一種結(jié)直腸癌相關(guān)“多肽-蛋白組合式標(biāo)志物”檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種結(jié)直腸癌相關(guān)“多肽-蛋白組合式標(biāo)志物”檢測試劑盒。該試劑盒含有捕獲抗體和檢測抗體，捕獲抗體與蛋白HKa特異性結(jié)合，檢測抗體與多肽HKP15或多肽HKP09特異性結(jié)合。本發(fā)明所提供的試劑盒，對HKP09/HKP15-HKa組合式標(biāo)志物的線性檢測范圍為6ng/mL～120ng/mL，最低檢測限為1.7ng/mL，區(qū)分結(jié)直腸癌樣本和正常人樣本的檢測靈敏度為93.7％，特異性為92.7％。本發(fā)明所提供的試劑盒所檢全新組合式標(biāo)志物與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，且檢測技術(shù)具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度，操作簡便快捷，利于高通量地臨床檢測，并能降低檢測成本。
【專利說明】-種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白組合式 標(biāo)志物"檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌，即大腸癌（Colorectal Carcinoma,簡稱CRC)，包括結(jié)腸癌和直腸癌，是 消化道常見惡性腫瘤，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國家如北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等國發(fā)病率較高， 而在經(jīng)濟(jì)迅速崛起的國家和地區(qū)發(fā)病率也在迅速上升。因此，結(jié)直腸癌的早期診斷及相關(guān) 診斷標(biāo)志物的發(fā)掘是目前亟待解決的問題。
[0003] 結(jié)直腸癌常用的篩查手段包括大便潛血試驗、乙狀結(jié)腸鏡檢查、全結(jié)腸鏡檢查和 鋇灌腸檢查等。目前主要的診斷方式為結(jié)腸鏡，CT仿真掃描，和病理學(xué)切片，這些方法存在 對受檢人群帶來創(chuàng)傷、受檢耐受性差及成本較高等問題。隨著研究的深入和相關(guān)檢查技術(shù) 的發(fā)展，血清中的某些生物標(biāo)志物，如蛋白、多肽、核酸等，不斷發(fā)掘出可作為結(jié)直腸癌早期 診斷的潛在標(biāo)志物。目前已報道的結(jié)直腸癌血清標(biāo)志物多為蛋白類，且逐漸暴露出一些弊 端，如CEA檢測試劑盒作為參考診斷試劑盒，敏感性約60%，特異性只有近20 %左右，并且 只對結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有參考價值，主要作為臨床觀察結(jié)直腸癌療效的指標(biāo)之一。因 此，開發(fā)特異性和靈敏度更高的血清標(biāo)志物及相關(guān)檢測產(chǎn)品，無疑具有積極的創(chuàng)新價值和 實(shí)用價值。
[0004] 近年來，生物標(biāo)志物聯(lián)檢在腫瘤的早期診斷中的應(yīng)用研究得到很大重視。目前，被 人們所認(rèn)可的生物標(biāo)志物多為血清蛋白標(biāo)志物，也有少量解離的多肽標(biāo)志物。如通過聯(lián)檢 甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、血清鐵蛋白（SF)等可顯著提高肝癌診斷的陽性率。但是， 蛋白標(biāo)志物普遍存在疾病敏感性不強(qiáng)的問題。而由于解離的多肽標(biāo)志物分子量小、抗原表 位少，免疫原性低，存在著檢測成本高、操作復(fù)雜的問題，難以單獨(dú)開發(fā)成高特異性的檢測 標(biāo)志物。值得注意的是，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，會直接影響到機(jī)體某些代謝功能的絮亂，從 而打破某些代謝通路中的蛋白和多肽的降解平衡，勢必影響到蛋白和多肽在血清、血漿、淋 巴液、尿液等體液中的存在形勢和含量關(guān)系等，由此，嘗試將多肽與其前體蛋白聯(lián)合起來， 建立一種全新的標(biāo)志物聯(lián)檢模式，或許可以成為獲取高特異性和高靈敏度腫瘤標(biāo)志物的突 破口。
[0005] 激酶通路已廣泛報道與腫瘤的代謝異常有密切關(guān)聯(lián)性。激酶通路中的高分子量激 肽原（High Molecular Weight Kininogen.縮寫為HWMK或HK)是血楽中的一種糖蛋白，分 子量120 kDa，其分子可劃分為6個結(jié)構(gòu)域，其中Dl、D2和D3組成分子的重鏈，D4含有緩 激肽肽段，D5和D6區(qū)組成分子的輕鏈。HK被激肽釋放酶活化，釋放D4區(qū)的緩激肽并產(chǎn)生 雙鏈高分子激肽原（HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。HK轉(zhuǎn)變?yōu)镠Ka后，發(fā) 生較大的構(gòu)像變化，使D5區(qū)暴露更加明顯，D5是HKa的活性中心，發(fā)揮HKa的主要作用，如 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移 等。目前，有研究報道HKa蛋白可用于腫瘤早期診斷。
