采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法，可有效鑒別真假蘋果汁，保證蘋果汁產(chǎn)品質(zhì)量的安全，方法是，將不同產(chǎn)地的蘋果分別制成蘋果汁樣品液；對制備的蘋。果汁樣品液植物糖進(jìn)行分析，確立植物糖測定條々件，對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析，確立植物糖測定。條件；對天然蘋果汁進(jìn)行分析建立蘋果汁中植物...:糖S13C比值與蘋果酸的線性關(guān)系，作出蘋果汁真假判定：蘋果汁蔗糖613Csuc-19.09%。至-26.47%之間，葡萄糖S13Cglu-24.52%。至-30.50%。之間，果糖S13Cfru-在25.22%。至31.96%。之間，植物糖間比值S1在0.27至2.78之間，蘋果酸S13Cmal在-25.31%。至32.57%。之間，線性相關(guān)性系數(shù)R2>0.7255為真，本發(fā)明方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，有效保證了蘋果汁的質(zhì)量，防止摻假蘋果汁；對消費(fèi)者造成的傷害，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。)
【專利說明】采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及果汁，特別是一種采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果汁由于其營養(yǎng)價值高，易于吸收利用，為消費(fèi)者所喜愛的飲料。隨著人們對 天然果汁需求量越來越大，各種各樣的天然或經(jīng)加工的果汁應(yīng)運(yùn)而生。我國蘋果汁資源豐 富、種類繁多，在國民生產(chǎn)總值中占據(jù)重要的地位，也是出口的重要產(chǎn)品。為確保蘋果汁質(zhì) 量和產(chǎn)品順利出口，首先要提高蘋果汁產(chǎn)品質(zhì)量，完善我國對蘋果汁質(zhì)量檢測，從加工源 頭把握好蘋果汁質(zhì)量關(guān)。目前市售蘋果汁品種及其包裝種類多，如100%果汁、濃縮果汁、 含果肉果汁、果汁飲料等，各種各樣的商品名稱讓消費(fèi)者眼花繚亂，頗為疑惑。國家標(biāo)準(zhǔn) GB10789-2007《飲料通則》中，將飲料分為碳酸飲料類、果蔬菜汁類、蛋白飲料類、包裝飲用 水類、茶飲料類、咖啡飲料類、植物飲料類、風(fēng)味飲料類、特殊用途飲料類、固體飲料類、其他 飲料等11類。純果汁是將新鮮水果加工制成非復(fù)原（NFC)果汁，復(fù)原（FC)果汁是在濃縮 果汁中加入等量水分制成，其色澤、風(fēng)味、理化指標(biāo)與原水果相同，濃縮果汁可延長貯藏期， 便于運(yùn)輸。天然蘋果汁與濃縮蘋果汁類產(chǎn)品禁止添加任何添加劑，天然蘋果汁中添加任何 外來物質(zhì)都屬于摻假。由于果汁的巨大市場誘惑力，一些不法廠商造假以牟取暴利，在果汁 含量、標(biāo)簽上作假，使消費(fèi)者利益和身體健康受到威脅。隨著時代的發(fā)展，現(xiàn)代摻假水平越 來越高，果汁摻假手段主要有6種方式：（1)添加水稀釋純果汁含量；（2)添加外源性特征 成份，包括天然和人工合成的甜味劑（蔗糖、各種糖漿、人工合成甜味劑等）、酸味劑（檸檬 酸、蘋果酸等）、香精香料、增稠劑等；（3)添加化學(xué)成份，如色素、防腐劑等；(4)添加其它果 汁或者果渣提取液；（5)以濃縮還原汁代替非濃縮還原汁；(6)原產(chǎn)地冒充。這些摻假手段 均以模仿真實蘋果汁體系中特征組分特性為目標(biāo)，但摻假果汁的營養(yǎng)價值低，損壞消費(fèi)者 的利益和健康。
[0003] 自上世紀(jì)70年代以來，國際食品法典、歐盟、美國、中國等食品機(jī)構(gòu)均制定果汁相 關(guān)法規(guī)，嚴(yán)格控制果汁摻假。我國GB10789-2007準(zhǔn)確規(guī)定果汁與濃縮果汁中可溶性固性 物、果汁含量。隨著商品化摻假果汁技術(shù)的不斷提高，相關(guān)的真?zhèn)舞b定方法也在不斷更新完 善，研究人員在不遺余力地研發(fā)準(zhǔn)確、可靠的檢測方法對其進(jìn)行鑒別，但目前國內(nèi)外還未發(fā) 布一種有效鑒別蘋果汁真?zhèn)蔚姆椒?，對蘋果汁真實天然成份的檢測已成為政府監(jiān)督部門和 研究人員面臨的嚴(yán)峻問題。因此，對蘋果汁進(jìn)行測定，建立有效蘋果汁真?zhèn)闻卸ǖ姆椒?，?成為保證蘋果汁質(zhì)量安全的重要技術(shù)措施。
[0004] 針對果汁的各種摻假手段，國內(nèi)外已有很多相關(guān)報道，主要采用旋光、近紅外光 譜、氣/液相色譜、核磁共振、穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜等技術(shù)分析其中理化參數(shù)、微生物成份、 特征有機(jī)組份、天然同位素比、違禁添加劑。
