采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法,可有效鑒別真假蘋果汁,保證蘋果汁產(chǎn)品質(zhì)量的安全,方法是,將不同產(chǎn)地的蘋果分別制成蘋果汁樣品液;對制備的蘋。果汁樣品液植物糖進(jìn)行分析,確立植物糖測定條々件,對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析,確立植物糖測定。條件;對天然蘋果汁進(jìn)行分析建立蘋果汁中植物...:糖S13C比值與蘋果酸的線性關(guān)系,作出蘋果汁真假判定:蘋果汁蔗糖613Csuc-19.09%。至-26.47%之間,葡萄糖S13Cglu-24.52%。至-30.50%。之間,果糖S13Cfru-在25.22%。至31.96%。之間,植物糖間比值S1在0.27至2.78之間,蘋果酸S13Cmal在-25.31%。至32.57%。之間,線性相關(guān)性系數(shù)R2>0.7255為真,本發(fā)明方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,有效保證了蘋果汁的質(zhì)量,防止摻假蘋果汁;對消費(fèi)者造成的傷害,經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。)
【專利說明】采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及果汁,特別是一種采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果汁由于其營養(yǎng)價值高,易于吸收利用,為消費(fèi)者所喜愛的飲料。隨著人們對 天然果汁需求量越來越大,各種各樣的天然或經(jīng)加工的果汁應(yīng)運(yùn)而生。我國蘋果汁資源豐 富、種類繁多,在國民生產(chǎn)總值中占據(jù)重要的地位,也是出口的重要產(chǎn)品。為確保蘋果汁質(zhì) 量和產(chǎn)品順利出口,首先要提高蘋果汁產(chǎn)品質(zhì)量,完善我國對蘋果汁質(zhì)量檢測,從加工源 頭把握好蘋果汁質(zhì)量關(guān)。目前市售蘋果汁品種及其包裝種類多,如100%果汁、濃縮果汁、 含果肉果汁、果汁飲料等,各種各樣的商品名稱讓消費(fèi)者眼花繚亂,頗為疑惑。國家標(biāo)準(zhǔn) GB10789-2007《飲料通則》中,將飲料分為碳酸飲料類、果蔬菜汁類、蛋白飲料類、包裝飲用 水類、茶飲料類、咖啡飲料類、植物飲料類、風(fēng)味飲料類、特殊用途飲料類、固體飲料類、其他 飲料等11類。純果汁是將新鮮水果加工制成非復(fù)原(NFC)果汁,復(fù)原(FC)果汁是在濃縮 果汁中加入等量水分制成,其色澤、風(fēng)味、理化指標(biāo)與原水果相同,濃縮果汁可延長貯藏期, 便于運(yùn)輸。天然蘋果汁與濃縮蘋果汁類產(chǎn)品禁止添加任何添加劑,天然蘋果汁中添加任何 外來物質(zhì)都屬于摻假。由于果汁的巨大市場誘惑力,一些不法廠商造假以牟取暴利,在果汁 含量、標(biāo)簽上作假,使消費(fèi)者利益和身體健康受到威脅。隨著時代的發(fā)展,現(xiàn)代摻假水平越 來越高,果汁摻假手段主要有6種方式:(1)添加水稀釋純果汁含量;(2)添加外源性特征 成份,包括天然和人工合成的甜味劑(蔗糖、各種糖漿、人工合成甜味劑等)、酸味劑(檸檬 酸、蘋果酸等)、香精香料、增稠劑等;(3)添加化學(xué)成份,如色素、防腐劑等;(4)添加其它果 汁或者果渣提取液;(5)以濃縮還原汁代替非濃縮還原汁;(6)原產(chǎn)地冒充。這些摻假手段 均以模仿真實蘋果汁體系中特征組分特性為目標(biāo),但摻假果汁的營養(yǎng)價值低,損壞消費(fèi)者 的利益和健康。
[0003] 自上世紀(jì)70年代以來,國際食品法典、歐盟、美國、中國等食品機(jī)構(gòu)均制定果汁相 關(guān)法規(guī),嚴(yán)格控制果汁摻假。我國GB10789-2007準(zhǔn)確規(guī)定果汁與濃縮果汁中可溶性固性 物、果汁含量。隨著商品化摻假果汁技術(shù)的不斷提高,相關(guān)的真?zhèn)舞b定方法也在不斷更新完 善,研究人員在不遺余力地研發(fā)準(zhǔn)確、可靠的檢測方法對其進(jìn)行鑒別,但目前國內(nèi)外還未發(fā) 布一種有效鑒別蘋果汁真?zhèn)蔚姆椒?,對蘋果汁真實天然成份的檢測已成為政府監(jiān)督部門和 研究人員面臨的嚴(yán)峻問題。因此,對蘋果汁進(jìn)行測定,建立有效蘋果汁真?zhèn)闻卸ǖ姆椒?,?成為保證蘋果汁質(zhì)量安全的重要技術(shù)措施。
[0004] 針對果汁的各種摻假手段,國內(nèi)外已有很多相關(guān)報道,主要采用旋光、近紅外光 譜、氣/液相色譜、核磁共振、穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜等技術(shù)分析其中理化參數(shù)、微生物成份、 特征有機(jī)組份、天然同位素比、違禁添加劑。