[0006] 但是，目前對于新型的"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"仍鮮有研究，因此，研制一種能 夠用于多腫瘤檢測的組合式標(biāo)志物檢測試劑盒是十分必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白 組合式標(biāo)志物"檢測試劑盒，該試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)對結(jié)直腸癌患者血清中HKP09/HKP15-HKa的 靈敏和準(zhǔn)確檢測。
[0008] 蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同屬于激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)（Kallikrein- Kinin system，KKS)代謝通路。本發(fā)明通過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，多肽標(biāo)志物HKP15和HKP09由HKa 代謝產(chǎn)生。具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽標(biāo)志物位于HKa蛋白的D4區(qū)，具體位 于HKa蛋白的381?389位氨基酸，命名為HKP09。具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的 多肽標(biāo)志物位于HKa蛋白的D5區(qū)，具體位于497?511位氨基酸，命名為HKP15。HKP09和 HKP15即為HKa降解，多肽HKP09和HKP15以未完全解離的形式存在于HKa表面。采用多肽 及其前體蛋白兩種特異性抗體，對HKP15/HKP09-HKa標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測，或許可以更精 確的反映樣品中標(biāo)志物的表達(dá)情況，更加精確的區(qū)分腸癌樣品與正常人樣品。
[0009] 本發(fā)明提供的"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"的關(guān)鍵是前體蛋白結(jié)構(gòu)中的特定多肽 與對應(yīng)的游離型的特定多肽序列結(jié)構(gòu)完全一致、免疫特性一致，多肽自然存在于前體蛋白 表面，是前體蛋白的一個重要結(jié)構(gòu)域，多肽和蛋白互不干擾各自的免疫學(xué)特異性結(jié)合位點(diǎn)。 本發(fā)明提供的"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"首次將激酶降解的多肽HKP09及HKP15與其前 體蛋白HKa進(jìn)行優(yōu)化組合，在檢測時可同時分析緊密聯(lián)系的多肽和前體蛋白，而不是完全 孤立的去分析蛋白或者多肽。突破"混合式"或單一標(biāo)志物的局限，最終實(shí)現(xiàn)該新型標(biāo)志物 與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系。所述組合式標(biāo)志物不同于單一蛋白標(biāo)志物或者單一多肽標(biāo)志物， 也不能理解為單一多肽和蛋白的簡單混合。
[0010] 本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"檢測試劑盒，包括捕 獲抗體和檢測抗體；
[0011] 捕獲抗體與蛋白HKa特異性結(jié)合；
[0012] 檢測抗體與多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特異性結(jié)合；
[0013] 多肽HKP09的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0014] 多肽HKP15的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；
[0015] 蛋白HKa的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0016] 本發(fā)明中通過對比結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉和正常人血清差異譜，篩選出在結(jié)直腸 癌和結(jié)直腸息肉中異常表達(dá)的多肽標(biāo)志物HKP09和HKP15,再利用數(shù)據(jù)庫和免疫共沉淀技 術(shù)，查找出HKP09和HKP15的前體蛋白為HKa，并驗證出共同存在于激肽釋放酶一激肽系統(tǒng) (Kallikrein一Kinin system，KKS)代謝通路，該代謝通路與結(jié)直腸癌和結(jié)直腸息肉的發(fā)生 發(fā)展有著一定相關(guān)性。該組合式標(biāo)志物中的多肽HKP09和HKP15通過酰胺鍵或二硫鍵等化 學(xué)鍵形式存在于HKa表面，該組合式標(biāo)志物可作為結(jié)直腸癌檢測標(biāo)志物。
[0017] 作為優(yōu)選，捕獲抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0018] 優(yōu)選的，捕獲抗體為單克隆抗體。