[0005] 穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析法是鑒別果汁真?zhèn)螐?qiáng)有力的檢測手段，在果汁真?zhèn)闻c原 產(chǎn)地鑒別中廣泛應(yīng)用。由于植物的遺傳特性不同，C3代謝植物與C4代謝植物的同位素比 率有較大的差異，蘋果汁屬C3植物，而用于摻假的原料如甘蔗糖、高果玉米糖漿等主要來 源于C4植物。蘋果汁中摻入甘蔗糖或高果玉米糖漿后，果汁總糖中δ 13C會出現(xiàn)升高現(xiàn)象。 由于植物的不同光合作用途徑及其碳穩(wěn)定同位素的生物歧視效應(yīng)，因此，利用來源不同的 碳水化合物碳同位素比值的差異，以同位素質(zhì)譜儀測定其碳同位素比值，就能鑒定出用化 學(xué)法難以辨別的物質(zhì)。糖份與有機(jī)酸是果汁中主要的風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)，它的含量高低與果汁 品質(zhì)有極密切的關(guān)系。目前測定糖份有機(jī)酸含量的方法有常規(guī)化學(xué)滴定法、氣相色譜法、離 子色譜法等，因此根據(jù)天然蘋果汁中不同成份中同位素數(shù)值，對于鑒定蘋果汁真?zhèn)尉哂兄?要的意義。但至今未見有采用液相采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法 的公開報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種采用液相色 譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法，可有效鑒別真假蘋果汁，保證蘋果汁產(chǎn)品質(zhì) 量的安全。
[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該方法包括以下步驟：
[0008] 1、果汁制備
[0009] 將不同產(chǎn)地的蘋果分別制成蘋果汁樣品液；
[0010] 2、對制備的蘋果汁樣品液植物糖進(jìn)行分析，確立植物糖測定條件，方法是：
[0011] A、對蘋果汁預(yù)處理，將蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容50mL，再取200 μ L加 水稀釋至lmL，過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定，每隔10個測試樣品至少測定一次質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)量控制；
[0012] B、建立液相色譜-同位素質(zhì)譜（LC-IRMS)測定條件，其測定條件為：氬氣峰40中 心杯小于84mV，氧的32峰達(dá)lOOOOmV，C0 2信號峰在1000-2000mV之間；
[0013] C、對液相色譜-同位素質(zhì)譜進(jìn)行穩(wěn)定性測試：使其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0. 3%，并對C02 參考?xì)猞?13C值進(jìn)行標(biāo)定；
[0014] D、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ 13C值，用于分 析結(jié)果質(zhì)控；
[0015] 3、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析，確立植物糖測定條件；
[0016] 4、對天然蘋果汁進(jìn)行分析建立蘋果汁中植物糖δ 13C比值與蘋果酸的線性 關(guān)系，作出蘋果汁真假判定：蘋果汁蔗糖S13Csue-19. 09 %。至-26. 47%。之間，葡萄糖 δ 13Cglu-24. 52%。至-30. 50%。之間，果糖 δ 13Cfra-在 25. 22%。至 31. 96%。之間，植物糖間比值 δ 1在0. 27至2. 78之間，蘋果酸δ 13Cmal在-25. 31%。至32. 57%。之間，線性相關(guān)性系數(shù)R2 > 0. 7255為真，否則為假，從而實現(xiàn)對蘋果汁真假的測定、鑒別。
[0017] 本發(fā)明首創(chuàng)利用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁，在經(jīng)科學(xué)研究、試 驗和對實踐總結(jié)，根據(jù)國內(nèi)外蘋果主產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸s 13c 同位素值的分布范圍，及摻假蘋果汁中的果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸s 13c同位素比值變化 范圍，作為蘋果汁基礎(chǔ)數(shù)據(jù)應(yīng)用于果汁摻假鑒別，本發(fā)明采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定 蘋果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸中S 13c值的分析方法、色譜分離和質(zhì)譜條件等參數(shù)， 創(chuàng)立了蘋果汁中植物糖S 13c比值與蘋果酸的線性相關(guān)性，可以根據(jù)其是否顯著差異判斷 蘋果汁的摻假；并經(jīng)國際原子能機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控比對，證明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度 高，有效保證了蘋果汁的質(zhì)量，防止摻假蘋果汁對消費(fèi)者造成的傷害，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨 大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為不同產(chǎn)地蘋果汁中蔗糖碳同位素分布圖。