[0005] 穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析法是鑒別果汁真?zhèn)螐?qiáng)有力的檢測手段,在果汁真?zhèn)闻c原 產(chǎn)地鑒別中廣泛應(yīng)用。由于植物的遺傳特性不同,C3代謝植物與C4代謝植物的同位素比 率有較大的差異,蘋果汁屬C3植物,而用于摻假的原料如甘蔗糖、高果玉米糖漿等主要來 源于C4植物。蘋果汁中摻入甘蔗糖或高果玉米糖漿后,果汁總糖中δ 13C會出現(xiàn)升高現(xiàn)象。 由于植物的不同光合作用途徑及其碳穩(wěn)定同位素的生物歧視效應(yīng),因此,利用來源不同的 碳水化合物碳同位素比值的差異,以同位素質(zhì)譜儀測定其碳同位素比值,就能鑒定出用化 學(xué)法難以辨別的物質(zhì)。糖份與有機(jī)酸是果汁中主要的風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì),它的含量高低與果汁 品質(zhì)有極密切的關(guān)系。目前測定糖份有機(jī)酸含量的方法有常規(guī)化學(xué)滴定法、氣相色譜法、離 子色譜法等,因此根據(jù)天然蘋果汁中不同成份中同位素數(shù)值,對于鑒定蘋果汁真?zhèn)尉哂兄?要的意義。但至今未見有采用液相采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法 的公開報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 針對上述情況,為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷,本發(fā)明之目的就是提供一種采用液相色 譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法,可有效鑒別真假蘋果汁,保證蘋果汁產(chǎn)品質(zhì) 量的安全。
[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是,該方法包括以下步驟:
[0008] 1、果汁制備
[0009] 將不同產(chǎn)地的蘋果分別制成蘋果汁樣品液;
[0010] 2、對制備的蘋果汁樣品液植物糖進(jìn)行分析,確立植物糖測定條件,方法是:
[0011] A、對蘋果汁預(yù)處理,將蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容50mL,再取200 μ L加 水稀釋至lmL,過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定,每隔10個測試樣品至少測定一次質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)量控制;
[0012] B、建立液相色譜-同位素質(zhì)譜(LC-IRMS)測定條件,其測定條件為:氬氣峰40中 心杯小于84mV,氧的32峰達(dá)lOOOOmV,C0 2信號峰在1000-2000mV之間;
[0013] C、對液相色譜-同位素質(zhì)譜進(jìn)行穩(wěn)定性測試:使其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0. 3%,并對C02 參考?xì)猞?13C值進(jìn)行標(biāo)定;
[0014] D、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ 13C值,用于分 析結(jié)果質(zhì)控;
[0015] 3、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析,確立植物糖測定條件;
[0016] 4、對天然蘋果汁進(jìn)行分析建立蘋果汁中植物糖δ 13C比值與蘋果酸的線性 關(guān)系,作出蘋果汁真假判定:蘋果汁蔗糖S13Csue-19. 09 %。至-26. 47%。之間,葡萄糖 δ 13Cglu-24. 52%。至-30. 50%。之間,果糖 δ 13Cfra-在 25. 22%。至 31. 96%。之間,植物糖間比值 δ 1在0. 27至2. 78之間,蘋果酸δ 13Cmal在-25. 31%。至32. 57%。之間,線性相關(guān)性系數(shù)R2 > 0. 7255為真,否則為假,從而實現(xiàn)對蘋果汁真假的測定、鑒別。
[0017] 本發(fā)明首創(chuàng)利用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁,在經(jīng)科學(xué)研究、試 驗和對實踐總結(jié),根據(jù)國內(nèi)外蘋果主產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸s 13c 同位素值的分布范圍,及摻假蘋果汁中的果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸s 13c同位素比值變化 范圍,作為蘋果汁基礎(chǔ)數(shù)據(jù)應(yīng)用于果汁摻假鑒別,本發(fā)明采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定 蘋果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸中S 13c值的分析方法、色譜分離和質(zhì)譜條件等參數(shù), 創(chuàng)立了蘋果汁中植物糖S 13c比值與蘋果酸的線性相關(guān)性,可以根據(jù)其是否顯著差異判斷 蘋果汁的摻假;并經(jīng)國際原子能機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控比對,證明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度 高,有效保證了蘋果汁的質(zhì)量,防止摻假蘋果汁對消費(fèi)者造成的傷害,經(jīng)濟(jì)和社會效益巨 大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1為不同產(chǎn)地蘋果汁中蔗糖碳同位素分布圖。
