一種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，將待測(cè)的1頭或幾頭薊馬放置到畫好分隔的硝酸纖維素膜上，加2μl樣品處理緩沖液，用移液槍頭將薊馬磨碎于緩沖液中，依次處理不同蟲體樣品，同樣吸取2μl陽(yáng)性和陰性對(duì)照液點(diǎn)在硝酸纖維素膜上；待膜干燥后，用PBST緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉1h,再加入封閉液稀釋的一抗培育1h,之后洗膜3次；加入封閉液稀釋的二抗培育1h，再洗膜3次；加入顯色液顯色15min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)，即可進(jìn)行結(jié)果分析。本發(fā)明操作方便、快速、測(cè)定結(jié)果有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，能滿足薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的檢測(cè)需要，為盡量避免番茄斑萎病毒的危害奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，進(jìn)一步屬于昆蟲體內(nèi)病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]番茄斑萎病毒是一種有害生物，因首先在染病番茄上發(fā)現(xiàn)而命名，番茄斑萎病毒的分布范圍很廣，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物，因感染該病毒而發(fā)生的作物疾病稱為斑萎病。
[0003]番爺斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是一種危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病毒。它的寄主范圍很廣，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物,尤其是爺科、菊科和豆科的部分植物。在歐洲、北美、南美、亞洲和大洋洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛分布，熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)均有發(fā)生。屬于歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EPPO) A2類檢疫性有害生物，同時(shí)也是中國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物。
[0004]番茄斑萎病毒癥狀變化大，苗期染病，幼葉變?yōu)殂~色上卷，后形成許多小黑斑，葉背面沿脈呈紫色，有的生長(zhǎng)點(diǎn)死掉，莖端形成褐色壞死條斑，病株僅半邊生長(zhǎng)或完全矮化或落葉呈萎蔫狀，發(fā)病早的不結(jié)果。坐果后染病，果實(shí)上出現(xiàn)褪綠環(huán)斑，綠果略凸起，輪紋不明顯，青果上產(chǎn)生褐色壞死斑，呈瘤狀突起，果實(shí)易脫落。成熟果實(shí)染病輪紋明顯，紅黃或紅白相間，褪綠斑在全色期明顯，嚴(yán)重的全果僵縮，臍部癥狀與臍腐病相似，但該病果實(shí)表皮變褐壞死別于臍腐病。
[0005]番茄斑萎病毒傳播途徑:汁液可接種，種子也能傳染，此外煙薊馬(Thripstabaci)、豆薊馬(T.Setosus)、薊馬(Frankliniella schutzei)、煙草褐薊馬(F.Fusca)及苜猜薊馬(F.0ccidentatis)等均可進(jìn)行持久性傳毒。
[0006]薊馬只能在幼蟲期獲得病毒。傳毒需要在體內(nèi)繁殖，蔥薊馬經(jīng)5?10天變?yōu)槌上x后才能傳毒，煙薊馬最短獲毒期為15?30分鐘，豆薊馬需30分鐘，時(shí)間長(zhǎng)傳毒效率升高，薊馬一旦帶毒，傳毒達(dá)20天，具終生傳毒能力。病毒接種多在番茄葉表細(xì)胞淺表皮吸食時(shí)獲取，一般經(jīng)4天潛育即發(fā)病。番茄、瓜葉菊等外種皮帶毒，不進(jìn)入胚胎。
[0007]此病毒可以通過一些野生植物品種來越冬。但是，病毒流行主要依賴于蟲口密度。最主要的介體昆蟲薊馬的成蟲藏在土壤中，春季土壤溫度上升后，害蟲會(huì)遷移到雜草上。因此，開發(fā)一種能快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法是非常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法。
[0009]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括前處理、檢測(cè)、結(jié)果分析步驟，具體包括:
A、前處理:將待測(cè)薊馬放置到硝酸纖維素膜上，加入樣品處理PBS緩沖液，磨碎，用同方法處理帶毒薊馬和無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照的位置；
B、檢測(cè):將經(jīng)前處理后的硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內(nèi)，加入封閉液浸沒0.5?1.5h，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素:Γ4次，再加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次，加入顯色緩沖液浸沒5飛min，棄去顯色緩沖液，加入顯色液反應(yīng)15?30min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)；
C、結(jié)果分析:終止顯色反應(yīng)后即可進(jìn)行結(jié)果分析，陽(yáng)性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，陰性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化時(shí)，表明檢測(cè)正常完成；檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，表明該檢測(cè)樣品帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬帶有所測(cè)病毒，檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化，表明該檢測(cè)樣品不帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬不帶有所測(cè)病毒。
[0010]本發(fā)明操作方便、快速、測(cè)定結(jié)果有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，能滿足薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的檢測(cè)需要，為盡量避免番茄斑萎病毒的危害奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明單頭薊馬體內(nèi)TSWV (番茄斑萎病毒)檢測(cè)結(jié)果示意圖；