[0019] 圖2為不同產(chǎn)地蘋果汁中果糖碳同位素分布圖。
[0020] 圖3為不同產(chǎn)地蘋果中葡萄糖同位素碳分布圖。
[0021] 圖4為不同產(chǎn)地蘋果中植物糖碳同位素比值分布圖。
[0022] 圖5為不同產(chǎn)地蘋果中蘋果酸碳同位素比值分布圖。
[0023] 圖6為蘋果中蘋果酸與碳同位素比值間的線性關(guān)系。

【具體實施方式】
[0024] 以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0025] 本發(fā)明在具體實施時，是由以下步驟實現(xiàn)：
[0026] 1、果汁制備
[0027] 制備天然蘋果汁：將不同產(chǎn)地的234種蘋果各取1-1. 5kg，分別置于榨汁機(jī)內(nèi)榨 汁、離心，收集上清液，制成234種樣品液，-18°C冷凍保存，防止氧化、變質(zhì)；
[0028] 2、對制備的蘋果汁中植物糖進(jìn)行分析，確立植物糖測定條件，所述的植物糖包括 果糖、葡萄糖和蔗糖，方法是：
[0029] A、對蘋果汁預(yù)處理，將制備的234種天然蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容 50mL，再取200 μ L加水稀釋至lmL，過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定，每個樣品進(jìn)行 10個二氧化碳（C02)循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性，每隔10個測試樣品至少測定1次混合標(biāo)準(zhǔn)工作 溶液進(jìn)行質(zhì)量控制；
[0030] B、確立液相色譜-同位素質(zhì)譜（LC-IRMS)分析條件：其條件是，色譜柱：Zobax Ca NP5 300mmX 7. 8mm(i. d.)，粒度 9 μ m ;柱溫：75°C ;流動相：超純水；流速：0· 35mL/min ;氧 化反應(yīng)爐溫度：99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速：0. 05mL/min ;磷酸酸化劑流速：0. 05mL/ min的條件下進(jìn)行測定；
[0031] C、LC-IRMS測定前的4個要求：首先保證不漏氣，對LC-IRMS系統(tǒng)進(jìn)行檢漏，氬 氣峰40中心杯小于84mV ;然后要使其有足夠的氧化性，對氧化能力檢驗，使氧32峰達(dá) lOOOOmV，；再者要防止有機(jī)碳對LC-IRMS的污染，使C0 2信號峰在1000-2000mV之間，該信 號值越低越好；最后要保證LC-IRMS儀器的穩(wěn)定性，測定10個C0 2循環(huán)，使其測定值標(biāo)準(zhǔn)偏 差小于0. 3% ;
[0032] D、LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定：方法是，將國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗 糖質(zhì)控（IAEA-CH-6)給定的δ 13C值-10. 49%。輸入計算機(jī)，標(biāo)定C02氣體值，10個平行測定 結(jié)果值平均，作為C02參考?xì)獾摩?13C值；每次開關(guān)機(jī)前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次 進(jìn)行質(zhì)量控制，確保測得的S13C值與證書標(biāo)明數(shù)值相差±0.30%。內(nèi)；
[0033] E、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定：首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，方法是，分別稱取100mg 果糖、葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至lOOmL，該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為lmg/mL ;然后配 制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，方法是，吸取0. 5mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，0. 2mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備 溶液用水稀釋并定容至10mL，配制成果糖、葡萄糖質(zhì)量濃度為50 μ g/mL、蔗糖濃質(zhì)量度為 20 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按B步驟 中規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定，將10個平行測定結(jié)果值平均，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、 蔗糖的S 13C值，用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制；