[0019] 圖2為不同產(chǎn)地蘋果汁中果糖碳同位素分布圖。
[0020] 圖3為不同產(chǎn)地蘋果中葡萄糖同位素碳分布圖。
[0021] 圖4為不同產(chǎn)地蘋果中植物糖碳同位素比值分布圖。
[0022] 圖5為不同產(chǎn)地蘋果中蘋果酸碳同位素比值分布圖。
[0023] 圖6為蘋果中蘋果酸與碳同位素比值間的線性關(guān)系。
【具體實施方式】
[0024] 以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0025] 本發(fā)明在具體實施時,是由以下步驟實現(xiàn):
[0026] 1、果汁制備
[0027] 制備天然蘋果汁:將不同產(chǎn)地的234種蘋果各取1-1. 5kg,分別置于榨汁機(jī)內(nèi)榨 汁、離心,收集上清液,制成234種樣品液,-18°C冷凍保存,防止氧化、變質(zhì);
[0028] 2、對制備的蘋果汁中植物糖進(jìn)行分析,確立植物糖測定條件,所述的植物糖包括 果糖、葡萄糖和蔗糖,方法是:
[0029] A、對蘋果汁預(yù)處理,將制備的234種天然蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容 50mL,再取200 μ L加水稀釋至lmL,過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定,每個樣品進(jìn)行 10個二氧化碳(C02)循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性,每隔10個測試樣品至少測定1次混合標(biāo)準(zhǔn)工作 溶液進(jìn)行質(zhì)量控制;
[0030] B、確立液相色譜-同位素質(zhì)譜(LC-IRMS)分析條件:其條件是,色譜柱:Zobax Ca NP5 300mmX 7. 8mm(i. d.),粒度 9 μ m ;柱溫:75°C ;流動相:超純水;流速:0· 35mL/min ;氧 化反應(yīng)爐溫度:99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速:0. 05mL/min ;磷酸酸化劑流速:0. 05mL/ min的條件下進(jìn)行測定;
[0031] C、LC-IRMS測定前的4個要求:首先保證不漏氣,對LC-IRMS系統(tǒng)進(jìn)行檢漏,氬 氣峰40中心杯小于84mV ;然后要使其有足夠的氧化性,對氧化能力檢驗,使氧32峰達(dá) lOOOOmV,;再者要防止有機(jī)碳對LC-IRMS的污染,使C0 2信號峰在1000-2000mV之間,該信 號值越低越好;最后要保證LC-IRMS儀器的穩(wěn)定性,測定10個C0 2循環(huán),使其測定值標(biāo)準(zhǔn)偏 差小于0. 3% ;
[0032] D、LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定:方法是,將國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗 糖質(zhì)控(IAEA-CH-6)給定的δ 13C值-10. 49%。輸入計算機(jī),標(biāo)定C02氣體值,10個平行測定 結(jié)果值平均,作為C02參考?xì)獾摩?13C值;每次開關(guān)機(jī)前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次 進(jìn)行質(zhì)量控制,確保測得的S13C值與證書標(biāo)明數(shù)值相差±0.30%。內(nèi);
[0033] E、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,方法是,分別稱取100mg 果糖、葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品,用水定容至lOOmL,該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為lmg/mL ;然后配 制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,方法是,吸取0. 5mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,0. 2mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備 溶液用水稀釋并定容至10mL,配制成果糖、葡萄糖質(zhì)量濃度為50 μ g/mL、蔗糖濃質(zhì)量度為 20 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定,將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按B步驟 中規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定,將10個平行測定結(jié)果值平均,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、 蔗糖的S 13C值,用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制;