圖2為昆明周邊番茄、辣椒及雜草上薊馬TSWV檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]本發(fā)明所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，包括前處理、檢測(cè)、結(jié)果分析步驟，具體包括:
A、前處理:將待測(cè)薊馬放置到硝酸纖維素膜上，加入樣品處理緩沖液(PBS緩沖液內(nèi)含
0.01%吐溫20、0.01?0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.01-0.1 M的蛋白酶K，pH 7.0)，磨碎，用同方法處理帶毒薊馬和無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照的位置；
B、檢測(cè):將經(jīng)前處理后的硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內(nèi)，加入封閉液浸沒
0.5?1.5h，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)
0.5^1.5h，棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素:Γ4次，再加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次，加入顯色緩沖液浸沒5飛min，棄去顯色緩沖液，加入顯色液反應(yīng)15?30min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)；
C、結(jié)果分析:終止顯色反應(yīng)后即可進(jìn)行結(jié)果分析，陽(yáng)性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，陰性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化時(shí)，表明檢測(cè)正常完成；檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，表明該檢測(cè)樣品帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬帶有所測(cè)病毒，檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化，表明該檢測(cè)樣品不帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬不帶有所測(cè)病毒。
[0014]所述的硝酸纖維素膜為0.45Mffl的硝酸纖維素膜。
[0015]A步驟中所述的樣品處理緩沖液是PBS緩沖液內(nèi)含0.01%吐溫20、0.θΓθ.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.01-0.1 M的蛋白酶K，pH 7.0。
[0016]B步驟所述的封閉液為質(zhì)量體積比f 10%脫脂奶粉的PBST緩沖液。
[0017]B步驟中所述的加入封閉液浸沒0.5^1.5h是加入封閉液5?20ml淹沒硝酸纖維素膜，再置于28?37°C的培養(yǎng)箱中0.5?1.5h。
[0018]B步驟中所述的用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體是指用封閉液按體積比50(Γ100000倍稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體；所述的用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體是指用封閉液按體積比50(Γ100000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體。
[0019]B步驟所述的加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)
0.5^1.5h是指加入5?20ml用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于28?37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5^1.5h ;所述的加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h是指加入5?20ml用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于28?37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.8^1.2h。
[0020]B步驟中所述的用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素3?4次是指在裝有硝酸纖維素膜的容器內(nèi)加入PBST緩沖液，置于水平搖床上振蕩5飛min，共進(jìn)行3?4次。
[0021]B步驟中所述的顯色緩沖液是堿性磷酸酯酶緩沖液，其配方由lmol/L的pH9.5的Tris-HCl 緩沖液 10ml、lmol/L 的 NaCl 溶液 1ml 和 lmol/L 的 MgCl2 溶液 0.5ml,用蒸懼水定容至10ml得到；所述的顯色液是取1ml顯色緩沖液中加入33 μ I的BCIP和66 μ I的NBT攪拌混勻得到。
[0022]所述的NBT溶液是將0.5g NBT溶解于1ml 70%的二甲基甲酰胺中制備得到；所述的BCIP溶液是將0.5g BCIP溶解于1ml 100%的二甲基甲酰胺中制備得到。
[0023]本發(fā)明快速檢測(cè)I頭或幾頭薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，包括檢測(cè)樣品及對(duì)照樣品上樣液配制、檢測(cè)及結(jié)果分析工序，具體包括:
A、將待檢測(cè)薊馬I頭或幾頭放置到畫好分隔(0.3*0.3)的硝酸纖維素膜上，加2 μ?樣品處理緩沖液(PBS緩沖液內(nèi)含0.01%吐溫20、0.01?0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.01-0.1 M的蛋白酶K，pH 7.0)，用移液槍頭將薊馬磨碎，依次處理不同蟲體樣品；同方法處理帶毒薊馬或無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照的位置。
[0024]B、檢測(cè):以上處理的硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內(nèi)，加入封閉液浸沒
0.5?1.5h，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)
0.5^1.5h，棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次，再加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次。