[0034] 3、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析，確立蘋果酸測定條件，方法是：
[0035] A、對蘋果汁進(jìn)行預(yù)處理：將步驟1制備的234種天然蘋果汁各取20g分別加水稀 釋至100mL，過濾，每種取lmL過濾液進(jìn)行高效液相色譜（HPLC)制備蘋果酸，制備樣液進(jìn)行 LC-IRMS分析，每個樣品運(yùn)行時進(jìn)行10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性，每隔10個測試樣 品至少測定一次質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì)量控制；
[0036] B、確立HPLC制備蘋果汁中蘋果酸條件：其條件是，色譜柱：Zobax Ca NP5 300mmX7. 8mm(i. d.)，粒度 9μπι ;柱溫：75°C ;進(jìn)樣量：100μ L ;流動相：水；流速：0· 35mL/ min ;饋分收集時間：10. Omin-14. Omin ;
[0037] C、確立LC-IRMS分析條件：其條件是，色譜柱：ICS印Coregel_87H3氫型柱， 300_X 7. 8_(i. d.)，粒度 5. 0 μ m ;柱溫：80°C ;流動相：8mmol/L 硫酸溶液；流速：0· 35mL/ min ;氧化反應(yīng)爐溫度：99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速：0. 045mL/min ;磷酸酸化劑流速： 0. 045mL/min ；
[0038] D、LC-IRMS測定前的4個要求：同步驟⑵中的C ;
[0039] E、LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定：同步驟（2)中的D ;
[0040] F、對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定：首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，方法是，稱取100mg蘋果 酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至l〇〇mL，該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為lmg/mL ;然后配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，方法是，吸取〇. 4mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用水稀釋并定容至10mL，配制成質(zhì)量濃度為 40 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按3C步驟中 規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定，將10個平行測定結(jié)果值平均，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗 糖的S 13C值，用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制；
[0041] 4、根據(jù)對天然蘋果汁的分析結(jié)果，建立作出蘋果汁真假判定：方法是，滿足以下 四個條件：一、蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C測定值在范圍之間，蔗糖S13Csuc;-19.09%。 至-26.47%。之間，葡萄糖3 13(：8111-24.52%。至-30.50%。之間，果糖313(： &11-在 25.22%。至 31. 96%。之間，植物糖間比值δ 1在〇. 27至2. 78之間，蘋果酸δ 13〇^在-25. 31%。至32. 57%〇 之間；二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值在0.27-2. 78之間；三、蘋果汁中 蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C最大差值在-10. 48%。至-1. 7%。之間；四、蘋果汁的葡萄 糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值與蘋果酸δ 13C值具有線性相關(guān)性，符合線性方程 Y = -2. 8186X-24. 262,相關(guān)系數(shù)大于0. 7255,滿足以上四個條件為真，否則為假，從而實現(xiàn) 對蘋果汁真假的測定、鑒別。
[0042] 為了保證使用效果，所述的國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液IAEA-CH-6， 每次使用前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次，確保測得的δ 13C值與標(biāo)準(zhǔn)溶液證書標(biāo)明的 數(shù)值相差±0.30%。內(nèi)；所述的液相色譜-同位素質(zhì)譜儀為DELTA V Plus液相色譜-同位素 質(zhì)譜儀，配備Surveyor液相色譜與Isolink接口（美國Thermofisher公司）；1200高效液相 色譜儀（美國Agilent公司）5810型離心機(jī)（日本日立公司）；飛利浦榨汁機(jī)HR1861/30 (廣 州飛利浦公司）0. 22 μ m水相一次性微孔濾膜（美國Agilent公司）；色譜柱：有機(jī)酸分析 液相色譜柱ICS印Coregel-87H3(氫型）7·8X300mm，9μm(美國TRANSGEN0MIC公司）；糖 度計IAEA-CH-6, Sucrose標(biāo)示值：δ 13C-10. 449%。VPDB(均購自于國際原子能機(jī)構(gòu)）；水為 Millipore純水器制得超純水，使用前抽空超聲（美國Millipore公司）。
