一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法及應用，屬于新型功能材料、生物傳感檢測【技術領域】。本發(fā)明基于四亞甲基五胺功能化石墨烯修飾電極，銀-二氧化鈰作為糖類抗原二抗標記物，顯著提高了免疫傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)了CA125、CAl5–3、CA549、CA27–29、CAl9–9、CAl9-5、CA50、CA72–4．CA72–4及CA242的靈敏、特異及快速檢測。
【專利說明】一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法及應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法及應用。具體是采用四亞甲基五胺功能化石墨烯和銀-二氧化鈰，制備一種檢測腫瘤標志物糖類抗原的電化學免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]20世紀80年代，專家利用雜交瘤技術獲得了能識別腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原'社6 ￡1111:18611,…)，并研制了單克隆抗體識別系統(tǒng)。糖蛋白類抗原大體可分為兩類；一類是哺乳動物上皮細胞分泌的大分子量粘蛋白，如…125,0^15-3,^ 549,0^27 - 29等，其中有些如0115 - 3、01549、27 - 29實際為異構體，都是乳腺癌的腫瘤標志物；另一類是唾液酸巖藻糖的衍生物，如。八19 — 9、0119-5、0150、^ 72-4.^ 72 - 4、^242等，常為消化道腫瘤、胰腺癌的標志。
[0003]目前已有的腫瘤標志物的臨床檢測方法很多，如放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等。免疫傳感器是將免疫學方法與分析化學方法相結合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性性結合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優(yōu)點。
[0004]電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動化檢測分析等優(yōu)點，因此本發(fā)明制備了一種合金負載分子篩電化學免疫傳感器，實現(xiàn)了對腫瘤標志物的檢測。
[0005]本發(fā)明利用四亞乙烯五胺與石墨烯復合物解決了石墨烯在水中易通過強烈的X - X疊加作用和范德華力形成不可逆的團聚體的問題，確保了石墨烯在電極表面的穩(wěn)定覆蓋。另外由于其表面具有較多的氨基基團使得其與蛋白質(zhì)的結合更為牢固，用在傳感器的制備中使傳感器的穩(wěn)定性得到了很大程度的提升。在不使用酶的情況下，首次將稀土材料二氧化鈰的優(yōu)異的催化性能利用在電化學免疫傳感器的構建中，結合優(yōu)異的導電性和生物相容性，對雙氧水11202有良好的催化能力，并在檢測過程中產(chǎn)生良好的電化學信號，有效地降低了傳感器的檢出限，可用于多種腫瘤標志物糖類抗原的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優(yōu)點，而且制備過程較為簡單，有效克服了目前腫瘤標志物糖類抗原檢測方法的不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是基于四亞甲基五胺功能化石墨烯和銀-二氧化鈰，構建了一種無酶、快速且超靈敏的夾心型電化學免疫傳感器。
[0007]本發(fā)明的目的之二是將該夾心型電化學免疫傳感器應用于多種腫瘤標志物糖類抗原的檢測。
[0008]本發(fā)明的技術方案如下:
1.一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，步驟如下: (1)玻碳電極依次用1.0、0.3、0.05 Mm的Al2O3粉末磨平并拋光后，超聲清洗，在電極表面滴加6yL、f4 mg/mL的四亞甲基五胺功能化石墨烯水溶液，干燥；
(2)加入3μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.(Γ3.0%戊二醛溶液，干燥，滴加6 PL、質(zhì)量分數(shù)為5?10U g/mL的糖類抗原一抗Ab1,保持濕潤Ih ；
(2)用pH6.Γ8.4 PBS緩沖溶液洗去未連接上的糖類抗原一抗Ab1，并用3 μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.(Γ3.0%的BSA封閉非特異性活性位點，加入6 μ L、0.0Of 20 ng/mL的一系列不同濃度的糖類抗原標準溶液，濕潤條件下孵育Ih ；
(3)將6μ L銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液滴在電極表面，保持濕潤0.5^1.5h，用pH 6.4^8.4 PBS緩沖溶液洗去未連接上的銀-二氧化鈰-Ab2,免疫傳感器制作完成。
[0009]銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)銀-二氧化鈰的制備
將0.Γ0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在1(T40 mL的甲醇中溶解，加入0.5^2.0 g 二氧化鈰，0.l(Tl.0g硝酸銀和0.3^0.8 mL、質(zhì)量分數(shù)為25°/Γ28%氨水，攪拌，將其轉入不銹鋼反應釜中，在烘箱中分別于160 1:和200 °C反應2(T30 h，冷卻至室溫，收集產(chǎn)物，并將產(chǎn)物用乙醇離心洗滌3次，所得產(chǎn)物于70 V°C下干燥，研磨，再于40(T5(KrC煅燒5 h，制得銀-二氧化鈰樣品；
(2)銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2二抗孵化物溶液的制備