[0025]C、結(jié)果分析:硝酸纖維素膜洗滌完成后，加入顯色緩沖液浸沒5飛min，棄去顯色緩沖液，加入用顯色緩沖液配制好的顯色液，顯色15?30min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)；終止顯色反應(yīng)后即可進(jìn)行結(jié)果分析，陽(yáng)性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，陰性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化時(shí)，表明檢測(cè)正常完成；檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，表明該檢測(cè)樣品帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬帶有所測(cè)病毒，檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化，表明該檢測(cè)樣品不帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬不帶有所測(cè)病毒。 步驟A所述的薊馬蟲體檢測(cè)前處理方法；蟲體樣品緩沖液為加入0.01%吐溫20、
0.01-0.02%的聚乙烯吡咯烷酮、0.0lM的蛋白酶K的PBS (pH 7.0)。用經(jīng)滅菌和干燥處理的10 μι移液器槍頭在畫好分隔的硝酸纖維素膜上將蟲體搗碎。
[0026]步驟B所述的硝酸纖維素膜為0.45 Mffl的硝酸纖維素膜，封閉液為用緩沖液配制的質(zhì)量百分比為4?6%的脫脂奶粉。
[0027]步驟B所述的將硝酸纖維素膜干燥，指的是將硝酸纖維素膜置于室溫下自然干燥，或是將硝酸纖維素膜置于28_37°C培養(yǎng)箱中干燥。
[0028]步驟B所述的將硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內(nèi)，加入封閉液浸沒，指的是將硝酸纖維素膜置于容器中，加入5^20ml封閉液，淹沒硝酸纖維素膜，再將容器置于28-37°C培養(yǎng)箱中封閉0.5?1.5h。
[0029]步驟B所述的用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，指的是用封閉液按體積比1:50(Γ100000倍稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，所述的用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，指的是用封閉液按體積比1:50(Γ100000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體。
[0030]步驟B所述的加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)
0.5^1.5h，指的是加入5?20ml用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5^1.5h ;所述的加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，指的是加入5?20ml用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5^1.5h。
[0031]步驟B所述的用緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次，指的是在裝有硝酸纖維素膜的容器內(nèi)加入適量緩沖液，置于水平搖床上振蕩5飛min，共進(jìn)行3?4次。
[0032]步驟C所述的顯色緩沖液指的是堿性磷酸酯酶緩沖液，其配方為I mol/LTris-Hcl (pH 9.5) 10ml, I mol/L Nacl 10ml, I mol/L Mgcl2 0.5ml,蒸懼水補(bǔ)齊至 100ml ；顯色液配制為10 ml顯色緩沖液中加入33 μ? BCIP和66 μ? NBT攪拌混勻。
[0033]步驟C所述的顯色液配制中用到的BCIP和NBT的配制方法如下:
NBT溶液:將0.5gNBT溶解于1mL 70%的二甲基甲酰胺中。
[0034]BCIP溶液:將0.5gBCIP溶解于1mL 100%的二甲基甲酰胺中。
[0035]實(shí)施例1
單頭薊馬體內(nèi)番爺斑萎病毒?ο spotted wilt virus, TSWV)的檢測(cè):
所用試劑如下:
樣品處理緩沖液:PBS緩沖液內(nèi)含0.01%吐溫20、0.ΟΓΟ.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.01-0.1 M 的蛋白酶 K，pH 7.0
封閉液:用緩沖液配制的質(zhì)量百分比為5%的脫脂奶粉。
[0036]PBST 緩沖液:含有 0.01-0.1% 的 PBS, ρΗ7.0
一抗:TSWV兔源多克隆抗體或鼠源單克隆抗體
二抗:病毒兔源抗體使用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔，病毒鼠源抗體使用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠
顯色緩沖液:I mol/L Tris-Hcl (pH 9.5)) 10ml, I mol/L Nacl 10ml, I mol/L Mgcl20.5ml,蒸懼水補(bǔ)齊至100ml。
[0037]顯色液:10 ml顯色緩沖液中加入33 μL BCIP和66 μL NBT攪拌混勻。
[0038]NBT溶液:將0.5gNBT溶解于1mL 70%的二甲基甲酰胺中。
[0039]BCIP溶液:將0.5gBCIP溶解于1mL 100%的二甲基甲酰胺中。
[0040]A、將待檢測(cè)薊馬I頭或幾頭放置到畫好分隔(0.3*0.3)的硝酸纖維素膜上，加2μι樣品處理緩沖液，用移液槍頭將薊馬磨碎，依次處理不同蟲體樣品；同方法處理帶毒薊馬或無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照的位置。
[0041]B、檢測(cè):以上處理的硝酸纖維素膜
置于37°C培養(yǎng)箱中徹底干燥,然后置于直徑為6cm的培養(yǎng)皿中,加入5ml封閉液,再將培養(yǎng)皿置于37°C培養(yǎng)箱中封閉1.0h。棄去封閉液,加入5ml用稀封閉液稀釋的番爺斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，置于37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.0h。棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次均置于水平搖床上振蕩洗滌5min。接著加入5ml用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，置于37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)1.0h。棄去堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，用緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次均置于水平搖床上振蕩洗漆 5min。
