一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于海洋化學(xué)工程技術(shù)，具體涉及一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法。對右旋糖酐標準品進行色譜分析，繪制標準曲線，得線性回歸方程；將待測的特定聚合度范圍的兩端值n1和n2對應(yīng)的殼寡糖的分子量M1和M2帶入上述線性回歸方程得出待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間t1和t2；以測定標準樣品的色譜分析條件對待測殼寡糖溶液進行分析，以待測樣品色譜圖獲得待測樣品對應(yīng)的色譜峰總面積A及在待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間t1～t2內(nèi)的色譜面積At1-t2，根據(jù)色譜面積公式獲得特定聚合度范圍n1～n2的殼寡糖含量。本發(fā)明采用凝膠排阻色譜以分子量為校準間接測定特定聚合度殼寡糖的含量，分析步驟少，操作簡便。
【專利說明】一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋化學(xué)工程技術(shù)，具體涉及一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]殼寡糖，又稱低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖，是一種由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D氨基葡萄糖通過β -1, 4糖苷鍵連接而成線性寡糖。殼寡糖是一種重要的海洋生物資源，被發(fā)現(xiàn)具有多種生理活性，如抗腫瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，調(diào)節(jié)血糖血脂，增強免疫力，活化腸道菌群等。2014年5月，國家衛(wèi)生委已經(jīng)批準殼寡糖作為新食品原料，這對于殼寡糖行業(yè)發(fā)展具有重要意義。目前，殼寡糖主要通過殼聚糖的酸解，氧化降解，或酶解三種技術(shù)得到。這些技術(shù)制備的殼寡糖產(chǎn)物是一個非常復(fù)雜的混合物，其中含有各個聚合度的殼寡糖。殼寡糖的聚合度分布對于其生理活性具有重要影響。殼寡糖新食品原料規(guī)定，殼寡糖中2-10個聚合度的寡聚氨基葡萄糖含量不得低于80%。因此，如何準確測定特定聚合度范圍的殼寡糖含量具有重要意義。
[0003]目前，對于寡糖聚合度分布的檢測主要采用薄層層析法(TLC)，高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜法。薄層層析方法不需大型儀器設(shè)備，操作簡便，是實驗室最初常用的檢驗寡糖聚合度分布的方法，一般聚合度小于6的殼寡糖能夠在薄層板上實現(xiàn)很好的分離，但其色帶分布不均，長伴有拖尾現(xiàn)象，且重復(fù)試驗差異較大，很少用于寡糖聚合度分布的定量分析。質(zhì)譜是一種非常有力的寡糖分析技術(shù)，它能直接給出寡糖中各個成分的準確分子量分布，已被廣泛運用于寡糖混合物的分析，其中基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F/MS)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI/MS)最為常見。雖然質(zhì)譜信號豐度與對應(yīng)組分的含量存在一定的關(guān)聯(lián)，但并沒有準確的定量關(guān)系，因此質(zhì)譜法一般只能用于寡糖組分的定性分析，有關(guān)質(zhì)譜法在寡糖各組分的定量分析目前僅有少量的文獻報道，正處于研發(fā)階段，技術(shù)手段尚未成熟。
[0004]對于低分子量殼寡糖，通常采用特定的高相液相色譜(HPLC)系統(tǒng)能夠測定出殼寡糖中具體的聚合度分布以及每一個殼寡糖單體的含量，包括氨基正相/反相色譜，離子交換色譜，親水色譜等。然而，由于缺乏單一聚合度殼寡糖標準品進行校準，尤其對于聚合度大于6的殼寡糖單體及具有特定序列排布的N-乙?；瘹す烟菃误w目前還很難獲得標準品，這給方法實際應(yīng)用帶來困難。因此，研發(fā)一種準確測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法是十分必要的，這對于殼寡糖新食品原料的生產(chǎn)、監(jiān)管及整個行業(yè)發(fā)展具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法，