[0043] 本發(fā)明方法先進(jìn)，首創(chuàng)性的將液相色譜-同位素質(zhì)譜技術(shù)用在蘋果汁真假的鑒 另IJ，開創(chuàng)了蘋果汁真假鑒別的新方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比：
[0044] 1、創(chuàng)建了國內(nèi)外蘋果主產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地水果中植物糖、有機(jī)酸、總碳、總氮、總氧同 位素值的分布范圍，作為果汁基礎(chǔ)數(shù)據(jù)應(yīng)用于果汁摻假鑒別。
[0045] 2、本發(fā)明采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定蘋果汁果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋果酸中 s13c值的分析方法，優(yōu)化了最佳提取條件、有機(jī)酸凈化制備方法、色譜分離和質(zhì)譜條件等參 數(shù)，對于蘋果汁研究了植物糖S 13c比值與蘋果酸的線性相關(guān)性。
[0046] 2、本發(fā)明建立了鑒別真假果汁的方法，經(jīng)國際原子能機(jī)構(gòu)與國家標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控比對， 證明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，是 申請人:經(jīng)科學(xué)研究、試驗和對實踐總結(jié)作出的創(chuàng)造 性勞動結(jié)晶，有關(guān)資料如下：
[0047] 1.儀器和試劑
[0048] DELTA V Plus液相色譜-同位素質(zhì)譜儀，配備Surveyor液相色譜與Isolink接 口（美國Thermofisher公司）；1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）5810型離心 機(jī)（日本日立公司）；飛利浦榨汁機(jī)HR1861/30(廣州飛利浦公司）0.22μπι水相一次性微 孔濾膜（美國Agilent公司）。色譜柱：有機(jī)酸分析液相色譜柱ICSep Coregel-87H3 (氫 型）7.8*300mm，9ym(美國TRANSGEN0MIC公司）；強(qiáng)陽離子鈣型交換色譜柱Zobax Ca NP5 7. 8*300mm I丐型，9 μ m(美國Agilent公司）。糖度計
[0049] IAEA-CH-6, Sucrose 標(biāo)示值：δ 13C_10. 449%。VPDB(均購自于國際原子能機(jī)構(gòu)）； 過二硫酸鈉，Na2S204 ( > 99 % );高純磷酸，H3P04 ( > 99 % );二水鎢酸鈉，Na2W04 · 2H20 ; 濃硫酸，H2S04 ;1. 12mol/L過二硫酸鈉溶液：稱取20g(精確到0. 01g)過二硫酸鈉用水定 容至250mL ;0. 33mol/L磷酸溶液：量取15mL高純磷酸，用水定容至250mL ;8mmol/L硫酸溶 液：取29. 6mL濃硫酸，用水稀釋至1000mL ;D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品購 自美國Sigma公司、德國Dr. Ehrenstorfer公司；水為Millipore純水器制得超純水，使用 前抽空超聲（美國Millipore公司）。
[0050] 2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0051] 蔗糖同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10. 〇mg IAEA-CH-6 (精確到0. Olmg)同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 用水定容至100mL，于0°C -4°C保存可使用一周。20 μ g/mL同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取 0. 2mL同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋并定容至lmL，配制成20 μ g/mL的同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，該溶 液使用前配制。
