基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒的層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用量子點(diǎn)作為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于甲肝病毒的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強(qiáng)度檢測值實(shí)現(xiàn)樣本的定性及定量檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中甲肝病毒即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準(zhǔn)定量及便攜的特點(diǎn)。
【專利說明】基于低噪聲激發(fā)式黃光標(biāo)巧的甲肝病毒的層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體地說設(shè)及一種基于低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的 甲肝病毒免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒（HAV)引起的，W肝臟炎 癥病變?yōu)橹鞯膫魅静。饕ㄟ^糞-口途徑傳播，臨床上隊(duì)度乏，食欲減退，肝腫大，肝功能 異常為主要表現(xiàn)，部分病例出現(xiàn)黃痘，主要表現(xiàn)為急性肝炎，無癥狀感染者常見。任何年齡 均可患本病，但主要為兒童和青少年。成人甲肝的臨床癥狀一般較兒童為重。冬春季節(jié)常是 甲肝發(fā)病的高峰期。。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的甲肝病毒對人類的安全具有危 險，該菌在低溫仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品 衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加W重視。目前，甲肝病毒已經(jīng)作為致病菌檢測的一項(xiàng)重要指標(biāo)， 在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均有重要的意義，同時也對甲肝病毒 的快速及高精度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、易操作且能 夠定量的檢測方法，世界各國學(xué)者進(jìn)行了大量研究，從W傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到W免疫學(xué)、 分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實(shí)踐中不斷取得新進(jìn)展。
[0003] 免疫層析技術(shù)是一項(xiàng)有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的 新型免疫檢測技術(shù)，當(dāng)前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得 到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝 酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)遷移至交聯(lián)標(biāo) 記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標(biāo)記抗體 復(fù)合物，經(jīng)標(biāo)記物的顯色、發(fā)光或電化學(xué)反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實(shí)現(xiàn)特異性 免疫診斷。常用的標(biāo)記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和巧光分子 (如有機(jī)巧光染料、量子點(diǎn)、稀±元素配合物、上轉(zhuǎn)磯光顆粒等）。
[0004] 然而上述的標(biāo)記物卻存在靈敏度有限且無法實(shí)現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進(jìn)而限制 了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標(biāo)記催化生色底物的酶促反應(yīng)而 顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中甲肝病毒的檢測，通過單克隆 抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學(xué)方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選 純培養(yǎng)步驟，因此難W在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。
[0005] 對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從 而實(shí)現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準(zhǔn)確和無污染等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學(xué)方法無可比擬的優(yōu) 勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但該種 方法中存在標(biāo)記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且 只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標(biāo)記靈敏度有限且無法實(shí)現(xiàn)精確定量，限制了 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。
[0006] 另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所 見甚少，同時更難W實(shí)現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的 限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測甲肝病毒的 問題，進(jìn)而提供一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，并進(jìn)一步公 開了其應(yīng)用。
[000引為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒 免疫層析試紙條，包括：
[0009] 底板W及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部 位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的 檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；
[0010] 所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的可與甲肝病毒特異性結(jié)合的 單克隆抗體；
[0011] 所述檢測線由可與所述甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線 由與所述甲肝病毒W(wǎng)及所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形 成。
[0012] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，所述結(jié)合墊上噴 涂的所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗甲型肝炎病毒單克隆抗體（Abeam 公司）。
[0013] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，形成所述檢測線 的可與甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體為羊抗甲型肝炎病毒多克隆抗體（Abeam公司）。
[0014] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，形成所述質(zhì)控線 的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體（北京華大蛋白質(zhì)公司）。
[0015] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，所述的低噪聲激 發(fā)式巧光染料為發(fā)射波長為650-1000nm。
[0016] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，所述的低噪聲激 發(fā)式巧光染料為DyLi曲巧00。
[0017] 所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，所述質(zhì)控線與所 述檢測線平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控線間距0. 5cm。
[0018] 本發(fā)明提供了一種制備所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析 試紙條的方法，包括如下步驟：
[0019] A)取W PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料（便于取樣準(zhǔn)確），染 料與甲肝單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標(biāo) 記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標(biāo)記好的標(biāo)記產(chǎn)物中添加 終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鋼，4°C保存，備用；