[0034] 3、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析,確立蘋果酸測定條件,方法是:
[0035] A、對蘋果汁進(jìn)行預(yù)處理:將步驟1制備的234種天然蘋果汁各取20g分別加水稀 釋至100mL,過濾,每種取lmL過濾液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)制備蘋果酸,制備樣液進(jìn)行 LC-IRMS分析,每個樣品運(yùn)行時進(jìn)行10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性,每隔10個測試樣 品至少測定一次質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì)量控制;
[0036] B、確立HPLC制備蘋果汁中蘋果酸條件:其條件是,色譜柱:Zobax Ca NP5 300mmX7. 8mm(i. d.),粒度 9μπι ;柱溫:75°C ;進(jìn)樣量:100μ L ;流動相:水;流速:0· 35mL/ min ;饋分收集時間:10. Omin-14. Omin ;
[0037] C、確立LC-IRMS分析條件:其條件是,色譜柱:ICS印Coregel_87H3氫型柱, 300_X 7. 8_(i. d.),粒度 5. 0 μ m ;柱溫:80°C ;流動相:8mmol/L 硫酸溶液;流速:0· 35mL/ min ;氧化反應(yīng)爐溫度:99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速:0. 045mL/min ;磷酸酸化劑流速: 0. 045mL/min ;
[0038] D、LC-IRMS測定前的4個要求:同步驟⑵中的C ;
[0039] E、LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定:同步驟(2)中的D ;
[0040] F、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,方法是,稱取100mg蘋果 酸標(biāo)準(zhǔn)品,用水定容至l〇〇mL,該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為lmg/mL ;然后配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液,方法是,吸取〇. 4mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋并定容至10mL,配制成質(zhì)量濃度為 40 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定,將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按3C步驟中 規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定,將10個平行測定結(jié)果值平均,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗 糖的S 13C值,用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制;
[0041] 4、根據(jù)對天然蘋果汁的分析結(jié)果,建立作出蘋果汁真假判定:方法是,滿足以下 四個條件:一、蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C測定值在范圍之間,蔗糖S13Csuc;-19.09%。 至-26.47%。之間,葡萄糖3 13(:8111-24.52%。至-30.50%。之間,果糖313(: &11-在 25.22%。至 31. 96%。之間,植物糖間比值δ 1在〇. 27至2. 78之間,蘋果酸δ 13〇^在-25. 31%。至32. 57%〇 之間;二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值在0.27-2. 78之間;三、蘋果汁中 蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C最大差值在-10. 48%。至-1. 7%。之間;四、蘋果汁的葡萄 糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值與蘋果酸δ 13C值具有線性相關(guān)性,符合線性方程 Y = -2. 8186X-24. 262,相關(guān)系數(shù)大于0. 7255,滿足以上四個條件為真,否則為假,從而實現(xiàn) 對蘋果汁真假的測定、鑒別。
[0042] 為了保證使用效果,所述的國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液IAEA-CH-6, 每次使用前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次,確保測得的δ 13C值與標(biāo)準(zhǔn)溶液證書標(biāo)明的 數(shù)值相差±0.30%。內(nèi);所述的液相色譜-同位素質(zhì)譜儀為DELTA V Plus液相色譜-同位素 質(zhì)譜儀,配備Surveyor液相色譜與Isolink接口(美國Thermofisher公司);1200高效液相 色譜儀(美國Agilent公司)5810型離心機(jī)(日本日立公司);飛利浦榨汁機(jī)HR1861/30 (廣 州飛利浦公司)0. 22 μ m水相一次性微孔濾膜(美國Agilent公司);色譜柱:有機(jī)酸分析 液相色譜柱ICS印Coregel-87H3(氫型)7·8X300mm,9μm(美國TRANSGEN0MIC公司);糖 度計IAEA-CH-6, Sucrose標(biāo)示值:δ 13C-10. 449%。VPDB(均購自于國際原子能機(jī)構(gòu));水為 Millipore純水器制得超純水,使用前抽空超聲(美國Millipore公司)。
