.2％甲酸溶液為流動(dòng)相b，按下表進(jìn)行梯度洗脫。采集120min內(nèi)的色譜信息，所得色譜圖見(jiàn)附圖11。

由圖可知，90min后無(wú)色譜峰，故只采集90min內(nèi)的色譜信息。

實(shí)施例3流動(dòng)相系統(tǒng)比較研究

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察不同的流動(dòng)相體系，篩選色譜峰信息最豐富，分離度最好的色譜條件。

供試品溶液的制備：取本品，剪碎，混勻。取1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(500w，40khz)30分鐘，取出，放至室溫，用50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

采用agilentzorbaxsb-c18色譜柱，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速1.0ml/min，考察乙腈-水溶液，甲醇-水溶液，甲醇-0.2％甲酸溶液、甲醇-0.2％磷酸溶液、甲醇-0.2％乙酸溶液5個(gè)系統(tǒng)。

(1)系統(tǒng)1：乙腈為流動(dòng)相a，水溶液為流動(dòng)相b，采集時(shí)間65min。洗脫梯度見(jiàn)下表，所得色譜圖參見(jiàn)附圖12。

(2)系統(tǒng)2：甲醇為流動(dòng)相a，水溶液為流動(dòng)相b，采集時(shí)間75min。洗脫梯度見(jiàn)下表，所得色譜圖參見(jiàn)附圖13。

(3)系統(tǒng)3：甲醇為流動(dòng)相a，0.2％甲酸溶液為流動(dòng)相b，采集時(shí)間70min。洗脫梯度見(jiàn)下表，所得色譜圖參見(jiàn)附圖14。

(4)系統(tǒng)4：甲醇為流動(dòng)相a，0.2％磷酸溶液為流動(dòng)相b，采集時(shí)間70min。洗脫梯度見(jiàn)下表，所得色譜圖參見(jiàn)附圖15。

(5)系統(tǒng)5：甲醇為流動(dòng)相a，0.2％乙酸溶液為流動(dòng)相b，采集時(shí)間70min。洗脫梯度見(jiàn)下表，所得色譜圖參見(jiàn)附圖16。

結(jié)果確定甲醇-0.2％甲酸溶液體系(系統(tǒng)3)對(duì)丁桂兒臍貼的供試品溶液色譜峰分離效果較好。

實(shí)施例4指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

4.1空白試驗(yàn)

取75％甲醇，按實(shí)施例1色譜條件直接進(jìn)樣，記錄90分鐘的色譜圖，結(jié)果表明體系不存在殘留和干擾。

4.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，制備成供試品溶液，直接進(jìn)樣6次，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，rsd均小于1％，相對(duì)峰面積相對(duì)恒定，rsd均小于3％；表明方法的系統(tǒng)適用性良好。結(jié)果見(jiàn)表4、表5、圖17。

表4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)相對(duì)保留時(shí)間

表5系統(tǒng)適用性試驗(yàn)相對(duì)峰面積

3.3重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)人員a，取同一批次丁桂兒臍貼(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，制備6份供試品溶液，檢測(cè)，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，rsd均小于1％，相對(duì)峰面積相對(duì)恒定，rsd均小于3％；表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表6、表7、圖18。

表6重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)保留時(shí)間

表7重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)峰面積

3.4中間精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)人員b，取同一批次丁桂兒臍貼(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，制備6份供試品溶液，用與實(shí)驗(yàn)人員a不同的高效液相色譜儀、不同的色譜柱檢測(cè)，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，rsd均小于1％，相對(duì)峰面積相對(duì)恒定，rsd均小于3％；表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表8、表9、圖19。

表8中間精密度試驗(yàn)相對(duì)保留時(shí)間

表9中間精密度試驗(yàn)相對(duì)峰面積

3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，分別于供試品制備0、2、4、8、12、18、24、32、40、48小時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，rsd均小于1％，相對(duì)峰面積相對(duì)恒定，rsd均小于3％；表明本品的供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表10、表11、圖20。

表10穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)保留時(shí)間

表11穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)峰面積

3.6耐用性試驗(yàn)

3.6.1不同儀器耐用性

取本品(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，使用不同型號(hào)的儀器進(jìn)行檢測(cè)，以agilent1260儀器圖譜為參照，以參照?qǐng)D譜計(jì)算不同儀器之間圖譜的相似度，結(jié)果表明不同儀器間測(cè)定結(jié)果大致相同，指紋圖譜相似度均大于0.98，說(shuō)明高效液相色譜儀的型號(hào)對(duì)本指紋圖譜方法影響不大。結(jié)果見(jiàn)表12、圖21。

表12儀器耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3.6.2不同批次色譜柱耐用性

取本品(批號(hào)151012)，按照實(shí)施例1方法操作，使用同一型號(hào)不同批次色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，以其中一個(gè)批次色譜柱(序列號(hào)uscl060354)圖譜為參照，計(jì)算相似度，結(jié)果表明不同批次色譜柱間測(cè)定結(jié)果大致相同，指紋圖譜相似度均大于0.99，說(shuō)明色譜柱的批次對(duì)本方法影響不大。結(jié)果見(jiàn)表13、圖22。

表13色譜柱耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3.7相對(duì)保留時(shí)間

以6號(hào)峰(桂皮醛)為參照峰，計(jì)算各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在表14所示的范圍內(nèi)。見(jiàn)表14。

表14相對(duì)保留時(shí)間

實(shí)施例5對(duì)照指紋圖譜建立

對(duì)亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的批號(hào)為151012、151013、151014、151015、151016、151020、151065、151066、151067、151069的丁桂兒臍貼，共計(jì)10批次樣品，分別按實(shí)施例1建立的指紋圖譜測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.0版本)擬合生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖23。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。