[0019] 作為優(yōu)選，檢測抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0020] 優(yōu)選的，檢測抗體為單克隆抗體。
[0021] 作為優(yōu)選，捕獲抗體由保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆細(xì)胞株2G6分泌。
[0022] 作為優(yōu)選，檢測抗體由保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆細(xì)胞株3D11分泌。
[0023] 其中，捕獲抗體與蛋白HKa特異性結(jié)合；檢測抗體與多肽HKP09和HKP15特異性 結(jié)合；同時，捕獲抗體與檢測抗體的抗原結(jié)合表位不同，進(jìn)一步理解為捕獲抗體不與多肽 HKP09或多肽HKP15特異性結(jié)合。
[0024] 作為優(yōu)選，檢測抗體結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)。
[0025] 優(yōu)選的，標(biāo)記物質(zhì)為酶。
[0026] 更優(yōu)選的，酶為辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶ALP。
[0027] 最優(yōu)選的，檢測抗體上標(biāo)記HRP酶。
[0028] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的試劑盒還包括HKa標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鹽包被緩沖液、PBST洗 滌緩沖液、卵清蛋白封閉劑、底物液、硫酸終止液和96孔酶標(biāo)板。
[0029] 本發(fā)明提供的試劑盒中捕獲抗體可以為獨(dú)立分裝，也可包被于酶標(biāo)板，本發(fā)明對 此不作限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0030] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，HKa標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、 120ng/mL、150ng/mL〇
[0031] 底物液以酶催化顯色或發(fā)光，優(yōu)選的，底物液為0PD顯色液、TMB顯色液或NBT/ BCIP顯色液。
[0032] 更優(yōu)選的，底物液為TMB顯色液。
[0033] 優(yōu)選的，包被緩沖液為0. lmol/L，pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。
[0034] 優(yōu)選的，洗滌緩沖液為20mmol/L，pH7. 4的PBST緩沖液。
[0035] 優(yōu)選的，卵清蛋白封閉劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。
[0036] 優(yōu)選的，終止液為2mol/L的硫酸水溶液。
[0037] 本發(fā)明提供的檢測試劑盒在制備結(jié)直腸癌相關(guān)ELISA檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0038] 本發(fā)明還提供了試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0039] 步驟1 :以捕獲抗體捕獲待測樣品中的組合式標(biāo)志物中的蛋白HKa ;
[0040] 步驟2 :以檢測抗體檢測上述已捕獲的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15 ;
[0041] 步驟3 :根據(jù)檢測值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測樣品中"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"的 含量。
[0042] 本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線以HKa標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐 標(biāo)，以相應(yīng)濃度孔中的od 45(i值的平均值為縱坐標(biāo)。
[0043] 作為優(yōu)選，試劑盒中捕獲抗體由保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆細(xì)胞株2G6 分泌。
[0044] 作為優(yōu)選，試劑盒中檢測抗體由保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆細(xì)胞株3D11 分泌。
[0045] 作為優(yōu)選，試劑盒中的捕獲抗體包被于固相載體。
[0046] 優(yōu)選的，固相載體為酶標(biāo)板。
[0047] 作為優(yōu)選，試劑盒中的檢測抗體上含有標(biāo)記物質(zhì)。
[0048] 優(yōu)選的，標(biāo)記物質(zhì)為辣根過氧化物酶HRP。
[0049] 作為優(yōu)選，捕獲抗體的包被濃度為1000ng/mL。