[0020] B)在所述結(jié)合墊上噴涂W層析緩沖液稀釋25000倍后的上述步驟A)中的所述標(biāo) 記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0021] C)使用含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊上，室溫風(fēng)干 后，備用；
[0022] D)分別取所述甲肝病毒多克隆抗體和所述與甲肝病毒W(wǎng)及可與甲肝病毒特異性 結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控 線，室溫風(fēng)干，備用；
[0023] 巧將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿 所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
[0024] 本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝 病毒免疫層析試紙條在定性及定量檢測甲肝病毒領(lǐng)域中的用途。
[0025] 本發(fā)明提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析 試紙條檢測甲肝病毒的方法，包括如下步驟：
[0026] a) WPBS(7. 4)緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS緩 沖液作為陰性對照，分別用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；
[0027] b)巧光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的 巧光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述 檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)巧光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
[002引所述的檢測甲肝病毒的方法，還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量檢測的步驟；其中：
[0029] 所述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟包括：取HAV抗原配制成1-100倍梯度濃度的系列標(biāo)準(zhǔn) 品；并將上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品分別用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析，巧光掃描所述檢測線和 所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的巧光強(qiáng)度，制作抗原濃度與巧光強(qiáng) 度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程；
[0030] 所述定量檢測的步驟包括；取待測樣品W所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測，利用 上述標(biāo)準(zhǔn)曲線及工作方程求得所述甲肝病毒濃度。
[0031] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0032] (1)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，其發(fā) 射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長為650-1100nm)的低噪聲激發(fā)式巧光探針具有較高的 信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜區(qū)自 發(fā)巧光，使得基于此類探針標(biāo)記的分析檢測免受背景巧光干擾；因散射光強(qiáng)度與波長的四 次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式巧光探針受其干擾小。與常用的膠體金免 疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的免疫層析體系對祀病毒的靈敏度提 高約4倍；如甲肝病毒膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為4 y g/mU而本發(fā)明中基于低 噪聲激發(fā)式巧光染料的甲肝病毒免疫層析試紙條的最低檢出限為1 yg/mL。
[0033] (2)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式巧光甲肝病毒免疫層析試紙條定性檢測甲肝病毒 的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，本方法所設(shè)的免疫層析試紙條及低 噪聲激發(fā)式巧光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在lOmin內(nèi)完成，適用 于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于實(shí)時巧光定量PCR法等分子生物學(xué)方法則在儀器的檢測速 度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢。
[0034] (3)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式巧光甲肝病毒免疫層析試紙條定量檢測甲肝病毒 的方法可對所述甲肝病毒進(jìn)行定量檢測，傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆粒的聚集效應(yīng)而 生色W判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣品中祀標(biāo)菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān)系，但無法進(jìn)行 準(zhǔn)確定量，而本發(fā)明將近紅外巧光染料標(biāo)記于特異性抗體上，檢測線的巧光強(qiáng)度直接體現(xiàn) 了與捕獲分子相結(jié)合的祀標(biāo)菌的量，加之質(zhì)控線不隨樣本改變的巧光強(qiáng)度作為內(nèi)參，通過 掃描檢測線及質(zhì)控線上的巧光強(qiáng)度、計算比值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出檢樣中祀病毒 的濃度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
[0036] 圖1是實(shí)施例1中所述的低噪聲激發(fā)式巧光甲肝病毒免疫層析試紙條的示意圖；
[0037] 圖2是實(shí)施例2中所述的甲肝病毒低噪聲激發(fā)式巧光檢測圖；
[003引圖3是實(shí)施例3中所述的甲肝病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 圖中附圖標(biāo)記表示為；1-樣品墊，2-結(jié)合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質(zhì)控 線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 本實(shí)施例所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條如圖1 所示，其包括，底板7 W及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊1、 結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6,且所述樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6之 間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述底板7的中 間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5,所述檢測線4靠近所述結(jié)合墊2,所述質(zhì) 控線5靠近所述吸水墊6。所述質(zhì)控線4與所述檢測線5平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控 線間距0. 5畑1。
[0042] 所述結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式巧光染料標(biāo)記的可與甲肝病毒特異性結(jié)合 的單克隆抗體鼠抗甲型肝炎病毒單克隆抗體；所述檢測線4由可與所述甲肝病毒特異性結(jié) 合的多克隆抗體羊抗甲性肝炎病毒多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線5由與所述甲肝病毒 W及所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體涂層形 成。
[0043] 所述的低噪聲激發(fā)式巧光染料為發(fā)射波長為777皿，發(fā)射光波長為790nm的NHS活 化的低噪聲激發(fā)式巧光染料DyLi曲巧00作為巧光分子。
[0044] 上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條的制備方法，包括 如下步驟：
[0045] 1)低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒單克隆抗體.