[0043] 本發(fā)明方法先進(jìn),首創(chuàng)性的將液相色譜-同位素質(zhì)譜技術(shù)用在蘋果汁真假的鑒 另IJ,開創(chuàng)了蘋果汁真假鑒別的新方法,與現(xiàn)有技術(shù)相比:
[0044] 1、創(chuàng)建了國內(nèi)外蘋果主產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地水果中植物糖、有機(jī)酸、總碳、總氮、總氧同 位素值的分布范圍,作為果汁基礎(chǔ)數(shù)據(jù)應(yīng)用于果汁摻假鑒別。
[0045] 2、本發(fā)明采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定蘋果汁果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸中 s13c值的分析方法,優(yōu)化了最佳提取條件、有機(jī)酸凈化制備方法、色譜分離和質(zhì)譜條件等參 數(shù),對于蘋果汁研究了植物糖S 13c比值與蘋果酸的線性相關(guān)性。
[0046] 2、本發(fā)明建立了鑒別真假果汁的方法,經(jīng)國際原子能機(jī)構(gòu)與國家標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控比對, 證明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,是 申請人:經(jīng)科學(xué)研究、試驗和對實踐總結(jié)作出的創(chuàng)造 性勞動結(jié)晶,有關(guān)資料如下:
[0047] 1.儀器和試劑
[0048] DELTA V Plus液相色譜-同位素質(zhì)譜儀,配備Surveyor液相色譜與Isolink接 口(美國Thermofisher公司);1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)5810型離心 機(jī)(日本日立公司);飛利浦榨汁機(jī)HR1861/30(廣州飛利浦公司)0.22μπι水相一次性微 孔濾膜(美國Agilent公司)。色譜柱:有機(jī)酸分析液相色譜柱ICSep Coregel-87H3 (氫 型)7.8*300mm,9ym(美國TRANSGEN0MIC公司);強(qiáng)陽離子鈣型交換色譜柱Zobax Ca NP5 7. 8*300mm I丐型,9 μ m(美國Agilent公司)。糖度計
[0049] IAEA-CH-6, Sucrose 標(biāo)示值:δ 13C_10. 449%。VPDB(均購自于國際原子能機(jī)構(gòu)); 過二硫酸鈉,Na2S204 ( > 99 % );高純磷酸,H3P04 ( > 99 % );二水鎢酸鈉,Na2W04 · 2H20 ; 濃硫酸,H2S04 ;1. 12mol/L過二硫酸鈉溶液:稱取20g(精確到0. 01g)過二硫酸鈉用水定 容至250mL ;0. 33mol/L磷酸溶液:量取15mL高純磷酸,用水定容至250mL ;8mmol/L硫酸溶 液:取29. 6mL濃硫酸,用水稀釋至1000mL ;D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品購 自美國Sigma公司、德國Dr. Ehrenstorfer公司;水為Millipore純水器制得超純水,使用 前抽空超聲(美國Millipore公司)。
[0050] 2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0051] 蔗糖同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取10. 〇mg IAEA-CH-6 (精確到0. Olmg)同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 用水定容至100mL,于0°C -4°C保存可使用一周。20 μ g/mL同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取 0. 2mL同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水稀釋并定容至lmL,配制成20 μ g/mL的同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液,該溶 液使用前配制。
[0052] D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取100mg(精確到0. Olmg)標(biāo)準(zhǔn)品, 用水定容至100mL,于0°C _4°C保存可使用一周,該溶液濃度為lmg/mL。3種植物糖混合標(biāo) 準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確吸取〇. 5mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,0. 2mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用水稀釋并 定容至lOmL,配制成果糖、葡萄糖濃度為50 μ g/mL、鹿糖濃度為20 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 該溶液使用前配制。