將銀-二氧化鈰樣品40?100 mg分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，加入I mL、50?150 μ g/mL的糖類抗原二抗Ab2和300?700 μ L、質(zhì)量分數(shù)為0.5?1.5 °/c^^BSA，震蕩12 h后離心洗滌，將得到的銀-二氧化鈰-糖類抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，制得銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液，儲存于4 °C下備用。
[0010]糖類抗原的檢測，步驟如下:
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、30?70 mmol.Γ\ρΗ6.5?7.5的PBS緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法法對糖類抗原標準溶液進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4 V，取樣間隔設置為0.1秒,運行時間設置為400秒；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL pH=6.5?7.5的PBS中注入10 μ L、5^10 mo I.Γ1的質(zhì)量分數(shù)為30%雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4)將待測樣品溶液代替糖類抗原抗原標準溶液進行檢測。
[0011]4.上述所述糖類抗原選自下列之一:CA 125、CA15 - 3、CA 549、CA 27 - 29、CA19-9、CA19-5、CA50、CA 72 - 4.CA 72-4、CA 242。
[0012]本發(fā)明的有益成果
1.利用四亞乙烯五胺與石墨烯復合物解決了石墨烯在水中易通過強烈的31 - JI疊加作用和范德華力形成不可逆的團聚體的問題，確保了石墨烯在電極表面的穩(wěn)定覆蓋。另外由于其表面具有較多的氨基基團使得其與蛋白質(zhì)的結合更為牢固，用在傳感器的制備中使傳感器的穩(wěn)定性得到了很大程度的提升。
[0013]2.首次將稀土材料二氧化鈰的優(yōu)異的催化性能利用在電化學免疫傳感器的構建中，結合八8優(yōu)異的導電性和生物相容性，使稀土材料在傳感器中得到很好的應用。
[0014]3.結合免疫學方法，提高了傳感器的特異性。
[0015]4.本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器用于多種腫瘤標志物糖類抗原的檢測，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、靈敏和特異性檢測；對糖類抗原檢測的檢測限可達到0.054呢/此。

【具體實施方式】
[0016]實施例1 一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，步驟如下:
(1)玻碳電極依次用1.04.3、0』5觸的八1203粉末磨平并拋光后，超聲清洗，在電極表面滴加6 0 的四亞甲基五胺功能化石墨烯水溶液，干燥；
(2)加入3^ 1、質(zhì)量分數(shù)為1.0%戊二醒溶液，干燥，滴加6叱、質(zhì)量分數(shù)為5的糖類抗原一抗仙工，保持濕潤1匕；
(2)用邱6.4 ？88緩沖溶液洗去未連接上的糖類抗原一抗仙工，并用3^1、質(zhì)量分數(shù)為
1.0%的8“封閉非特異性活性位點，加入6^ 1^0.00廣20叩/此的一系列不同濃度的糖類抗原標準溶液，濕潤條件下孵育111 ；
(3)將69 [銀-二氧化鈰-糖類抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在電極表面，保持濕潤
0.5匕用邱6.4 ？88緩沖溶液洗去未連接上的銀-二氧化鈰-仙2，免疫傳感器制作完成。
[0017]實施例2 —種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，步驟如下:
(1)玻碳電極依次用1.04.3、0』5觸的八1203粉末磨平并拋光后，超聲清洗，在電極表面滴加6^ 1^2^/1111的四亞甲基五胺功能化石墨烯水溶液，干燥；
(2)加入3^ 1、質(zhì)量分數(shù)為1.01.0%戊二醒溶液，干燥，滴加6叱、質(zhì)量分數(shù)為7 4邑/1111的糖類抗原一抗仙工，保持濕潤1匕；
(2)用邱7.4 ？83緩沖溶液洗去未連接上的糖類抗原一抗仙工，并用3^1、質(zhì)量分數(shù)為
2.0%的8“封閉非特異性活性位點，加入6^ 1^0.00廣20叩/此的一系列不同濃度的糖類抗原標準溶液，濕潤條件下孵育111 ；
(3)將69 [銀-二氧化鈰-糖類抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在電極表面，保持濕潤1.0匕，用邱7.4 ？88緩沖溶液洗去未連接上的銀-二氧化鈰-仙2，免疫傳感器制作完成。
[0018]實施例3 —種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，步驟如下:
(1)玻碳電極依次用1.04.3、0』5觸的八1203粉末磨平并拋光后，超聲清洗，在電極表面滴加6^ 1?4呢/此的四亞甲基五胺功能化石墨烯水溶液，干燥；
(2)加入311 [、質(zhì)量分數(shù)為3.0%戊二醒溶液，干燥，滴加6叱、質(zhì)量分數(shù)為10 ^
的糖類抗原一抗仙工，保持濕潤1匕；
(2)用6.0.4 ？83緩沖溶液洗去未連接上的糖類抗原一抗仙工，并用3^1、質(zhì)量分數(shù)為3.0%的8“封閉非特異性活性位點，加入6 ^ 1,0.00廣20叩/此的一系列不同濃度的糖類抗原標準溶液，濕潤條件下孵育1匕；
(3)將69 [銀-二氧化鈰-糖類抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在電極表面，保持濕潤
1.5匕用邱8.4 ？88緩沖溶液洗去未連接上的銀-二氧化鈰-仙2，免疫傳感器制作完成。