[0046] 取W PBS(抑7. 4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式巧光染料（便于取樣準(zhǔn) 確），染料與甲肝單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所 得的標(biāo)記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標(biāo)記好的標(biāo)記產(chǎn)物 中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鋼，4°C保存，備用；；
[0047] 2)制作結(jié)合墊
[0048] 選取玻璃纖維素膜為所述結(jié)合墊2,在所述結(jié)合墊2上噴涂W層析緩沖液稀釋 10000倍后的所述標(biāo)記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0049] 如制作樣品墊
[0化日]選取纖維素膜為所述樣品墊1，使用含5% BSA，0. 1 % Tween 20的PBS緩沖液噴涂 在所述樣品墊1上，室溫風(fēng)干后，備用；
[0化1] 4)抗體承載膜
[0052] 選取硝酸纖維素膜為所述抗體承載膜3,分別取所述甲肝病毒多克隆抗體和所述 羊抗鼠IgG(北京華大蛋白質(zhì)公司）多克隆抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜3上劃所述檢 測線4和所述質(zhì)控線5,室溫風(fēng)干，備用；
[0化3] 5)組裝免疫層析試紙條
[0化4] 將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水墊6 沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3,然后在抗 體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6,使吸水墊6與抗體承載膜3部分重疊， 然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結(jié)合墊2,使所述抗體承載膜3 與所述結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)所述樣 品墊1，最后切割成0. 5cm寬，即得試紙條。
[0化5] 實(shí)施例2
[0化6] 本實(shí)施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層 析試紙條進(jìn)行定性檢測甲肝病毒的方法，包括如下步驟：
[0057] a)取毛蝴肉質(zhì)部分樣品25g，剪碎，用225血含5% BSA，0. 1% Tween20的PBS緩 沖液稀釋樣品，劇烈震蕩混勻取上清液作為檢樣，吸取1ml上清液待用。吸取50 y L經(jīng)超聲 處理的檢樣滴加到樣品墊1上，待吸收干后再滴加50 y L層析液，另取所述緩沖液作為陰性 對照，用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；
[0化引 b)室溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀（北京博潤福得科技發(fā) 展有限公司）分別測定所述檢測線4和所述質(zhì)控線5區(qū)域的巧光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線5區(qū) 域出現(xiàn)巧光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線4區(qū)域同時出現(xiàn)巧光 發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性，附圖2給出了對上述樣品的定性檢測結(jié)果。
[0化9] C)將沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、副溶血 弧菌分別調(diào)制成0. 6 X 104CFU/血菌液，按照先前介紹的方法進(jìn)行破菌處理，吸取100 y L經(jīng) 超聲處理的樣本滴加到樣品墊上，待吸收干后再滴加50 y L層析液。室溫放置15min后，用 便攜式近紅外巧光掃描儀讀數(shù)。除甲肝病毒樣品外，其余檢測的細(xì)菌在檢測線位置均未出 現(xiàn)發(fā)射峰，各菌的試紙條均在質(zhì)控線處出現(xiàn)發(fā)射峰。表明本方法對甲肝病毒的檢測特異性 好，與其他四個菌屬無交叉反應(yīng)。
[0060] 實(shí)施例3
[0061] 本實(shí)施例提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式巧光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層 析試紙條定量檢測甲肝病毒的方法。
[0062] (a)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取Img/ml的HAV抗原（HAV抗原為猴腎細(xì)胞培養(yǎng)后的滅活全 病毒）（上海生物制品研究所），用含5% BSA，0. 1% Tween 20，PBS稀釋液將所述抗原進(jìn)行 倍數(shù)系列稀釋，制成1、5、12. 5、25、50、100、yg/ml的樣品；
[0063] 化）吸取50 uLW上已知濃度的甲肝病毒樣本滴加到樣品墊1上，待樣品吸收后再 滴加50 y L層析液，室溫靜置10分鐘，將上述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式巧光掃描儀 (北京博潤福得科技發(fā)展有限公司）中讀數(shù)。上述系列稀釋的甲肝病毒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢 巧。，掃描獲得檢測線4和質(zhì)控線5的巧光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域巧光峰和質(zhì)控區(qū)域巧光峰方 表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平行測量兩次，取平均值作為測量值，檢測結(jié)果見表1，W該 值對相應(yīng)的樣品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示，并擬合得適用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0064] 表1不同濃度甲肝病毒菌標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)檢測結(jié)果