[0008]對右旋糖酐標準品進行色譜分析，以測定的標準品的保留時間(t)與其分子量對數(shù)繪制標準曲線，得到分子量與保留時間的線性回歸方程；
[0009]將待測的特定聚合度范圍的兩端值Ii1和n2對應(yīng)的殼寡糖的分子量M1和M2帶入上述線性回歸方程得出待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間h和t2 ；
[0010]以測定標準樣品的色譜分析條件對待測殼寡糖溶液進行分析，以待測樣品色譜圖獲得待測樣品對應(yīng)的色譜峰總面積A及在待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間h?t2內(nèi)的色譜面積Atl_t2，根據(jù)色譜面積公式獲得特定聚合度范圍Ii1?n2的殼寡糖含量；
[0011]其中，色譜面積公式=Atl_t2X100% /A。
[0012]所述色譜分析采用凝膠排阻色譜。所述凝膠排阻色譜為TSK G3000-PWa*相同性質(zhì)的色譜填充柱。
[0013]所述凝膠排阻色譜分析系統(tǒng)分析條件為:上樣量為2_50yL，流動相為:0.02-0.2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，流速為:0.5-1.0mL/min，檢測器為:示差折光檢測器。
[0014]所述已知分子量的右旋糖酐標準品分子量為180，1000, 2700, 5250, 9750, 13050, 36800Da或具有相同性質(zhì)的右旋糖酐分子量標準系列。
[0015]本發(fā)明所具有的優(yōu)點:
[0016]1.本發(fā)明從宏觀角度入手，以分子量對殼寡糖樣品進行表征，通過對特定聚合度殼寡糖的分子量范圍進行界定，采用色譜峰面積進行定量測定，避免了單一聚合度、特定N-乙酰化殼寡糖標準品的使用，可操作性強。
[0017]2.本發(fā)明采用凝膠排阻色譜以分子量為校準間接測定特定聚合度殼寡糖的含量，分析步驟少，操作簡便，是一種簡便有效的測定殼寡糖聚合度分布方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例提供的右旋糖酐標準品分子量與色譜保留時間的校準曲線。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例提供的待測樣品中聚合度2-10殼寡糖的色譜積分范圍示意圖。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例提供的待測樣品中聚合度3-8殼寡糖的色譜積分范圍示意圖。
具體實施例
[0021]下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步說明，并且本發(fā)明的保護范圍不僅局限于以下實施例。
[0022]實施例1
[0023]測定殼寡糖樣品中聚合度為2-10的寡糖含量:
[0024]稱取分子量分別為180，1000, 2500, 5000, 7100, 12000的右旋糖酐標準品各4mg，溶于Iml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(緩沖溶液中醋酸濃度為0.2mol/L，醋酸鈉濃度為0.1mol/L)中，采用高效凝膠排阻色譜分別測定各右旋糖酐標準品色譜保留時間，色譜條件為:
[0025]色譜柱:TSKG3000-PWxl (250 X 4.6mm)
[0026]流動相:0.2M醋酸/0.1M醋酸鈉緩沖液
[0027]流速:0.8mL/min。
[0028]檢測器:示差檢測器。
[0029]各右旋糖酐標準品的經(jīng)色譜分析獲得對應(yīng)分子量為180，1000，2500，5000, 7100, 12000的右旋糖酐標準品的色譜保留時間分別為11.938,10.872，
10477.10.015.9.676,9.433min0以保留時間(t)和對應(yīng)右旋糖酐標準品的分子量對數(shù)(log Mp)繪制標準曲線(參見圖1)，獲得線性回歸方程，log Mp = -0.7254t+10.926 ； (R2=0.9949)。
[0030]將全脫乙酰化殼二糖的分子量仏(3400幻和全脫乙?；瘹な堑姆肿恿縈1(IeZSDa)分別帶入上述回歸方程，計算出殼二糖和殼十糖在凝膠排阻色譜中的理論保留值 t2 和 ^t1 分別為 t2 = 11.572min 和 ^t1 = 10.635min。