[0019]實施例4銀-二氧化鈰-糖類抗原仙2二抗孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)銀-二氧化鈰的制備將0.1g聚乙烯吡咯烷酮在1mL的甲醇中溶解，加入0.5g 二氧化鈰，0.1 (Tl.0g硝酸銀和0.3mL、質(zhì)量分數(shù)為25%%氨水，攪拌，將其轉入不銹鋼反應釜中，在烘箱中分別于160°〇和200 °C反應20 h，冷卻至室溫，收集產(chǎn)物，并將產(chǎn)物用乙醇離心洗滌3次，所得產(chǎn)物于70°C下干燥，研磨，再于40(TC煅燒5 h，制得銀-二氧化鈰樣品；
(2)銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制備
將銀-二氧化鈰樣品40 mg分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，加入I mL,50y g/mL的糖類抗原二抗Ab2和300 μ L、質(zhì)量分數(shù)為0.5 %的BSA，震蕩12 h后離心洗滌，將得到的銀-二氧化鈰-糖類抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，制得銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液，儲存于4 °C下備用。
[0020]實施例5銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)銀-二氧化鈰的制備
將1.5 g聚乙烯吡咯烷酮在30 mL的甲醇中溶解，加入1.0 g 二氧化鈰，0.5g硝酸銀和
0.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為26%氨水，攪拌，將其轉入不銹鋼反應釜中，在烘箱中分別于160 °〇和200 °C反應25 h，冷卻至室溫，收集產(chǎn)物，并將產(chǎn)物用乙醇離心洗滌3次，所得產(chǎn)物于80°C下干燥，研磨，再于450°C煅燒5 h，制得銀-二氧化鈰樣品；
(2)銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2二抗孵化物溶液的制備
將銀-二氧化鈰樣品70 mg分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，加入I mLUOO μ g/mL的糖類抗原二抗AbJP 500 μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.0 °/c^^BSA，震蕩12 h后離心洗滌，將得到的銀-二氧化鈰-糖類抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，制得銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液，儲存于4 °C下備用。
[0021]實施例6銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)銀-二氧化鈰的制備
將0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在40 mL的甲醇中溶解，加入2.0 g 二氧化鈰，1.0g硝酸銀和0.8 mL、質(zhì)量分數(shù)為28%氨水，攪拌，將其轉入不銹鋼反應釜中，在烘箱中分別于160 V和200 °C反應30 h，冷卻至室溫，收集產(chǎn)物，并將產(chǎn)物用乙醇離心洗滌3次，所得產(chǎn)物于90°C下干燥，研磨，再于50(TC煅燒5 h，制得銀-二氧化鈰樣品；
(2)銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2二抗孵化物溶液的制備
將銀-二氧化鈰樣品100 mg分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，加入I mL、150 μ g/mL的糖類抗原二抗AbJP 700 μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.5 °/c^^BSA，震蕩12 h后離心洗滌，將得到的銀-二氧化鈰-糖類抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，制得銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液，儲存于4 °C下備用。
[0022]實施例7卵巢癌相關抗原CA 125的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、30mmol.L—1、pH6.5的PBS緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法法對糖類抗原CA125標準溶液進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4V,取樣間隔設置為0.1秒,運行時間設置為400秒；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL pH=6.5的PBS中注入10 μ L、5 mo I *L_1的質(zhì)量分數(shù)為30%雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線； (4)將待測樣品溶液代替糖類抗原抗原⑶125標準溶液進行檢測。測得線性范圍為0.42呢/此?20叩/爪[，檢測限為0.0921^/1111。
[0023]實施例8胰腺、膽道癌相關抗原0119-9的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 1111,70 11111101噸—\邱7.5的？83緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法法對糖類抗原0119-9的標準溶液進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4V，取樣間隔設置為0.1秒，運行時間設置為400秒；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔508向10 邱=7.5的？83中注入10 ^1,1011101 - 171的質(zhì)量分數(shù)為30%雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4)將待測樣品溶液代替糖類抗原0119-9的標準溶液進行檢測。測得線性范圍為0.25呢/此?20叩/此，檢測限為0.054呢/爪乙。