[0052] D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取100mg(精確到0. Olmg)標(biāo)準(zhǔn)品， 用水定容至100mL，于0°C _4°C保存可使用一周，該溶液濃度為lmg/mL。3種植物糖混合標(biāo) 準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取〇. 5mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，0. 2mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用水稀釋并 定容至lOmL，配制成果糖、葡萄糖濃度為50 μ g/mL、鹿糖濃度為20 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 該溶液使用前配制。
[0053] 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取100mg(精確到0. Olmg)標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至100mL， 于0°C -4°c保存可使用一周,該溶液濃度為lmg/mL。40 μ g/mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取 0. 4mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用水稀釋并定容至lOmL，配制成40 μ g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，該 溶液使用前配制。
[0054] 3蘋果汁制備
[0055] 蘋果洗凈晾干，放入榨汁機(jī)內(nèi)榨汁，收集果汁。取一定量果汁于離心管中在離心機(jī) 上4000r/min離心5min，收集上清液于具塞塑料離心管，-18°C冷凍保存。
[0056] 市售果汁：將果汁混勻后于離心管中，在離心機(jī)上4000r/min離心5min，收集上清 液于具塞塑料離心管，-18 °C冷凍保存。
[0057] 摻假植物糖果汁的制作：取自榨蘋果汁100mL適量加入果糖、蔗糖、葡萄糖制得。
[0058] 摻假有機(jī)酸果汁的制作：取自榨蘋果汁100mL分別適量加入蘋果酸制得。
[0059] 4植物糖分析
[0060] 4. 1前處理
[0061] 稱取均勻蘋果汁（試樣）〇.3g(精確到O.OOlg)于50mL容量瓶中，用水定容。用 移液器移取上述水溶液200 μ L于進(jìn)樣瓶中，用水稀釋至lmL，過0. 22 μ m微孔濾膜后，用液 相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定。
[0062] 4. 2儀器條件
[0063] 4. 2. 1同位素質(zhì)譜儀的預(yù)調(diào)
[0064] 操作前確認(rèn)檢測環(huán)境、氣密性和真空度達(dá)到要求，然后檢驗儀器的穩(wěn)定性和線性 是否符合要求，必要時調(diào)整離子源參數(shù)。
[0065] 4. 2. 2系統(tǒng)檢漏
[0066] 在氬氣分析模式下，檢驗峰40中心杯小于84mV說明不漏氣。
[0067] 4. 2. 3氧化能力檢驗
[0068] 進(jìn)行液相色譜-同位素質(zhì)譜測定前，調(diào)整氧化劑和酸化劑流速，確保體系的氧化 能力達(dá)到要求。切換兩相Oxid/acid混合泵至檢測器，在02分析模式下操作，等量調(diào)整 Oxid/acid泵流速，使0 2的32峰達(dá)10, 000-15, OOOrnV，使其有足夠的氧化性。
[0069] 4. 2. 4評價系統(tǒng)中有機(jī)碳的污染
[0070] 切換至C02分析模式，找開樣品spilt開關(guān)，使C02信號峰在1000-2000mV之間，該 信號越低越好，如超過2000mV，說明系統(tǒng)中有機(jī)污染物超標(biāo)，主要是流動相中水受有機(jī)碳污 染。
[0071] 4. 2. 5LC-IRMS 穩(wěn)定性測試
[0072] 設(shè)定10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性，使其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0. 3 %。
[0073] 4. 2. 6植物糖分析液相色譜-同位素質(zhì)譜條件
[0074] a)色譜柱：Zobax Ca NP5 300mmX 7. 8mm(i. d.)，粒度 9 μ m ;
[0075] b)柱溫：75°C ;
[0076] c)流動相：超純水；
[0077] d)流速：0· 35mL/min ；
[0078] e)進(jìn)樣量：10yL;
[0079] f)氧化反應(yīng)爐溫度：99. 9 °C ;
[0080] g)氧化反應(yīng)參考條件參見；
[0081] 1)氧化劑：過二硫酸鈉溶液
[0082] 2)氧化劑流速：0· 05mL/min
[0083] 3)酸化劑：磷酸溶液
[0084] 4)酸化劑流速：0· 05mL/min
[0085] h)載氣：氦氣，純度99. 999% ;
[0086] i)參考?xì)猓憾趸?，純?9. 999%。
[0087] 4. 2. 7對蘋果汁進(jìn)行測定
[0088] a)C02參考?xì)猞?3(：值的測定
[0089] 在Conflo模式（即由萬用接口同時把載氣流量范圍不同的多個樣品前處理裝置 接到同一臺同位素比質(zhì)譜儀上）下將國際原子能機(jī)構(gòu)IAEA-CH-6給定的DELTA值輸入，標(biāo) 定C0 2氣體值，10個平行測定結(jié)果值平均，測得C02參考?xì)獾摩?13C值-19. 37%。。b)質(zhì)控蘋 果汁標(biāo)品S13C值的測定