[0031]以上述測定標準樣品的色譜分析條件下，將待測樣品注入色譜系統(tǒng)進行分析，獲得待測殼寡糖樣品的凝膠排阻色譜分析譜圖，采用凝膠色譜分析軟件(色譜儀自帶軟件)分別對待測樣品的色譜峰及待測樣品特定聚合度理論保留時間t2 (11.572min)到^(10.635min)范圍內(nèi)的峰面積進行積分(參見圖2)，計算出待測樣品對應(yīng)的色譜峰總面積A (830641)及在&?t2時間內(nèi)的色譜面積Atl_t2 (709456)，那么待測殼寡糖樣品中聚合度 2 ?10 的殼寡糖含量為:709456X100% /830641 = 85.41%。
[0032]實施例2
[0033]測定殼寡糖樣品中聚合度3-8的寡糖含量
[0034]稱取分子量分別為180，1000, 2500, 5000, 7100, 12000的右旋糖酐標準品各4mg溶于Iml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(緩沖溶液中醋酸濃度為0.2mol/L,醋酸鈉濃度為0.1mol/L)中，采用高效凝膠排阻色譜分別測定各右旋糖酐標準品色譜保留時間，色譜條件為:
[0035]色譜柱:TSKG3000-PWxl (250 X 4.6mm)
[0036]流動相:0.2M醋酸/0.1M醋酸鈉緩沖液
[0037]流速:0.8mL/min。
[0038]檢測器:示差檢測器。
[0039]各右旋糖酐標準品的經(jīng)色譜分析獲得對應(yīng)分子量為180，1000，2500，5000, 7100, 12000的右旋糖酐標準品的色譜保留時間分別為11.938,10.872，
10477.10.015.9.676,9.433min0以保留時間(t)和對應(yīng)右旋糖酐標準品的分子量對數(shù)(log Mp)繪制標準曲線(參見圖1)，獲得線性回歸方程，log Mp = -0.7254t+10.926 ； (R2=0.9949)。
[0040]將全脫乙?；瘹と堑姆肿恿縼?5010幻和全脫乙?；瘹ぐ颂堑姆肿恿縈1(UOeDa)分別帶入上述回歸方程，計算出殼三糖和殼八糖在凝膠排阻色譜中的理論保留值 t2 和 ^t1 分別為 t2 = 11.340min 和 ^t1 = 10.767min。
[0041]以上述測定標準樣品的色譜分析條件下，將待測樣品注入色譜系統(tǒng)進行分析，獲得待測殼寡糖樣品的凝膠排阻色譜分析譜圖，采用凝膠色譜分析軟件分別對待測樣品的色譜峰及待測樣品特定聚合度理論保留時間t2(ll.340min)到tJl0.767min)范圍內(nèi)的峰面積進行積分(參見圖3)，計算出待測樣品對應(yīng)的色譜峰總面積A(830641)及在h?t2時間內(nèi)的色譜面積Atl_t2(563545)，那么待測殼寡糖樣品中聚合度3?8的殼寡糖含量為:563545X100% /830641 = 67.84%。
【權(quán)利要求】
1.一種測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法，其特征在于: 對右旋糖酐標準品進行色譜分析，以測定的標準品的保留時間(t)與其分子量對數(shù)繪制標準曲線，得到分子量與保留時間的線性回歸方程； 將待測的特定聚合度范圍的兩端值Ii1和n2對應(yīng)的殼寡糖的分子量M1和M2帶入上述線性回歸方程得出待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間h和t2 ； 以測定標準樣品的色譜分析條件對待測殼寡糖溶液進行分析，以待測樣品色譜圖獲得待測樣品對應(yīng)的色譜峰總面積A及在待測的特定聚合度范圍的兩端值殼寡糖的色譜保留時間h?t2內(nèi)的色譜面積Atl_t2，根據(jù)色譜面積公式獲得特定聚合度范圍Ii1?n2的殼寡糖含量; 其中，色譜面積公式=Atl_t2X100% /K。
2.按權(quán)利要求1所述的測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法，其特征在于:所述色譜分析采用凝膠排阻色譜。
3.按權(quán)利要求1所述的測定特定聚合度范圍殼寡糖含量的方法，其特征在于:所述凝膠排阻色譜分析系統(tǒng)分析條件為:上樣量為2-50 μ L，流動相為:0.02-0.2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，流速為:0.5-1.0mL/min，檢測器為:示差折光檢測器。
【文檔編號】G01N30/02GK104345102SQ201410605992
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】李克成, 李鵬程, 邢榮娥, 劉松, 秦玉坤, 何曉飛 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所