不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒，包含試劑R1和試劑R2；試劑R1含1～500mmol/LpH＝3.0～8.0的緩沖液、1～80KU/L谷氨酸脫氫酶、0.5～2KU/L?NADH、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、1‰～5‰表面活性劑和0.1～1g/L防腐劑；試劑R2含1～500mmol/L?pH＝3.0～8.0的緩沖液、1～60KU/L尿素酶、0.5～2KU/LNADH、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、10～500mmol/L氯化鈉、1～50mmol/L酶保護劑和0.1～1g/L防腐劑。本發(fā)明的試劑盒消除內(nèi)源性氨干擾，具有穩(wěn)定性佳，抗干擾能力強的特點。
【專利說明】不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]臨床上尿素(Urea)用于診斷腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎、前列腺腫大、尿路結(jié)石、尿道狹窄、膀胱腫瘤致使尿道受壓等。
[0003]尿素的測定方法包括:化學法、脲酶一波氏法等?；瘜W法又可分為:(I) 二乙酰一肟顯色法，原理為:尿素可與二乙酰作用，在強酸加熱條件下，生成粉紅色的二嗪化合物，在540nm比色，因二乙酰不穩(wěn)定，常用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。此法專一性差，線性范圍狹窄，且試劑中含有烈性化學物，易腐蝕儀器和污染環(huán)境。(2)鄰苯二甲醛比色法:尿素在強酸性環(huán)境下，與鄰苯二甲醛縮合產(chǎn)生橙紅色產(chǎn)物，比色測定之。(3) 二苯吡喃醇比濁法:尿素與二苯吡喃醇結(jié)合形成不溶性沉淀，比色測定之。采用化學法檢測尿素，特異性均不高，如瓜氨酸對二乙酰反應有正干擾；甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸及磺胺類藥物對鄰苯二甲醛反應有正干擾。加之要用強酸或強堿環(huán)境，或需要較高溫度(90°C)反應，較難實現(xiàn)自動化，故這類方法己經(jīng)較少使用。脲酶一波氏法:測定原理:首先用脲酶水解尿素，產(chǎn)生2分子氨和I分子二氧化碳。然后，氨在堿性介質(zhì)中與苯酚及次氯酸反應，生成藍色的吲哚酚，此過程需用亞硝基氰化鈉催化反應。藍色吲哚酚的生成量與尿素含量成正比，在630nm波長比色測定。此法的不足在于空氣中氨氣對試劑或玻璃器皿的污染或使用銨鹽抗凝劑可使結(jié)果偏高。高濃度氟化物可抑制尿素酶，引起結(jié)果假性偏低。脲酶-谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)法通過在同一條件下測定空白管、標準管和測定管在340nm處吸光度的下降速率，即可計算出樣品中尿素的含量。但是該方法受樣本內(nèi)源性氨的干擾嚴重，試劑穩(wěn)定性差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有試劑盒存在的缺陷，提供一種不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒。用本發(fā)明的測試試劑盒來檢測血清中的Urea含量，可達到操作簡便、穩(wěn)定性佳、抗干擾能力強，快速、測定結(jié)果準確可靠的目的。
[0005]本發(fā)明測定Urea含量的原理為:尿素在尿素酶(Urease)的催化下，水解生成氨和二氧化碳，氨在α -酮戊二酸和還原型輔酶I (NADH)存在下，經(jīng)谷氨酸脫氫酶(GLDH)催化，生成谷氨酸，同時NADH被氧化成NAD+，引起340nm波長處吸光度的下降；吸光度的下降與血清中尿素的濃度成正比，通過監(jiān)測340nm波長處吸光度的變化，可測定血清中尿素的濃度。
[0006]特別的，本發(fā)明在Rl試劑中加入了谷氨酸脫氫酶和NADH，消除內(nèi)源性氨的干擾，以提聞試劑的抗干擾能力。
[0007]即在沒有加入R2之前，樣本中的內(nèi)源性氨先和試劑Rl進行反應，用來消除內(nèi)源性氨的干擾，反應方程式為:
[0008]

【權(quán)利要求】
1.一種不受血清內(nèi)源性氨干擾的測定尿素含量的檢測試劑盒，其特征在于，包含試劑Rl和試劑R2 ;所述試劑Rl含有I?500mmol/L pH = 3.0?8.0的緩沖液、I?80KU/L谷氨酸脫氫酶、0.5?2KU/L NADH、I?100mmol/L α -酮戊二酸、1%。?5%。表面活性劑和0.1?lg/L防腐劑；所述試劑R2含有I?500mmol/L pH = 3.0?8.0的緩沖液、I?60KU/L尿素酶、0.5 ?2KU/L NADH、1 ?100mmol/L α -酮戊二酸、10 ?500mmol/L 氯化鈉、I ?50mmol/L酶保護劑和0.1?lg/L防腐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl含有100?300mmol/LpH = 5.0?8.0的緩沖液、20?60KU/L谷氨酸脫氫酶、I?1.5KU/L NADH、50?10mmol/La-酮戊二酸、1%。?5 %。表面活性劑和0.2?0.8g/L防腐劑；所述試劑R2含有100?300mmol/L pH = 5.0 ?8.0 的緩沖液、10 ?30KU/L 尿素酶、I ?1.5KU/L NADH、50 ?100mmol/La -酮戊二酸、100 ?300mmol/L 氯化鈉、10 ?40mmol/L 酶保護劑和 0.2 ?0.8g/L防腐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液分別選自 TRIS、MOPS、HEPES 或 BICN。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的緩沖液均為TRIS。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述酶保護劑為二甲基亞砜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫80或曲拉通X-100。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl、R2中包含的防腐劑分別選自疊氮化鈉、proclin300、聚賴氨酸或乙酸鈉。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項所述的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，試劑Rl加入樣本后37°C孵育5分鐘，再加入試劑R2，37°C孵育1.5分鐘，連續(xù)監(jiān)測3分鐘的吸光度變化率，與Urea標準品的尿素含量與吸光度關(guān)系曲線進行比較，得到樣本的尿素含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述監(jiān)測采用的主波長為340nm,副波長為405nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述試劑Rl和試劑R2的體積比為4: I。
【文檔編號】G01N21/33GK104198421SQ201410401509
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】李偉奇, 陳瑛, 房君江, 張秀文, 林清玉 申請人:上海睿康生物科技有限公司