[0053] 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取100mg(精確到0. Olmg)標(biāo)準(zhǔn)品,用水定容至100mL, 于0°C -4°c保存可使用一周,該溶液濃度為lmg/mL。40 μ g/mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確吸取 0. 4mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋并定容至lOmL,配制成40 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,該 溶液使用前配制。
[0054] 3蘋果汁制備
[0055] 蘋果洗凈晾干,放入榨汁機(jī)內(nèi)榨汁,收集果汁。取一定量果汁于離心管中在離心機(jī) 上4000r/min離心5min,收集上清液于具塞塑料離心管,-18°C冷凍保存。
[0056] 市售果汁:將果汁混勻后于離心管中,在離心機(jī)上4000r/min離心5min,收集上清 液于具塞塑料離心管,-18 °C冷凍保存。
[0057] 摻假植物糖果汁的制作:取自榨蘋果汁100mL適量加入果糖、蔗糖、葡萄糖制得。
[0058] 摻假有機(jī)酸果汁的制作:取自榨蘋果汁100mL分別適量加入蘋果酸制得。
[0059] 4植物糖分析
[0060] 4. 1前處理
[0061] 稱取均勻蘋果汁(試樣)〇.3g(精確到O.OOlg)于50mL容量瓶中,用水定容。用 移液器移取上述水溶液200 μ L于進(jìn)樣瓶中,用水稀釋至lmL,過0. 22 μ m微孔濾膜后,用液 相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定。
[0062] 4. 2儀器條件
[0063] 4. 2. 1同位素質(zhì)譜儀的預(yù)調(diào)
[0064] 操作前確認(rèn)檢測環(huán)境、氣密性和真空度達(dá)到要求,然后檢驗儀器的穩(wěn)定性和線性 是否符合要求,必要時調(diào)整離子源參數(shù)。
[0065] 4. 2. 2系統(tǒng)檢漏
[0066] 在氬氣分析模式下,檢驗峰40中心杯小于84mV說明不漏氣。
[0067] 4. 2. 3氧化能力檢驗
[0068] 進(jìn)行液相色譜-同位素質(zhì)譜測定前,調(diào)整氧化劑和酸化劑流速,確保體系的氧化 能力達(dá)到要求。切換兩相Oxid/acid混合泵至檢測器,在02分析模式下操作,等量調(diào)整 Oxid/acid泵流速,使0 2的32峰達(dá)10, 000-15, OOOrnV,使其有足夠的氧化性。
[0069] 4. 2. 4評價系統(tǒng)中有機(jī)碳的污染
[0070] 切換至C02分析模式,找開樣品spilt開關(guān),使C02信號峰在1000-2000mV之間,該 信號越低越好,如超過2000mV,說明系統(tǒng)中有機(jī)污染物超標(biāo),主要是流動相中水受有機(jī)碳污 染。
[0071] 4. 2. 5LC-IRMS 穩(wěn)定性測試
[0072] 設(shè)定10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性,使其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0. 3 %。
[0073] 4. 2. 6植物糖分析液相色譜-同位素質(zhì)譜條件
[0074] a)色譜柱:Zobax Ca NP5 300mmX 7. 8mm(i. d.),粒度 9 μ m ;
[0075] b)柱溫:75°C ;
[0076] c)流動相:超純水;
[0077] d)流速:0· 35mL/min ;
[0078] e)進(jìn)樣量:10yL;
[0079] f)氧化反應(yīng)爐溫度:99. 9 °C ;
[0080] g)氧化反應(yīng)參考條件參見;
[0081] 1)氧化劑:過二硫酸鈉溶液
[0082] 2)氧化劑流速:0· 05mL/min
[0083] 3)酸化劑:磷酸溶液
[0084] 4)酸化劑流速:0· 05mL/min
[0085] h)載氣:氦氣,純度99. 999% ;
[0086] i)參考?xì)猓憾趸?,純?9. 999%。
[0087] 4. 2. 7對蘋果汁進(jìn)行測定
[0088] a)C02參考?xì)猞?3(:值的測定
[0089] 在Conflo模式(即由萬用接口同時把載氣流量范圍不同的多個樣品前處理裝置 接到同一臺同位素比質(zhì)譜儀上)下將國際原子能機(jī)構(gòu)IAEA-CH-6給定的DELTA值輸入,標(biāo) 定C0 2氣體值,10個平行測定結(jié)果值平均,測得C02參考?xì)獾摩?13C值-19. 37%。。b)質(zhì)控蘋 果汁標(biāo)品S13C值的測定
[0090] 將果糖配制成濃度為50 μ g/mL、葡萄糖濃度為50 μ g/mL、鹿糖濃度為20 μ g/mL的 單個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在液相色譜-同位素質(zhì)譜儀條件下進(jìn)行測定,將10個平行測定結(jié)果值 平均,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗糖的s 13c值,用于分析結(jié)果質(zhì)控。