[0024]實施例9乳腺癌相關抗原…15-3的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 1111,50 11111101噸—\邱7.0的？83緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法法對糖類抗原…15-3的標準溶液進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4 V，取樣間隔設置為0.1秒，運行時間設置為400秒；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔508向10 1111邱=7.0的？83中注入10 111,8 11101.171的質(zhì)量分數(shù)為30%雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4)將待測樣品溶液代替糖類抗原抗原…15-3的標準溶液進行檢測。測得線性范圍為0.30呢/此?20叩/爪[，檢測限為0.064時/爪匕
[0025]實施例10胃癌相關抗原0172-4，01242的檢測
按照實施例7、的方法對胃癌相關抗原0172-4，01242的進行檢測，測得線性范圍為
0.52呢/此?20叩/爪[，檢測限為0.14^^/11110
【權利要求】
1.一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)玻碳電極依次用1.0、0.3、0.05 Mm的A1203粉末磨平并拋光后，超聲清洗，在電極表面滴加6yL、f4 mg/mL的四亞甲基五胺功能化石墨烯水溶液，干燥； (2)加入3μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.(Γ3.0%戊二醛溶液，干燥，滴加6 PL、質(zhì)量分數(shù)為5?10U g/mL的糖類抗原一抗Abi，保持濕潤lh ； (2)用pH6.Γ8.4 PBS緩沖溶液洗去未連接上的糖類抗原一抗Ah，并用3 μ L、質(zhì)量分數(shù)為1.(Γ3.0%的BSA封閉非特異性活性位點，加入6μ L、0.00Γ20 ng/mL的一系列不同濃度的糖類抗原標準溶液，濕潤條件下孵育lh ； (3)將6μ L銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液滴在電極表面，保持濕潤0.5^1.5h，用pH 6.4^8.4 PBS緩沖溶液洗去未連接上的銀-二氧化鈰_Ab2，免疫傳感器制作完成。
2.如權利要求1所述的一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，所述銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制備，其特征在于，包括以下步驟: (1)銀-二氧化鈰的制備 將0.Γ0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在1(T40 mL的甲醇中溶解，加入0.5^2.0 g 二氧化鈰，0.l(Tl.0g硝酸銀和0.3^0.8 mL、質(zhì)量分數(shù)為25°/Γ28%氨水，攪拌，將其轉入不銹鋼反應釜中，在烘箱中分別于160 1:和200 °C反應2(T30 h，冷卻至室溫，收集產(chǎn)物，并將產(chǎn)物用乙醇離心洗滌3次，所得產(chǎn)物于70 V°C下干燥，研磨，再于40(T5(KrC煅燒5 h，制得銀-二氧化鈰樣品； (2)銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2二抗孵化物溶液的制備 將銀-二氧化鈰樣品40?100 mg分散于1 mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，加入1 mL、50?150 μ g/mL的糖類抗原二抗Ab2和300?700 μ L、質(zhì)量分數(shù)為0.5?1.5 °/c^^BSA，震蕩12 h后離心洗滌，將得到的銀-二氧化鈰-糖類抗原二抗Ab2重新分散于1 mL pH 7.4 PBS緩沖溶液中，制得銀-二氧化鈰-糖類抗原Ab2 二抗孵化物溶液，儲存于4 °C下備用。
3.如權利要求1所述的制備方法制備的一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器，其特征在于，用于腫瘤標志物糖類抗原的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、3(T70 mmol.Γ\ρΗ6.5?7.5的PBS緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法法對糖類抗原標準溶液進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4 V，取樣間隔設置為0.1秒，運行時間設置為400秒； (3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL pH=6.5?7.5的PBS中注入10 μ L、5^10 mol.Γ1的質(zhì)量分數(shù)為30%雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線； (4)將待測樣品溶液代替糖類抗原抗原標準溶液進行檢測。
4.如權利要求Γ3所述的一種基于銀-二氧化鈰的糖類抗原傳感器制備方法，其特征在于，所述糖類抗原選自下列之一:CA 125、CA15 - 3、CA 549,CA 27 - 29、CA19 - 9、CA19_5、CA50、CA 72-4.CA 72_4、CA 242。
【文檔編號】G01N27/327GK104297315SQ201410481241
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月20日 優(yōu)先權日:2014年9月20日
【發(fā)明者】魏琴, 張瀟月, 閆濤, 杜斌, 馬洪敏, 魏東, 吳丹, 張勇 申請人:濟南大學