[0090] 將果糖配制成濃度為50 μ g/mL、葡萄糖濃度為50 μ g/mL、鹿糖濃度為20 μ g/mL的 單個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在液相色譜-同位素質(zhì)譜儀條件下進(jìn)行測定，將10個平行測定結(jié)果值 平均，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗糖的s 13c值，用于分析結(jié)果質(zhì)控。
[0091] 質(zhì)控標(biāo)品測定值
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1 )、果汁制備 制備天然蘋果汁：將不同產(chǎn)地的234種蘋果各取1-1. 5kg，分別置于榨汁機(jī)內(nèi)榨汁、離 心，收集上清液，制成234種樣品液，-18°C冷凍保存，防止氧化、變質(zhì)； (2) 、對制備的蘋果汁中植物糖進(jìn)行分析，確立植物糖測定條件，所述的植物糖包括果 糖、葡萄糖和蔗糖，方法是： A、 對蘋果汁預(yù)處理，將制備的234種天然蘋果汁樣品液分別取0. 3g加入水定容50 mL， 再取200 μ L加水稀釋至lmL，過濾后用液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定，每個樣品進(jìn)行10個 二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性，每隔10個測試樣品至少測定1次混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì) 量控制； B、 確立LC-IRMS分析條件：其條件是，色譜柱：Zobax Ca NP5 300 _ X7.8 )， 粒度9 μ m ;柱溫：75。。；流動相：超純水；流速:0· 35 mL/min ;氧化反應(yīng)爐溫度：99. 9。。； 過二硫酸鈉氧化劑流速：〇. 05 mL/min ;磷酸酸化劑流速：0. 05 mL/min的條件下進(jìn)行測定； C、 LC-IRMS測定前的4個要求：首先保證不漏氣，對LC-IRMS系統(tǒng)進(jìn)行檢漏，氬氣峰40 中心杯小于84mV ;然后要使其有足夠的氧化性，對氧化能力檢驗，使氧32峰達(dá)lOOOOmV,; 再者要防止有機(jī)碳對LC-IRMS的污染，使C0 2信號峰在1000-2000 mV之間，該信號值越低 越好；最后要保證LC-IRMS儀器的穩(wěn)定性，測定10個C02循環(huán)，使其測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 0. 3% ； D、 LC-IRMS所用C02參氣體δ 13C值的標(biāo)定：方法是，將國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì) 控（IAEA-CH-6)給定的δ 13C值-10. 49%。輸入計算機(jī)，標(biāo)定C02氣體值，10個平行測定結(jié)果 值平均，作為C02參考?xì)獾摩?13C值；每次開關(guān)機(jī)前應(yīng)將IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次進(jìn)行 質(zhì)量控制，確保測得的S13C值與證書標(biāo)明數(shù)值相差±0.30 %。內(nèi)； E、 對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定：首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，方法是，分別稱取100 mg果糖、 葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至100 mL，該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為1 mg/ mL;然后配制 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，方法是，吸取〇. 5 mL果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，0. 2 mL蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備 溶液用水稀釋并定容至10 mL，配制成果糖、葡萄糖質(zhì)量濃度為5(^g/ mL、蔗糖濃質(zhì)量度為 2(^g/ mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；最后是質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按B步驟 中規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定，將10個平行測定結(jié)果值平均，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、 蔗糖的S 13C值，用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制； (3) 、對蘋果汁中蘋果酸進(jìn)行分析，確立蘋果酸測定條件，方法是： A、 對蘋果汁進(jìn)行預(yù)處理：將步驟1制備的234種天然蘋果汁各取20g分別加水稀釋至 