[0091] 質(zhì)控標(biāo)品測定值
[0092]
【權(quán)利要求】
1. 一種采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法,其特征在于,包括以 下步驟: (1 )、果汁制備 制備天然蘋果汁:將不同產(chǎn)地的234種蘋果各取1-1. 5kg,分別置于榨汁機(jī)內(nèi)榨汁、離 心,收集上清液,制成234種樣品液,-18°C冷凍保存,防止氧化、變質(zhì); (2) 、對制備的蘋果汁中植物糖進(jìn)行分析,確立植物糖測定條件,所述的植物糖包括果 糖、葡萄糖和蔗糖,方法是: A、 對蘋果汁預(yù)處理,將制備的234種天然蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容50 mL, 再取200 μ L加水稀釋至lmL,過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定,每個樣品進(jìn)行10個 二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性,每隔10個測試樣品至少測定1次混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì) 量控制; B、 確立LC-IRMS分析條件:其條件是,色譜柱:Zobax Ca NP5 300 _ X7.8 ), 粒度9 μ m ;柱溫:75。。;流動相:超純水;流速:0· 35 mL/min ;氧化反應(yīng)爐溫度:99. 9。。; 過二硫酸鈉氧化劑流速:〇. 05 mL/min ;磷酸酸化劑流速:0. 05 mL/min的條件下進(jìn)行測定; C、 LC-IRMS測定前的4個要求:首先保證不漏氣,對LC-IRMS系統(tǒng)進(jìn)行檢漏,氬氣峰40 中心杯小于84mV ;然后要使其有足夠的氧化性,對氧化能力檢驗,使氧32峰達(dá)lOOOOmV,; 再者要防止有機(jī)碳對LC-IRMS的污染,使C0 2信號峰在1000-2000 mV之間,該信號值越低 越好;最后要保證LC-IRMS儀器的穩(wěn)定性,測定10個C02循環(huán),使其測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 0. 3% ; D、 LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定:方法是,將國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì) 控(IAEA-CH-6)給定的δ 13C值-10. 49%。輸入計算機(jī),標(biāo)定C02氣體值,10個平行測定結(jié)果 值平均,作為C02參考?xì)獾摩?13C值;每次開關(guān)機(jī)前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次進(jìn)行 質(zhì)量控制,確保測得的S13C值與證書標(biāo)明數(shù)值相差±0.30 %。內(nèi); E、 對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,方法是,分別稱取100 mg果糖、 葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品,用水定容至100 mL,該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為1 mg/ mL;然后配制 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,方法是,吸取〇. 5 mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,0. 2 mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備 溶液用水稀釋并定容至10 mL,配制成果糖、葡萄糖質(zhì)量濃度為5(^g/ mL、蔗糖濃質(zhì)量度為 2(^g/ mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定,將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按B步驟 中規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定,將10個平行測定結(jié)果值平均,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、 蔗糖的S 13C值,用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制; (3) 、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析,確立蘋果酸測定條件,方法是: A、 對蘋果汁進(jìn)行預(yù)處理:將步驟1制備的234種天然蘋果汁各取20g分別加水稀釋至 100mL,過濾,每種取lmL過濾液進(jìn)行高效液相色譜制備蘋果酸,制備樣液進(jìn)行LC-IRMS分 