[00 化]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，其特征在于，包括： 底板（7)以及沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（1)、結(jié)合 墊（2)、抗體承載膜（3)和吸水墊（6)，且所述樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、抗體承載膜（3)和吸 水墊（6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜（3)粘附于所述 底板（7)的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線（4)和質(zhì)控線（5)，所述檢測線（4)靠近 所述結(jié)合墊（2)，所述質(zhì)控線（5)靠近所述吸水墊（6); 所述結(jié)合墊（2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的可與所述甲肝病毒特異性結(jié) 合的單克隆抗體； 所述檢測線（4)由可與所述甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線 (5)由與所述甲肝病毒以及所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層 形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條，其 特征在于，所述結(jié)合墊（2)上噴涂的所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗甲 型肝炎病毒單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙 條，其特征在于，形成所述檢測線（4)的所述可與甲肝病毒特異性結(jié)合的多克隆抗體為羊 抗甲型肝炎病毒多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試 紙條，其特征在于，形成所述質(zhì)控線（5)的抗體為羊抗鼠 IgG多克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試 紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為650-1000nm的熒光分子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙 條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料 DyLight800。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層 析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟： A) 取以PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，染料與沙門氏菌單克隆 抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標(biāo)記產(chǎn)物放入含有 PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標(biāo)記好的標(biāo)記產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20 和 0? 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用； B) 在所述結(jié)合墊（2)上噴涂以層析緩沖液稀釋25000倍后的上述步驟A)中的所述標(biāo) 記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用； C) 使用含5% BSA，0. 1% Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊（1)上，室溫風(fēng)干 后，備用； D) 分別取所述甲肝病毒多克隆抗體和所述與甲肝病毒以及可與甲肝病毒特異性結(jié)合 的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機(jī)在所述抗體承載膜（3)上劃所述檢測線（4)和所述質(zhì) 控線（5)，室溫風(fēng)干，備用； E) 將上述步驟獲得的所述樣品墊（1)、所述結(jié)合墊（2)、所述抗體承載膜（3)和所述吸 水墊（6)沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層析試紙條 在定性及定量檢測甲肝病毒領(lǐng)域中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的甲肝病毒免疫層 析試紙條檢測甲肝病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS 緩沖液作為陰性對照，分別以利用權(quán)利要求1-6任一所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測； b) 熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控 線（5)區(qū)域的熒光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線（5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反 之則無效；若所述檢測線（4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測甲肝病毒的方法，其特征在于，還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及 定量檢測的步驟：其中所述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟包括：取HAV抗原（HAV抗原為猴腎細(xì)胞培 養(yǎng)后的滅活全病毒）（上海生物制品研宄所）配制成1-100倍梯度濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品；并將 上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品分別用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析，熒光掃描所述檢測線（4)和所述 質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線⑷和所述質(zhì)控線（5)區(qū)域的熒光強(qiáng)度，制作抗原濃度與 熒光強(qiáng)度比之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合方程； 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進(jìn)行免疫層析檢測，利用上述 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程計算得到所述甲肝病毒濃度。
【文檔編號】G01N33/569GK104502590SQ201410814980
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 許美玲, 楊向瑩, 劉潔, 康西西, 張曉光, 舒咬根, 陳廣全 申請人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 中華人民共和國臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局