[0050] 作為優(yōu)選，檢測抗體的檢測滴度為1 :2000。
[0051] 本發(fā)明提供的試劑盒可用于結(jié)直腸癌相關(guān)" HKP09/HKP15-HKa組合式標(biāo)志物" 的檢測，具體的，該檢測方法為雙抗體夾心檢測，采用本發(fā)明提供的試劑盒檢測"HKP09/ HKP15-HKa組合式標(biāo)志物"具有良好的準(zhǔn)確性和靈敏性。
[0052] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的雙抗體夾心ELISA試劑盒的具體使用方法包括以下步 驟：
[0053] 步驟1 :取試劑盒中包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板，分別加入0ng/mL、30ng/mL、60ng/ mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL的HKa標(biāo)準(zhǔn)品或以1:20稀釋的待測血清樣本，每孔 100 μ L。37°C靜置孵育1. 5小時；
[0054] 步驟2 :棄溶液，各孔用300 μ L PBST洗滌緩沖液清洗5次，拍干；
[0055] 步驟3 :各孔加入100 μ L經(jīng)HRP標(biāo)記的檢測抗體，37°C靜置孵育40分鐘；
[0056] 步驟4 :棄溶液，各孔用300 μ L PBST洗滌緩沖液清洗5次，拍干；
[0057] 步驟5 :各孔加入100 μ L與HRP相作用的ΤΜΒ底物顯色液，37°C避光顯色15分鐘；
[0058] 步驟6 :各孔加入50 μ L，2mol/L的硫酸終止液，用酶聯(lián)檢測儀測定0D45Q值；
[0059] 步驟7 :平行測量3次，以HKa標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度孔中的0D45Q值 的平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，將待測樣本的〇D 45(l值帶入線性方程，計算得 到樣本中的標(biāo)志物含量。
[0060] 本發(fā)明提供了 一種試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括捕獲抗體和檢測抗體；其中，捕 獲抗體與蛋白HKa特異性結(jié)合；檢測抗體與多肽HKP09、多肽HKP15或蛋白HKa均特異性結(jié) 合。采用本發(fā)明提供的試劑盒檢測結(jié)直腸癌相關(guān)的"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"具有良好的 準(zhǔn)確性和靈敏性。實(shí)驗表明，本發(fā)明所提供試劑盒的檢測范圍為6ng/mL?120ng/mL，最低 檢測限為1.7ng/mL，血清樣本的較優(yōu)檢測稀釋度為1:20。其中，檢測并統(tǒng)計得出108例正 常人血清中的"HKP15/HKP09-HKa組合式標(biāo)志物"的界定值（平均值+2SD)不高于28. 4ng/ mL，與臨床陰性符合率為95. 37%。此外，本發(fā)明通過比較32例臨床病理學(xué)確診的結(jié)直腸癌 血清樣本和108例正常人血清樣本，并結(jié)合R0C曲線統(tǒng)計表明，本發(fā)明提供的試劑盒檢測結(jié) 直腸癌和正常樣本的靈敏度為93. 7%，特異性為92. 7%。
[0061] 生物保藏說明
[0062] 保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞3D11于2014年07月02日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0063] 保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2G6于2014年07月02日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1示本發(fā)明提供試劑盒捕獲抗體與檢測抗體的檢測條件優(yōu)化；
[0065] 圖2示本發(fā)明提供試劑盒檢測HKa標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0066] 圖3示"HKP09/HKP15_HKa組合式標(biāo)志物"在結(jié)直腸癌患者和正常人血清樣品中的 含量差異；
[0067] 圖4示本發(fā)明提供的試劑盒檢測腸癌樣品的ROC曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0068] 本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"檢測試劑盒，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換 和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。 [0069] 本發(fā)明采用的試劑及材料皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0070] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0071] 實(shí)施例1 :捕獲抗體與檢測抗體的檢測條件優(yōu)化