析,每個樣品運(yùn)行時進(jìn)行10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性,每隔10個測試樣品至少測定 一次質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì)量控制; B、 確立HPLC制備蘋果汁中蘋果酸條件:其條件是,色譜柱:Zobax Ca NP5 300 mmX7.8 mm(i.d·),粒度 9μηι;柱溫:75°C;進(jìn)樣量:100 KL;流動相:水;流速:0.35 mL/ min ;饋分收集時間:10. Omin-14. Omin ; C、 確立LC-IRMS分析條件:其條件是,色譜柱:ICS印Coregel-87H3氫型柱,300mm 父7.8 111111([(1.),粒度5.0|^;柱溫:801:;流動相 :8臟〇1/1硫酸溶液;流速:0.3511117 min ;氧化反應(yīng)爐溫度:99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速:0. 045mL/min ;磷酸酸化劑流速: 0. 045mL/min ; D、 LC-IRMS測定前的4個要求:同步驟(2)中的C ; E、 LC-IRMS所用C02參氣體S13C值的標(biāo)定:同步驟(2)中的D ; F、 對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,方法是,稱取100 mg蘋果酸 標(biāo)準(zhǔn)品,用水定容至100 mL,該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為1 mg/ mL;然后配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液,方法是,吸取0.4 mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為 4(^g/ mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;最后是質(zhì)控標(biāo)品S13C值的測定,將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按3C步驟中 規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定,將10個平行測定結(jié)果值平均,得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗 糖的S 13C值,用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制; (4)、根據(jù)對天然蘋果汁的分析結(jié)果,建立作出蘋果汁真假判定:方法是,滿足以下四 個條件:一、蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S13C測定值在范圍之間,蔗糖S13Csuc;-19.09%。 至-26.47%。之間,葡萄糖3 13(:8111-24.52%。至-30.50%。之間,果糖313(: &11-在 25.22%。至 31. 96%。之間,植物糖間比值δ 1在〇. 27至2. 78之間,蘋果酸δ 13〇^在-25. 31%。至32. 57%〇 之間;二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值在0.27-2. 78之間;三、蘋果汁中 蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C最大差值在-10. 48%。至-1. 7%。之間;四、蘋果汁的葡萄 糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值與蘋果酸δ 13C值具有線性相關(guān)性,符合線性方程 Y=-2. 8186X-24. 262,相關(guān)系數(shù)大于0. 7255,滿足以上四個條件為真,否則為假,從而實現(xiàn)對 蘋果汁真假的測定、鑒別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法, 其特征在于,所述的國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液IAEA-CH-6,每次使用前應(yīng)將 IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次,確保測得的δ 13C值與標(biāo)準(zhǔn)溶液證書標(biāo)明的數(shù)值相差±0. 30 %〇內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法,其 特征在于,所述的液相色譜-同位素質(zhì)譜儀為DELTA V Plus液相色譜-同位素質(zhì)譜儀,配 備Surveyor液相色譜與Isolink接口;1200高效液相色譜儀、5810型離心機(jī);飛利浦榨汁 機(jī) HR1861/30、0. 22 μ m 水相一次性微孔濾膜;Sucrose 標(biāo)示值:δ 13C-10. 449%。VPDB。
【文檔編號】G01N30/88GK104215731SQ201410477581
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】祝偉霞, 楊冀州, 袁萍, 劉亞風(fēng), 劉勝男, 魏蔚, 楊娜 申請人:祝偉霞