100mL，過濾，每種取lmL過濾液進(jìn)行高效液相色譜制備蘋果酸，制備樣液進(jìn)行LC-IRMS分 析，每個樣品運(yùn)行時進(jìn)行10個二氧化碳循環(huán)測定儀器穩(wěn)定性，每隔10個測試樣品至少測定 一次質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行質(zhì)量控制； B、 確立HPLC制備蘋果汁中蘋果酸條件：其條件是，色譜柱：Zobax Ca NP5 300 mmX7.8 mm(i.d·)，粒度 9μηι;柱溫：75°C;進(jìn)樣量：100 KL;流動相：水；流速：0.35 mL/ min ;饋分收集時間：10. Omin-14. Omin ; C、 確立LC-IRMS分析條件：其條件是，色譜柱：ICS印Coregel-87H3氫型柱，300mm 父7.8 111111([(1.)，粒度5.0|^;柱溫：801：;流動相 ：8臟〇1/1硫酸溶液；流速：0.3511117 min ;氧化反應(yīng)爐溫度：99. 9°C ;過二硫酸鈉氧化劑流速：0. 045mL/min ;磷酸酸化劑流速： 0. 045mL/min ； D、 LC-IRMS測定前的4個要求：同步驟（2)中的C ; E、 LC-IRMS所用C02參氣體S13C值的標(biāo)定：同步驟（2)中的D ; F、 對質(zhì)控標(biāo)品δ 13C值的測定：首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，方法是，稱取100 mg蘋果酸 標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至100 mL，該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度為1 mg/ mL;然后配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，方法是，吸取0.4 mL蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用水稀釋并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為 4(^g/ mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；最后是質(zhì)控標(biāo)品S13C值的測定，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按3C步驟中 規(guī)定的儀器條件下進(jìn)行測定，將10個平行測定結(jié)果值平均，得到質(zhì)控標(biāo)品果糖、葡萄糖、蔗 糖的S 13C值，用于分析結(jié)果的質(zhì)量控制； (4)、根據(jù)對天然蘋果汁的分析結(jié)果，建立作出蘋果汁真假判定：方法是，滿足以下四 個條件：一、蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S13C測定值在范圍之間，蔗糖S13Csuc;-19.09%。 至-26.47%。之間，葡萄糖3 13(：8111-24.52%。至-30.50%。之間，果糖313(： &11-在 25.22%。至 31. 96%。之間，植物糖間比值δ 1在〇. 27至2. 78之間，蘋果酸δ 13〇^在-25. 31%。至32. 57%〇 之間；二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值在0.27-2. 78之間；三、蘋果汁中 蔗糖、葡萄糖、果糖、蘋果酸S 13C最大差值在-10. 48%。至-1. 7%。之間；四、蘋果汁的葡萄 糖-蔗糖、果糖-蔗糖S13C差值間的比值與蘋果酸δ 13C值具有線性相關(guān)性，符合線性方程 Y=-2. 8186X-24. 262,相關(guān)系數(shù)大于0. 7255,滿足以上四個條件為真，否則為假，從而實現(xiàn)對 蘋果汁真假的測定、鑒別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法， 其特征在于，所述的國際原子能機(jī)構(gòu)提供的蔗糖質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液IAEA-CH-6,每次使用前應(yīng)將 IAEA-CH-6標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次，確保測得的δ 13C值與標(biāo)準(zhǔn)溶液證書標(biāo)明的數(shù)值相差±0. 30 %〇內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用液相色譜-同位素質(zhì)譜測定鑒別真假蘋果汁的方法，其 特征在于，所述的液相色譜-同位素質(zhì)譜儀為DELTA V Plus液相色譜-同位素質(zhì)譜儀，配 備Surveyor液相色譜與Isolink接口；1200高效液相色譜儀、5810型離心機(jī)；飛利浦榨汁 機(jī) HR1861/30、0. 22 μ m 水相一次性微孔濾膜；Sucrose 標(biāo)示值：δ 13C-10. 449%。VPDB。
【文檔編號】G01N30/88GK104215731SQ201410477581
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】祝偉霞, 楊冀州, 袁萍, 劉亞風(fēng), 劉勝男, 魏蔚, 楊娜 申請人:祝偉霞