[0072] 1)將捕獲抗體用包被緩沖液分別稀釋成50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/ mL、1000 ng/mL 和 2000 ng/mL，按照 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜。
[0073] 2)取試劑盒中包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板，各孔加入100ng/mL的HKa標(biāo)準(zhǔn)品，每孔 100 μ L。37°C靜置孵育1. 5小時；
[0074] 3)棄溶液，各孔用300 μ L PBST洗滌緩沖液清洗5次，拍干；
[0075] 4)用 PBST 將 HRP 標(biāo)記的檢測抗體分別按照 1:500、1:1000、1:2000、1:4000、 1:8000、1:16000、1:32000稀釋，每孔加入100 μ L，37°C靜置孵育40分鐘；
[0076] 5)棄溶液，各孔用300 μ L PBST洗滌緩沖液清洗5次，拍干；
[0077] 6)各孔加入100 μ L與HRP相作用的ΤΜΒ底物顯色液，37°C避光顯色15分鐘；
[0078] 7)各孔加入50 μ L，2mol/L的硫酸終止液，用酶聯(lián)檢測儀測定0D45Q值。
[0079] 以不同捕獲抗體的包被濃度為橫坐標(biāo)，以不同檢測抗體工作滴度所對應(yīng)的0045(|值 為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，以〇D 45(l值為1. 5處的明顯拐點(diǎn)所對應(yīng)的捕獲抗體濃度和檢測抗體 滴度為最佳的抗體工作條件。由圖1中的橢圓形虛線框所標(biāo)示處的拐點(diǎn)，可得捕獲抗體的 較優(yōu)包被濃度為l〇〇〇ng/mL，檢測抗體的較優(yōu)工作滴度為1 :2000。
[0080] 實(shí)施例2 :試劑盒的制備
[0081] 1、試劑的配制
[0082] 碳酸鹽包被緩沖液：ρΗ9· 6,0· lmol/L，稱取 Na2C03 L 59g，NaHC03 2. 93g 加去離子 水至 1000ml。
[0083] PBST 洗滌緩沖液：pH值為 7· 4,其中包括 80mmol/L 的 Na2HP04、20mmol/L 的 ΚΗ2Ρ04、 100mmol/L 的 KC1、1400mmol/L 的 NaCl、體積分?jǐn)?shù)為 0· 5% 的 Tween-20。
[0084] TMB顯色液：底物顯色A液：醋酸鈉13. 6g，檸檬酸1. 6g，30%雙氧水0. 3ml，蒸餾 水加至500ml ;底物顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0. 2g,朽1檬酸0. 95g,甘油50ml,取0. 15g TMB溶于3mlDMS0中，蒸餾水加至500mL。取底物顯色A液與底物顯色B液等體積混合，即 得TMB顯色液。
[0085] 硫酸終止液：配制濃度為2M的硫酸水溶液。
[0086] 2、捕獲抗體的包被
[0087] 取保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆雜交瘤細(xì)胞株2G6,經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生制得 與HKa特異性結(jié)合的單克隆抗體，用包被液稀釋至濃度為1000ng/mL。取lOOyL置于96 孔酶標(biāo)板板中，4°C放置過夜；棄包被液，用20mmol/L、pH7. 4的PBST緩沖液300 μ L清洗5 次，拍干；加入300 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的OVA封閉液，37°C靜置封閉2小時；棄OVA封閉液 用20mmol/L、pH7. 4 PBST緩沖液300 μ L清洗5次，拍干。
[0088] 3、檢測抗體的標(biāo)記
[0089] 取保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆雜交瘤細(xì)胞株3D11，經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生制得 能與多肽HKP15/HKP09特異性結(jié)合的單克隆抗體，在抗體上標(biāo)記HPR酶，以PBST緩沖液稀 釋，使最終檢測滴度為1:2000。
[0090] 4、分裝
[0091] 取PBST緩沖液、TMB顯色液、硫酸終止液、經(jīng)標(biāo)記的檢測抗體，包被有捕獲抗體的 酶標(biāo)板分別獨(dú)立包裝，即得。
[0092] 實(shí)施例3 :試劑盒最低檢測限及檢測范圍的鑒定
[0093] 取實(shí)施例2制得的試劑盒，配制梯度濃度的HKa標(biāo)準(zhǔn)品溶液為待測樣品，HKa標(biāo)準(zhǔn) 品的濃度為：0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。
[0094] 取試劑盒中包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板，分別加入不同濃度的HKa標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每 孔100 μ L，每一濃度重復(fù)3次。37°C靜置孵育1. 5小時；棄溶液，各孔用300 μ L試劑盒中 PBST緩沖液清洗5次，拍干；