[0042]C、結(jié)果分析:硝酸纖維素膜洗滌完成后，加入顯色緩沖液浸沒5min，棄去顯色緩沖液，加入用顯色緩沖液配制好的顯色液，顯色15min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)；終止顯色反應(yīng)后即可進(jìn)行結(jié)果分析，陽(yáng)性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，陰性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化時(shí)，表明檢測(cè)正常完成；檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，表明該檢測(cè)樣品帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬帶有所測(cè)病毒，檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化，表明該檢測(cè)樣品不帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬不帶有所測(cè)病毒。檢測(cè)結(jié)果見圖1，檢測(cè)記錄及檢測(cè)結(jié)果分別見表1和表2。
[0043]表1 檢測(cè)單頭薊馬體內(nèi)TSWV樣品記錄表

【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于包括前處理、檢測(cè)、結(jié)果分析步驟，具體包括: A、前處理:將待測(cè)薊馬放置到硝酸纖維素膜上，加入樣品處理緩沖液，磨碎，用同方法處理帶毒薊馬和無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照的位置； B、檢測(cè):將經(jīng)前處理后的硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內(nèi)，加入封閉液浸沒0.5^1.5h，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素:Γ4次，再加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h，棄去堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3?4次，加入顯色緩沖液浸沒5飛min，棄去顯色緩沖液，加入顯色液反應(yīng)15?30min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)； C、結(jié)果分析:終止顯色反應(yīng)后即可進(jìn)行結(jié)果分析，陽(yáng)性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，陰性對(duì)照樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化時(shí)，表明檢測(cè)正常完成；檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)黑褐色或紅色，表明該檢測(cè)樣品帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬帶有所測(cè)病毒，檢測(cè)樣品上樣液所點(diǎn)斑點(diǎn)無顏色變化，表明該檢測(cè)樣品不帶有所測(cè)病毒，即該檢測(cè)樣品中的薊馬不帶有所測(cè)病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜為0.45Mfli的硝酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于A步驟中所述的樣品處理緩沖液是PBS緩沖液內(nèi)含0.01%吐溫20、0.0Γ0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.ΟΓΟ.1 M 的蛋白酶 K，pH 7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟所述的封閉液為質(zhì)量體積比廣10%脫脂奶粉的PBST緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟中所述的加入封閉液浸沒0.5^1.5h是加入封閉液5?20ml淹沒硝酸纖維素膜，再置于28?37°C的培養(yǎng)箱中0.5?1.5h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟中所述的用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體是指用封閉液按體積比500^100000倍稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體；所述的用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體是指用封閉液按體積比50(Γ100000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟所述的加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應(yīng)0.5^1.5h是指加入5?20ml用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于28?37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5?1.5h;所述的加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)0.5^1.5h是指加入5?20ml用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，淹沒硝酸纖維素膜，置于28?37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.8?1.2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟中所述的用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素3?4次是指在裝有硝酸纖維素膜的容器內(nèi)加入PBST緩沖液，置于水平搖床上振蕩5飛min，共進(jìn)行3?4次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于B步驟中所述的顯色緩沖液是堿性磷酸酯酶緩沖液，其配方由lmol/L的pH9.5的Tris-HCl緩沖液10ml、lmol/L的NaCl溶液1ml和lmol/L的MgCl2溶液0.5ml,用蒸懼水定容至10ml得到；所述的顯色液是取1ml顯色緩沖液中加入33 μ I的BCIP和66 μ I的NBT攪拌混勻得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的快速檢測(cè)薊馬體內(nèi)番茄斑萎病毒的方法，其特征在于所述的NBT溶液是將0.5g NBT溶解于1ml 70%的二甲基甲酰胺中制備得到；所述的BCIP溶液是將0.5g BCIP溶解于1ml 100%的二甲基甲酰胺中制備得到。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104198713SQ201410450554
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】丁銘, 盧訓(xùn), 尹躍艷, 張仲凱 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所