[0095] 各孔加入100 μ L以HRP標(biāo)記的檢測抗體，37°C靜置孵育40分鐘；棄溶液，各孔用 300 μ L試劑盒中PBST緩沖液清洗5次，拍干；
[0096] 各孔加入100 μ L TMB顯色液，37°C避光顯色15分鐘；加入50 μ L 2mol/L硫酸溶 液，終止反應(yīng)；用酶聯(lián)檢測儀測定od45(i值。
[0097] 以HKa標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度孔中的0D45(I值的平均值為縱坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。該標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y = 0. 0146x+0. 0043, R2 = 0. 9993 〇
[0098] 如圖2所示，本發(fā)明提供的試劑盒的檢測范圍為6ng/mL?120ng/mL，最低檢測限 為 1. 7ng/mL,
[0099] 實(shí)施例4試劑盒的使用
[0100] 取實(shí)施例1制備的試劑盒，以腫瘤患者的血清為待測樣品，以正常人血清為陰性 對照樣品，說明本發(fā)明提供試劑盒的使用方法。
[0101] 實(shí)驗設(shè)計如表1所示：
[0102] 表1實(shí)驗設(shè)計
[0103]

【權(quán)利要求】
1. 一種結(jié)直腸癌相關(guān)"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"檢測試劑盒，其特征在于，包括捕獲 抗體和檢測抗體，所述捕獲抗體與蛋白HKa特異性結(jié)合；所述檢測抗體與多肽HKP15、多肽 HKP09或蛋白HKa均特異性結(jié)合； 所述多肽HKP09的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述多肽HKP15的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述蛋白HKa的全長氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體為單克隆抗體或多克隆 抗體；所述檢測抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體由保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆細(xì)胞株2G6分泌；所述檢測抗體由保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆 細(xì)胞株3D11分泌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括HKa標(biāo)準(zhǔn) 品、碳酸鹽包被緩沖液、PBST洗滌緩沖液、卵清蛋白封閉劑、底物液、硫酸終止液和96孔酶 標(biāo)板。
5. 如權(quán)利要求1?4任一項所述的試劑盒在制備結(jié)直腸癌相關(guān)ELISA檢測產(chǎn)品中的應(yīng) 用。
6. 權(quán)利要求1?4任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :以捕獲抗體捕獲待測樣品中的組合式標(biāo)志物中的蛋白HKa ; 步驟2 :以檢測抗體檢測所述捕獲的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15 ; 步驟3 :根據(jù)檢測值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測樣品中"多肽-蛋白組合式標(biāo)志物"的含 量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述捕獲抗體由保藏編號為CGMCC No. 9332的單克隆細(xì)胞株2G6分泌；所述檢測抗體由保藏編號為CGMCC No. 9331的單克隆 細(xì)胞株3D11分泌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的使用方法，其特征在于，所述試劑盒中的捕獲抗體包被于 固相載體；優(yōu)選的，固相載體為酶標(biāo)板。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的使用方法，其特征在于，所述試劑盒中的檢測抗體上含有 標(biāo)記物質(zhì)；優(yōu)選的，標(biāo)記物質(zhì)為辣根過氧化物酶HRP。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述捕獲抗體的包被濃度為 1000ng/mL ;所述檢測抗體的檢測滴度為1 :2000。
【文檔編號】G01N33/68GK104155457SQ201410418610
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】魏開華, 侯利平, 孫云波, 宋純艷, 楊保安, 周婷婷, 甄蓓, 劉曙晨, 鄭俊杰 申請人:北京蛋白質(zhì)組研究中心, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所